本發(fā)明屬于體外受精，特別是涉及用于增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物及方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、體外受精已經(jīng)廣泛應(yīng)用于提高優(yōu)質(zhì)種畜快速擴(kuò)繁和人類輔助生殖領(lǐng)域。然而，體外受精獲得的胚胎移植后妊娠率遠(yuǎn)低于體內(nèi)受精胚胎的妊娠率，說明體外胚胎發(fā)育潛能低于體內(nèi)胚胎。體外胚胎的發(fā)育潛能是決定體外胚胎移植成功的關(guān)鍵，也是一直以來體外胚胎技術(shù)的難點(diǎn)。胚胎發(fā)育潛能與第一次細(xì)胞分化（即分化為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(icm)和滋養(yǎng)層(te)）密切相關(guān)。由于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞將分別發(fā)育為胎兒和胎盤，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目及占比是評(píng)估囊胚發(fā)育潛能的重要指標(biāo)。已有報(bào)道指出體外的培養(yǎng)環(huán)境影響內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目及占比，小鼠和牛體外受精后的囊胚icm/te比例比體內(nèi)囊胚低14%-23%，也是決定體外胚胎發(fā)育潛能低的重要因素。

2、近年來，研究人員建立了家畜囊胚體外延時(shí)培養(yǎng)體系，用來評(píng)估體外受精胚胎的后續(xù)發(fā)育潛能。囊胚體外延時(shí)培養(yǎng)體系相較于用胚胎移植來判定胚胎發(fā)育潛能的方法，大幅節(jié)約時(shí)間和資金成本；此外，囊胚體外延時(shí)培養(yǎng)體系也可作為研究胚胎附植前后發(fā)育機(jī)制的模型，該體系可快速、高通量評(píng)估體外受精胚胎發(fā)育潛能的高低。有研究顯示，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目及占比，與囊胚體外延時(shí)培養(yǎng)存活率、囊胚直徑密切相關(guān)。

3、為提高體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)目及占比，現(xiàn)有技術(shù)主要利用附植前的胚胎或者輸卵管分泌因子的添加來調(diào)節(jié)體外胚胎的發(fā)育。例如，bmp，屬于tgf-β超家族，可促進(jìn)囊胚形成，bmp信號(hào)通過調(diào)控多能性和譜系特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)icm增殖并抑制te分化；egf是一種生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，體外胚胎培養(yǎng)時(shí)添加egf可提高囊胚率。盡管近年來，人們?cè)谔砑臃置谝蜃痈纳企w外胚胎發(fā)育方面取得了一定的進(jìn)展，但是增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目及占比的效果有限。因此，亟待建立更加有效的方法以提高體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目及占比，以進(jìn)一步提升體外胚胎技術(shù)水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的至少部分技術(shù)問題，本發(fā)明通過在早期胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液中添加葉酸和疏花丁素b中一種或兩種調(diào)節(jié)劑，顯著提高囊胚率、提高囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)的占比、提高囊胚延時(shí)培養(yǎng)的存活率和囊胚直徑并有效提高體外胚胎發(fā)育潛能。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

2、本發(fā)明的第一方面，提供一種增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其包括選自葉酸和疏花丁素b中的一種或者兩種的調(diào)節(jié)劑。

3、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其中，所述組合物包含(a)-(c)中的任意一種：

4、(a)?葉酸；

5、(b)?疏花丁素b；

6、(c)?葉酸和疏花丁素b，且所述葉酸與疏花丁素b的濃度比為(0.001-100)：1。

7、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其中，所述葉酸的量能夠使葉酸在體外培養(yǎng)時(shí)的工作濃度達(dá)到0.01-10?μm；所述疏花丁素b的量能夠使疏花丁素b在體外培養(yǎng)時(shí)的工作濃度達(dá)到0.1-10?μm。

8、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其中，所述體外胚胎來源為哺乳動(dòng)物體外受精胚胎。

9、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞占比的組合物，其中，進(jìn)一步包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

10、本發(fā)明的第二方面，提供一種增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞占比的方法，其包括在體外使胚胎與根據(jù)本發(fā)明所述的組合物接觸的步驟。

11、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)及占比的方法，其中，所述增加包括提高囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)占比。

12、本發(fā)明的第三方面，提供一種改善體外受精胚胎發(fā)育的方法，其包括在體外使胚胎與根據(jù)本發(fā)明所述的組合物接觸的步驟。

13、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的改善體外受精胚胎發(fā)育的方法，其中，所述改善包括提高卵裂率、提高囊胚發(fā)育率。

14、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的改善體外受精胚胎發(fā)育的方法，其中，所述改善進(jìn)一步包括提高囊胚體外延時(shí)培養(yǎng)的存活率和囊胚直徑。

15、本發(fā)明的第四方面，提供根據(jù)本發(fā)明所述的組合物，或本發(fā)明所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞占比的方法，或本發(fā)明所述的改善體外受精胚胎發(fā)育的方法在動(dòng)物遺傳改良、良種擴(kuò)繁、體外胚胎生產(chǎn)或輔助生殖中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明針對(duì)體外受精胚胎在早期發(fā)育過程中囊胚階段內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)少、囊胚率低、后續(xù)胚胎發(fā)育潛能低等問題，通過在早期胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液中添加葉酸和疏花丁素b中的一種或兩種調(diào)節(jié)劑，顯著提高了囊胚率、提高了囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)占比、提高了囊胚延時(shí)培養(yǎng)的存活率和囊胚直徑并有效提高了體外胚胎發(fā)育潛能。此外，本發(fā)明有效地提高體外受精胚胎可用于后續(xù)胚胎移植的比率，且成本低、安全、高效，為家畜體外胚胎生產(chǎn)和輔助生殖技術(shù)的發(fā)展提供了新的策略，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其特征在于，包括選自葉酸和疏花丁素b中的一種或者兩種的調(diào)節(jié)劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其特征在于，所述組合物包含(a)-(c)中的任意一種：

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其特征在于，所述葉酸的量能夠使葉酸在體外培養(yǎng)時(shí)的工作濃度達(dá)到0.01-10?μm；所述疏花丁素b的量能夠使疏花丁素b在體外培養(yǎng)時(shí)的工作濃度達(dá)到0.1-10?μm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其特征在于，所述體外胚胎來源為哺乳動(dòng)物體外受精胚胎。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物，其特征在于，進(jìn)一步包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

6.一種增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的方法，其特征在于，包括在體外使胚胎與根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的組合物接觸的步驟。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的方法，其特征在于，所述增加包括提高囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)占比。

8.一種改善體外受精胚胎發(fā)育的方法，其特征在于，包括在體外使胚胎與根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的組合物接觸的步驟。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的改善體外受精胚胎發(fā)育的方法，其特征在于，所述改善包括提高卵裂率、提高囊胚發(fā)育率。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的改善體外受精胚胎發(fā)育的方法，其特征在于，所述改善包括提高囊胚體外延時(shí)培養(yǎng)的存活率和/或囊胚直徑。

11.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的組合物，或權(quán)利要求6或7所述的增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的方法，或權(quán)利要求8或9或10所述的改善體外受精胚胎發(fā)育的方法在動(dòng)物遺傳改良、良種擴(kuò)繁、體外胚胎生產(chǎn)或輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開用于增加體外胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞占比的組合物及方法和應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)體外受精胚胎在早期發(fā)育過程中囊胚率低、囊胚階段內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)少、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞占比低、后續(xù)胚胎發(fā)育潛能低等問題，通過在早期胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液中添加葉酸和疏花丁素B中的一種或兩種調(diào)節(jié)劑，顯著提高囊胚率、囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)占比以及囊胚延時(shí)培養(yǎng)的存活率和囊胚直徑，并有效提高體外胚胎發(fā)育潛能。此外，本發(fā)明還有效提高體外受精胚胎可后續(xù)進(jìn)行胚胎移植的胚胎比率，成本低、安全、高效，為家畜體外胚胎生產(chǎn)和輔助生殖技術(shù)的發(fā)展提供新的策略，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：田見暉,王銀娟,魏翊,安磊,王書敏,初美強(qiáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5