本發(fā)明屬于現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，具體涉及一種一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、由棕櫚疫霉菌（ phytophthora?palmivora）侵染引起的榴蓮根腐病是我國及泰國、緬甸、越南和馬來西亞等榴蓮產(chǎn)地發(fā)生最嚴重的病害，制約榴蓮產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展。該病原菌寄主范圍廣泛，并能在榴蓮植物的不同部位引起疾病。病原菌的田間快速檢測是有效預(yù)防病害發(fā)生的關(guān)鍵手段，當(dāng)前對于引起榴蓮根腐病的棕櫚疫霉菌的診斷主要通過癥狀觀察、病原菌分離鑒定和基于pcr的常規(guī)方法。這些方法耗時長且容易導(dǎo)致延遲診斷；對于緩慢生長的病原菌可能漏檢；存在交叉反應(yīng)和假陽性問題。此外，傳統(tǒng)技術(shù)通常需要專業(yè)人員操作，且對設(shè)備設(shè)施要求較高，增加了成本和復(fù)雜性。因此，亟需探索和發(fā)展更快速、準(zhǔn)確、簡便的棕櫚疫霉菌檢測方法。

2、目前，傳統(tǒng)的植物病害鑒定方法包括病原菌的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定，同時進行病原菌的致病性驗證，最終結(jié)合分類資料確定病原菌的分類和地位。這種方法雖然是病原菌鑒定的基礎(chǔ)，但易受操作者技能和經(jīng)驗、人為因素以及環(huán)境影響，耗時且無法滿足快速檢測的需求。

3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase?chain?reaction，pcr）于1983年由mullis提出，這種方法迅速促進了許多科學(xué)領(lǐng)域和診斷學(xué)領(lǐng)域的重大進展。該方法是在受控條件下反復(fù)加熱和冷卻樣品，通過耐熱性dna聚合酶擴增dna。在此基礎(chǔ)上形成了實時熒光定量pcr等一些列新方法，由于其良好的特異性和可操作性而在病原菌的鑒定及檢測中發(fā)揮重要作用。但基于pcr的技術(shù)對高精度熱循環(huán)器的要求使得這種強大的方法無法被廣泛應(yīng)用于田間現(xiàn)場檢測。

4、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated?isthermal?amplification，lamp）由notomi及其同事于2000年開發(fā)，該方法依賴于具有高鏈置換活性的dna聚合酶和一套特殊設(shè)計的兩個內(nèi)部和兩個外引物進行的自動循環(huán)鏈置換dna合成，允許在1小時內(nèi)快速準(zhǔn)確地對病原物進行診斷。由于其只需常規(guī)的水浴鍋等設(shè)備，且操作簡單、快速、靈敏而在細菌、真菌、病毒等病原物的檢測中廣泛應(yīng)用。

5、綜上所述，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多分子檢測相關(guān)技術(shù)被挖掘、優(yōu)化并應(yīng)用到病原物的檢測當(dāng)中，但他們也同樣存在著自身的局限性。病原菌分離鑒定的傳統(tǒng)方法通常耗時且繁瑣，需要復(fù)雜的培養(yǎng)條件和設(shè)備。此外，傳統(tǒng)方法在某些情況下可能出現(xiàn)誤判，導(dǎo)致結(jié)果不夠準(zhǔn)確和可靠。pcr技術(shù)雖然應(yīng)用范圍較廣，但其對溫控設(shè)備的依賴程度高，操作耗時長，專業(yè)性強，難以應(yīng)用于現(xiàn)場檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（lamp）靈敏度高、特異性強，但其引物設(shè)計及試劑添加繁瑣、操作復(fù)雜，所需溫度較高，易導(dǎo)致非特異性擴增等特點而影響檢測結(jié)果。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明第一方面的目的，在于提供一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑。

2、本發(fā)明第二方面的目的，在于提供一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑盒。

3、本發(fā)明第三方面的目的，在于提供一種應(yīng)用。

4、本發(fā)明第四方面的目的，在于提供一種基于rpa結(jié)合crispr/cas12a的榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測方法。

5、為了實現(xiàn)本發(fā)明上述的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

6、本發(fā)明的第一個方面，提供一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑，所述試劑包括檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌基因組的引物對和/或檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的crrna；

7、所述引物對為rpa-f/rpa-r，核苷酸序列如下：

8、rpa-f：5’-ccagagggtacaaacgaaatcggcgctacg-3’；

9、rpa-r：5’-cctaccggtatgcctcgtgatcattgg-3’；

10、所述crrna包括crrna1和crrna2，核苷酸序列分別如seq?id?no:4和seq?id?no:5所示。

11、在本發(fā)明的第一個方面中，所述引物對基于棕櫚疫霉菌特異序列>nckw01006925進行設(shè)計。

12、本發(fā)明的第二個方面，提供一種檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的試劑盒，包含本發(fā)明第一個方面所述的試劑。

13、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述試劑盒還包括ssdna熒光探針和cas蛋白。

14、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述cas蛋白選自mb4cas12a、fncas12a、lbcas12a或dlbcas12a中的至少一種。

15、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述ssdna熒光探針的兩端分別修飾熒光基團和淬滅基團。

16、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述熒光基團選自fam、cy5、htx、rox、vic、tamra和hex中的任一種。

17、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述淬滅基團選自bhq1、bhq2和bhq3中的任一種。

18、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述試劑盒中還包括rpa反應(yīng)液和crispr/cas12a緩沖液。

19、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述crispr/cas12a緩沖液為10?×nebuffertmr2.1。

20、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。

21、本發(fā)明的第三個方面，提供本發(fā)明第一個方面所述試劑、和/或本發(fā)明第二個方面所述試劑盒在1）~2）中任一項所述的應(yīng)用：

22、1）榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測；

23、2）制備檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的產(chǎn)品。

24、本發(fā)明的第四個方面，提供一種基于rpa結(jié)合crispr/cas12a的榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測方法，包括采用本發(fā)明第一方面的試劑和/或本發(fā)明第二方面的試劑盒的步驟。

25、在本發(fā)明一些實施方式中，所述檢測方法具體包括以下步驟：

26、（1）提取待測樣本的核酸；

27、（2）將引物對與步驟（1）中的核酸混合，進行rpa擴增，得到rpa擴增產(chǎn)物；

28、（3）將步驟（2）所述的rpa擴增產(chǎn)物與crrna、cas蛋白、ssdna熒光探針混合，進行crispr反應(yīng)，讀取檢測信號；

29、（4）根據(jù)檢測信號判定待測樣本是否含有榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌。

30、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述rpa擴增條件為37～42℃，反應(yīng)5～30分鐘。

31、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述crrna和cas12a的濃度均為200～1000?nm。

32、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述ssdna熒光探針的濃度為1～100?μm。

33、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述crrna1和crrna2的摩爾比例為（1~3）：（1~3）。

34、在本項發(fā)明實施過程中，所述檢測方法步驟如下：

35、（1）將rpa反應(yīng)體系和待檢樣本基因組dna混勻后放入反應(yīng)管底部，crispr/cas12a反應(yīng)體系混勻后放入所述反應(yīng)管蓋中，然后將所述管底置于恒溫擴增裝置中進行目的片段的rpa擴增；所述目的片段包括如seq?id?no:1所示的核苷酸序列。

36、（2）所述rpa擴增結(jié)束后，將所述反應(yīng)管蓋中的crispr/cas12a體系加入反應(yīng)管中，混勻。

37、（3）可視化檢測步驟（2）中反應(yīng)液的熒光強度。

38、若所述反應(yīng)管發(fā)出熒光，表明所述待檢樣本中存在榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌；若所述反應(yīng)管中未發(fā)出熒光，表明所述待檢樣本中不存在榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌。

39、在本項發(fā)明實施過程中，可視化檢測（2）中反應(yīng)管熒光強度包括：

40、將反應(yīng)管置于38℃恒溫裝置中進行rpa反應(yīng)15分鐘，然后將管蓋上的crispr/cas12a反應(yīng)液離心至管底繼續(xù)反應(yīng)20分鐘，期間每間隔30秒采集一次fam熒光；或者在38℃恒溫裝置中反應(yīng)20分鐘后，肉眼觀察反應(yīng)管在藍光照射下是否出現(xiàn)熒光。

41、本發(fā)明開發(fā)了一種榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的快速可視化檢測試劑和試劑盒，具有如下有益效果：

42、（1）本項發(fā)明是通過對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌、大豆疫霉菌、致病疫霉菌等病原卵菌和稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌等病原真菌的全基因組序列進行系統(tǒng)比對和篩選獲得榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌特異序列>nckw01006925，且該序列尚屬于未知功能的區(qū)域，迄今為止未在檢測技術(shù)及相關(guān)文獻中得到應(yīng)用。該序列的發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)了對于榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的特異性檢測。

43、（2）本項發(fā)明利用棕櫚疫霉菌特異序列>nckw01006925設(shè)計并篩選crispr/cas12a系統(tǒng)的crrna，并根據(jù)該crrna的結(jié)合位點設(shè)計并篩選特異性rpa引物，以實現(xiàn)rpa特異性靶基因擴增及棕櫚疫霉菌的特異性檢測。

44、（3）本項發(fā)明創(chuàng)新性利用兩條crrna序列進行檢測，其檢測靈敏度比一條crrna高一個數(shù)量級，大大提高檢測的靈敏性及準(zhǔn)確率。

45、（4）本項發(fā)明的試劑用于檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌，其中包含引物對和crrna。該引物對可用于rpa等溫擴增技術(shù)，以便準(zhǔn)確、快速且特異地對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌進行檢測；crrna可與榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌特異片段形成互補雙鏈而不會與其他卵菌、疫霉菌及真菌序列發(fā)生交叉反應(yīng)，從而提高了對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測特異性。

46、本項發(fā)明將rpa系統(tǒng)與crispr/cas12a系統(tǒng)相結(jié)合，創(chuàng)立了一種能快速且可視化檢測棕櫚疫霉菌的方法。具體來說，該方法通過基因組序列比對獲得了榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌特異片段，以此片段設(shè)計并篩選了crispr/cas12a系統(tǒng)的crrna探針及rpa引物，從而實現(xiàn)rpa對靶基因的特異性擴增。此外，本發(fā)明利用crispr/cas12a系統(tǒng)對報告基因進行切割，以此建立適用于榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的快速檢測方法。該方法經(jīng)過rpa和crispr/cas12a體系的優(yōu)化，對檢測方法的靈敏性和特異性均進行了評估。結(jié)果顯示：該方法對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的檢測可在30分鐘內(nèi)完成，具有良好特異性且無交叉反應(yīng)，靈敏度達到10?fg/μl。該方法基于crispr/cas12a所具有的反式切割活性，針對榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的特異片段進行快速、靈敏且特異的檢測，無需昂貴或大型儀器設(shè)備，采用簡單、便攜的可視化閉管檢測方法，適用于現(xiàn)場和田間樣本的快速檢測。

47、（5）該方法將crrna與目的序列的特異識別和rpa的特異性擴增相結(jié)合，增強了crispr/cas12a技術(shù)檢測的靈敏性和特異性。在38℃條件下進行檢測，適用于實驗室或現(xiàn)場沒有pcr儀器設(shè)備的情況，同時可以利用藍光照射并肉眼觀察檢測結(jié)果。

48、綜合而言，基于rpa-crispr/cas12a熒光檢測榴蓮根腐病棕櫚疫霉菌的方法比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法具有更高的靈敏度，并且檢測時間大大縮短，30分鐘內(nèi)即可完成檢測。這種方法操作簡便、快捷、靈敏且具有很強的特異性，全程在38℃環(huán)境下進行，對儀器設(shè)備要求不高，適合廣泛在海關(guān)口岸現(xiàn)場檢測中應(yīng)用，具有良好的前景。