本發(fā)明涉及基因檢測(cè)，更具體地說(shuō)，它涉及一種檢測(cè)mthfr基因多態(tài)性的試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、mthfr（5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶）基因是人體內(nèi)的一個(gè)重要基因，位于1號(hào)染色體1p36.3位置，其編碼的酶在葉酸代謝和dna甲基化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用；c677t（rs1801133）位點(diǎn)是臨床上研究最多的mthfr單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其多態(tài)性會(huì)影響mthfr酶的活性，進(jìn)而影響葉酸代謝和同型半胱氨酸水平。

2、既往研究表明mthfr-c677t突變?cè)谌蚍秶鷥?nèi)廣泛存在，不同人種和地區(qū)的攜帶率有所不同，歐洲和亞洲人群中c677t突變較為常見；中國(guó)漢族人群中，mthfr-c677t位點(diǎn)的基因型分布為：正常型（cc）占多數(shù)，雜合突變型（ct）次之，純合突變型（tt）相對(duì)較少，但具體比例可能因研究樣本和地區(qū)差異而有所不同。

3、近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，pcr擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用廣泛，該技術(shù)靈敏度高，特異性好，具有良好的臨床應(yīng)用前景，尤其在基因多態(tài)性檢測(cè)方面具有優(yōu)勢(shì)；mthfr基因多態(tài)性常用的檢測(cè)方法有：pcr-基因芯片法、pcr-熒光探針?lè)?、pcr-熔解曲線法和pcr-電泳分析法；我國(guó)已有多個(gè)mthfr基因多態(tài)性檢測(cè)試劑獲得批準(zhǔn)上市，部分產(chǎn)品還處于在審狀態(tài)；目前已批準(zhǔn)產(chǎn)品的方法學(xué)以pcr-熒光探針?lè)橹鳌?/p>

4、隨著分子生物學(xué)技術(shù)得快速發(fā)展，目前已有多種方法用于snp檢測(cè)；比如pcr-基因芯片法、pcr-熒光探針?lè)?、pcr-熔解曲線法和pcr-電泳分析法，這些方法中其中pcr-熒光探針?lè)ㄊ悄壳笆忻嫔献畛Ｓ玫臋z測(cè)方法，但是大多需要提取dna，然后通過(guò)pcr擴(kuò)增后進(jìn)行基因分型，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)效性和成本相應(yīng)提高；目前暫無(wú)針對(duì)snp分型檢測(cè)的快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的全分型基因檢測(cè)試劑盒；而且大部分試劑盒樣本類型是人類外周血dna，導(dǎo)致樣本存在一定的采集難度；鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法或缺乏便捷性、時(shí)效性、經(jīng)濟(jì)性或無(wú)法滿足snp基因分型檢測(cè)要求的現(xiàn)狀，亟需一款能運(yùn)用于基層檢測(cè)甚至居家檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)且覆蓋全面的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)mthfr基因多態(tài)性的試劑盒，不僅具有快速便捷的技術(shù)效果，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種檢測(cè)mthfr基因多態(tài)性的試劑盒，包括：

3、組分1：用于檢測(cè)mthfr基因c677t位點(diǎn)基因多態(tài)性的引物和探針；

4、組分2：用于檢測(cè)內(nèi)參β-globin的引物和探針；

5、其特征在于：所述組分1包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的c677t上游引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.2所示的c677t下游引物；

6、c677t探針1序列5'端標(biāo)記有fam熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有mgb淬滅熒光基團(tuán)，c677t探針1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

7、c677t探針2序列5'端標(biāo)記有vic熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有mgb淬滅熒光基團(tuán)，c677t探針2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

8、組分2包括核苷酸序列如seq?id?no.5所示的β-globin上游引物，以及核苷酸序列如seq?id?no.6所示的β-globin下游引物；

9、β-globin探針序列5'端標(biāo)記有rox熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有mgb淬滅熒光基團(tuán)，β-globin探針的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

10、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，試劑盒所運(yùn)用的引物和探針組合，能夠采用的拭子直擴(kuò)結(jié)合熒光pcr法，完成mthfr-c677t位點(diǎn)的cc基因型、ct基因型以及tt基因型的三種基因分型的檢測(cè)，不僅具有快速便捷的技術(shù)效果，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確；同時(shí)該試劑盒設(shè)計(jì)了引物與雙探針組合的檢測(cè)方法，其中含有內(nèi)參β-globin的檢測(cè)引物和探針，以此對(duì)樣本采集、樣本的處理和pcr檢測(cè)進(jìn)行有效質(zhì)控，進(jìn)一步提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

11、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：還包括擴(kuò)增酶，所述擴(kuò)增酶用于擴(kuò)增口腔拭子內(nèi)核酸，并參與熒光pcr反應(yīng)程序。

12、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：擴(kuò)增所述c677t上游引物和c677t下游引物的終濃度為0.4μmol/l；檢測(cè)所述c677t探針1和c677t探針2的終濃度為0.1μmol/l。

13、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：擴(kuò)增所述β-globin上游引物和β-globin下游引物的終濃度為0.2μmol/l，檢測(cè)所述β-globin探針的終濃度為0.05μmol/l。

14、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：試劑盒內(nèi)液體試劑通過(guò)凍干程序經(jīng)原位凍干制成試劑凍干粉末。

15、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：還包括陽(yáng)性對(duì)照品a1管以及空白對(duì)照品b1管；

16、所述陽(yáng)性對(duì)照品是mthfr基因c677t位點(diǎn)雜合天然細(xì)胞系；空白對(duì)照品為無(wú)酶水；

17、所述陽(yáng)性對(duì)照品a1管內(nèi)液體試劑通過(guò)凍干程序經(jīng)原位凍干制成相應(yīng)的質(zhì)控品陽(yáng)性對(duì)照粉末；

18、所述空白對(duì)照品b1管內(nèi)液體通過(guò)凍干程序經(jīng)原位凍干制成相應(yīng)的質(zhì)控品空白對(duì)照粉末。

19、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)mthfr基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法，切實(shí)滿足了基層檢測(cè)的運(yùn)用需求。

20、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種檢測(cè)mthfr基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法，其特征在于：包括如下步驟：

21、s1.獲取待測(cè)口腔拭子樣本，置于樣本處理液內(nèi)，使得口腔粘膜細(xì)胞釋放核酸，制成拭子液作為擴(kuò)增模板；

22、s2.將配置好的組分1、組分2以及dna聚合酶mix充分混勻，將液體試劑通過(guò)凍干程序經(jīng)原位凍干制成多份試劑凍干粉末；

23、s4.將s1制得的擴(kuò)增模板，取25μl直接投入到s2所配置的一份試劑凍干粉末中進(jìn)行溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)ct值進(jìn)行結(jié)果判斷。

24、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，在具備快速、便捷、準(zhǔn)確、可靠的前提下，通過(guò)對(duì)試劑進(jìn)行凍干處理，有效降低了試劑的倉(cāng)儲(chǔ)運(yùn)輸難度，切實(shí)滿足了基層檢測(cè)的運(yùn)用需求。

25、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：所述擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性2分鐘，1次循環(huán)；95℃變性10秒，60℃退火20秒，交替40次循環(huán)。

26、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)mthfr基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)試劑自身質(zhì)量的檢測(cè)，以及對(duì)試劑是否遭受污染進(jìn)行了檢測(cè)，從而確保試劑的實(shí)際檢測(cè)效力。

27、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種檢測(cè)mthfr基因多態(tài)性的試劑盒的質(zhì)控方法，其特征在于：包括以下步驟：

28、s2.將配置好的組分1、組分2以及dna聚合酶mix充分混勻，將液體試劑通過(guò)凍干程序經(jīng)原位凍干制成多份試劑凍干粉末；

29、s3.用25μl無(wú)酶水對(duì)質(zhì)控品陽(yáng)性對(duì)照粉末進(jìn)行溶解，再取用一份s2中所配置的試劑凍干粉末進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管，標(biāo)記為b1管，并進(jìn)行擴(kuò)增；用25μl無(wú)酶水對(duì)質(zhì)控品空白對(duì)照粉末進(jìn)行溶解，再取用一份s2中所配置的試劑凍干粉末進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管，標(biāo)記為b2管，并進(jìn)行擴(kuò)增；通過(guò)ct值判斷質(zhì)控結(jié)果。

30、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)了對(duì)試劑自身質(zhì)量的檢測(cè)，以及對(duì)試劑是否遭受污染進(jìn)行了檢測(cè)，從而確保試劑的實(shí)際檢測(cè)效力。

31、本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：所述質(zhì)控結(jié)果判斷：s3中配置的b1管標(biāo)記為陽(yáng)性對(duì)照管，于fam、vic和rox三個(gè)通道呈典型的s型曲線且ct（fam）≤37、ct（vic）≤37、ct（rox）≤37則認(rèn)為試劑合格；b2管標(biāo)記為空白對(duì)照管，四個(gè)通道均無(wú)ct值則認(rèn)為試劑無(wú)污染，試劑結(jié)果可信。

32、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：1、準(zhǔn)確：本發(fā)明采用的拭子直擴(kuò)結(jié)合熒光pcr法完成的60例樣本與sanger測(cè)序完成的60例樣本經(jīng)過(guò)比對(duì)，結(jié)果完全一致；

33、2、省時(shí)：本發(fā)明從樣本采集到出具結(jié)果最短僅需40min，熒光pcr法約3h，sanger測(cè)序約9h，相比之下，本發(fā)明可節(jié)省大量時(shí)間；

34、3、降低成本：本發(fā)明省略了dna提取的步驟，在節(jié)省時(shí)間的同時(shí)也降低了相應(yīng)的成本。同時(shí)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速準(zhǔn)確，節(jié)省大量人力成本。