專利名稱:雙基因共表達(dá)質(zhì)粒、構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體的說(shuō)是基因間共表達(dá)調(diào)控序列、DNA重組和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞等基因工程學(xué)，以及通過(guò)基因工程學(xué)方法重組的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的用途。
7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是半合成頭孢類抗生素的母核，在臨床醫(yī)藥的生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。使用生物轉(zhuǎn)化法取代傳統(tǒng)的化學(xué)法裂解頭孢菌素C(cephalosporin C，CPC)生產(chǎn)7-ACA的工藝路線，由于具有反應(yīng)條件溫和，不接觸有毒有害化學(xué)藥品和溶劑，無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，其研究一直受到產(chǎn)業(yè)界與學(xué)術(shù)界的共同重視。生物轉(zhuǎn)化CPC生成7-ACA的過(guò)程，分為一步酶法與兩步酶法兩種(見
圖1)，其中一步酶法，即用CPC?；复呋疌PC脫去7-位的D-α-氨基己二酰側(cè)鏈，直接生成產(chǎn)物7-ACA的方法，步驟簡(jiǎn)單，可使反應(yīng)一步完成，是生產(chǎn)中最理想的工藝路線。然而，四十余年來(lái)，從自然界中分離得到的催化該反應(yīng)的CPC?；?，活力均十分低，遠(yuǎn)不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，尚無(wú)工業(yè)化應(yīng)用的可能。兩步酶法，是指使用不同微生物來(lái)源的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAO)和戊二酰-7-氨基酸頭孢烷酸?；?glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase，GA)分兩步對(duì)CPC進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最終生成7-ACA。首先，CPC被DAO酶促氧化脫氨，生成相應(yīng)的α-酮基-己二酰-7ACA(α-keto-adipyl-7-aminocephalosporanic acid，AKA-7ACA)和H2O2，AKA-7ACA再在H2O2的作用下非酶促氧化脫羧，生成戊二酰-7-ACA(glutaryl-7-aminocephalosporanicacid，GL-7ACA)。而后，經(jīng)GA催化，水解GL-7ACA的戊二酰基側(cè)鏈生成7-ACA。該法在當(dāng)前7-ACA的工業(yè)生產(chǎn)中，是切實(shí)可行的工藝路線。然而如圖所示，因微生物中的過(guò)氧化氫酶對(duì)H2O2的破壞活性而對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)生干擾。
早在1994年，魏中荻等設(shè)計(jì)了利用產(chǎn)DAO的三角酵母和產(chǎn)GA的基因工程菌細(xì)胞在同一反應(yīng)器內(nèi)直接轉(zhuǎn)化CPC為7-ACA的酶法轉(zhuǎn)化過(guò)程(CN專利申請(qǐng)?zhí)?4112285.9)，但需使用疊氮化鈉等有毒物質(zhì)抑制過(guò)氧化氫酶活力。隨著GL-7ACA?；富?acy)與D-氨基酸氧化酶基因(daao)先后被克隆(楊蘊(yùn)劉等，生物工程學(xué)報(bào)，1991；劉洪波等，生物工程學(xué)報(bào)，15(3)，337-342，1999)，以及適合應(yīng)用于CPC轉(zhuǎn)化反應(yīng)的基因工程宿主菌E.coli MMR204和E.coli D11的成功構(gòu)建(CN 98110964.0，1998年；CN 98122876.3，1998年)，利用產(chǎn)雙酶的基因工程菌細(xì)胞，直接轉(zhuǎn)化CPC為7-ACA已成為可能。將兩菌二次發(fā)酵變?yōu)閱尉淮伟l(fā)酵，并使雙反應(yīng)罐的兩步酶反應(yīng)在單一反應(yīng)罐中一步完成，達(dá)到簡(jiǎn)化產(chǎn)酶菌的發(fā)酵和酶促轉(zhuǎn)化工藝之目的。
本發(fā)明的目的之一是提供一種同時(shí)含D-氨基酸氧化酶基因和戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富虻碾p基因共表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明的目的之二是提供上述共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的之三是提供上述共表達(dá)質(zhì)粒的用途。
本發(fā)明的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒是一種包含戊二酰-7-氨基頭孢烷酸(GL-7ACA)?；富?acy)與D-氨基酸氧化酶基因(daao)的質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)如下所示 ，式中，n＝0或1，P＝0或Not I，R＝EcoR I或HindIII；(daao-acy)m兩個(gè)基因相連接的順序及其多變體可以按多聚體形式存在于質(zhì)粒中，其中m＝1-3。
當(dāng)n＝0，P＝Not I，R＝EcoR I時(shí)，所述重組質(zhì)粒為pMSS，結(jié)構(gòu)式是 ，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后可得到含雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的菌種，該菌種已于2001年1月18日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其簡(jiǎn)稱為CGMCC，保藏號(hào)為No.0533，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)；當(dāng)n＝1，P＝0，R＝HindIII時(shí)，所述重組質(zhì)粒為pMSTO，結(jié)構(gòu)式是
，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌可得到含雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的菌種，該菌種已于2001年1月18日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其簡(jiǎn)稱為CGMCC，保藏號(hào)為No.0534，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。
上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌可以是大腸桿菌E.coli JM109、E.coli MMR204或E.coli D11等。
本發(fā)明采用基因重組的方法，使戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富?acy)與D-氨基酸氧化酶基因(daao)置于同一個(gè)啟動(dòng)子或分別在各自的啟動(dòng)子的調(diào)控下，獲得雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，該雙基因共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到基因工程菌后，接種于培養(yǎng)基并經(jīng)生長(zhǎng)培養(yǎng)，可同時(shí)表達(dá)DAO與GA的活力。下面通過(guò)六個(gè)方面對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容
進(jìn)行詳細(xì)闡述，即重組質(zhì)粒pMSS與pMSTO的構(gòu)建、表達(dá)方法及其應(yīng)用于對(duì)CPC的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明所涉及的研究材料見表1表1菌株與質(zhì)粒
重組質(zhì)粒pMSS的構(gòu)建本發(fā)明提供一種新的重組質(zhì)粒pMSS，它是雙鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)度為8.2kb。它的構(gòu)建過(guò)程如圖2所示。我們?cè)O(shè)計(jì)將daao及acy基因重組到一個(gè)DNA載體質(zhì)粒上，以使同一個(gè)基因工程菌細(xì)胞中同時(shí)產(chǎn)生DAO與GA兩種酶，使得轉(zhuǎn)化CPC生成7-ACA的兩步酶反應(yīng)能在同一細(xì)胞中一步完成。為此，我們利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII分別消化含acy基因的質(zhì)粒pKKCAIS，并將所得acy基因片斷與經(jīng)同樣酶切的載體質(zhì)粒pET28b相連，得到重組質(zhì)粒pMST。接著再用限制性內(nèi)切酶NheI和NotI將acy基因片斷從pMST上切下，與經(jīng)SpeI和NotI酶切，含dao基因的重組質(zhì)粒pJL相連。由于經(jīng)NheI和SpeI酶切的末端可以互補(bǔ)，經(jīng)T4DNH連接酶催化的連接反應(yīng)，acy基因片斷被插入到pJL中，并位于daao基因的下游，與daao基因串聯(lián)，該兩基因的轉(zhuǎn)錄均處于trc啟動(dòng)子控制之下。
重組質(zhì)粒pMSTO的構(gòu)建本發(fā)明提供一種新的重組質(zhì)粒pMSTO，它是雙鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)度為8.3kb，它的構(gòu)建過(guò)程如圖3所示。在本工作1項(xiàng)構(gòu)建所得重組質(zhì)粒pMSS中，由于acy基因距離trc啟動(dòng)子較遠(yuǎn)，由trc啟動(dòng)子控制的acy基因的表達(dá)可能偏弱。因此，在重組質(zhì)粒pMSTO的構(gòu)建設(shè)計(jì)中，使daao和acy基因分別受各自的啟動(dòng)子所控制。先用NdeI與NotI將acy基因從質(zhì)粒pMST上切下，與經(jīng)同樣酶切的載體pALTER-Ex1相連，使acy基因插入pALTER-Ex1中tac啟動(dòng)子下游部位。再用HindIII將acy基因連同tac啟動(dòng)子一齊切下，與經(jīng)同樣酶切的受體質(zhì)粒pJL相連，使tac啟動(dòng)子和acy基因插在daao基因下游，得到重組質(zhì)粒pMSTO。
重組質(zhì)粒pMSS、pMSTO在E.coli MMR204中的表達(dá)分別用pMSS與pMSTO質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化E.coli MMR204，轉(zhuǎn)化子經(jīng)純化后接種于LB液體培養(yǎng)基(組成成分為胰胨0.5％、酵母粉1.0％、NaCl1％，PH7.0)，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，再以1％接種量移種到裝60mlLB的500ml三角瓶中，繼續(xù)于37℃振搖培養(yǎng)，6hr起每隔兩小時(shí)取一次樣，測(cè)定發(fā)酵液中的GL-7ACA?；富盍癉AO活力。結(jié)果顯示pMSS與pMSTO在E.coliMMR204為宿主時(shí)，均能同時(shí)表達(dá)DAO與GA活力，培養(yǎng)過(guò)程中，兩者的產(chǎn)酶趨勢(shì)略有差異，DAO在12hr左右達(dá)到產(chǎn)酶高峰，之后酶活基本保持恒定，而GA活力在24hr左右達(dá)到產(chǎn)酶高峰，之后酶活基本不再增加。攜帶pMSS或pMSTO的E.coli MMR204基因工程菌在LB培養(yǎng)基中，于補(bǔ)加或不補(bǔ)加葡萄糖的條件下培養(yǎng)至36小時(shí)測(cè)得菌體內(nèi)DAO和GA活力見表2所示。由表可以看出，于LB中補(bǔ)加葡萄糖，對(duì)重組質(zhì)粒上兩酶的表達(dá)量有所促進(jìn)。
表2pMSS和pMSTO在E.coli MMR204中的表達(dá)
*培養(yǎng)至16小時(shí)后，開始向LB培養(yǎng)基中補(bǔ)加葡萄糖。每次補(bǔ)無(wú)0.1％，兩小時(shí)一次，共補(bǔ)5次。
重組質(zhì)粒pMSS、pMSTO在E.coli D11中的表達(dá)分別用pMSS與pMSTO質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化E.coli D11感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)純化后接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，再以1％接種量移種到裝60mlLB的500ml三角瓶中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。36hr時(shí)取樣，測(cè)定它們?cè)谘a(bǔ)糖與不補(bǔ)糖條件下生產(chǎn)DAO及GA的情況，結(jié)果如表3所示。可以看出，pMSS與pMSTO在E.coli D11中均能同時(shí)表達(dá)DAO與GA活力。通過(guò)往LB中補(bǔ)加葡萄糖，可以提高它們表達(dá)的兩酶活力。而GA活力的提高更為明顯。
表3pMSS和pMSTO在E.coli D11中的表達(dá)
*培養(yǎng)至16小時(shí)后，開始向LB培養(yǎng)基中補(bǔ)加葡萄糖。每次補(bǔ)充0.1％，兩小時(shí)一次，共補(bǔ)5次。
攜帶質(zhì)粒pMSS或pMSTO同時(shí)表達(dá)DAO與GA的基因工程菌細(xì)胞應(yīng)用于轉(zhuǎn)化CPC的反應(yīng)，直接轉(zhuǎn)化頭孢菌素C生成7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)。
E.coli MMR204(pMSS)或E.coli MMR204(pMSTO)對(duì)CPC的轉(zhuǎn)化由于E.coli.MMR204(pMSS)和E.coli MMR204(pMSTO)對(duì)CPC的轉(zhuǎn)化的情況基本相同，故僅以E.coli MMR204(pMSTO)為例，來(lái)說(shuō)明E.coli MMR204(pMSS)或E.coli MMR204(pMSTO)對(duì)CPC進(jìn)行轉(zhuǎn)化的情況。將E.coli MMR204(pMSTO)菌體與5ml 10g/L的CPC溶液按實(shí)施例5的要求混合并反應(yīng)。圖3是反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中反應(yīng)液內(nèi)殘留CPC(％)、7-ACA生成率、及AKA-7ACA相對(duì)積累(以反應(yīng)液中積累AKA-7ACA最多時(shí)AKA-7ACA的濃度為100％)隨時(shí)間的變化圖。圖6是轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行至220分鐘時(shí)反應(yīng)液的HPLC檢測(cè)圖。從圖4可以看出，反應(yīng)體系中產(chǎn)物7-ACA的增加十分緩慢，而反應(yīng)中間產(chǎn)物酮酸AKA-7ACA在反應(yīng)體系中不斷積累，在整個(gè)反應(yīng)中濃度一直呈上升趨勢(shì)。反應(yīng)至220分鐘時(shí)，7-ACA的生成率僅11.05％。從圖5可以看到，轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行至220分鐘時(shí)，反應(yīng)液中積累的AKA-7ACA的峰面積很大，而產(chǎn)物7-ACA峰面積較小。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因乃是由于MMR204染色體上編碼過(guò)氧化氫酶的基因(katG，katE)表達(dá)，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫酶活性，使得DAO催化CPC氧化脫氨反應(yīng)中生成的H2O2被破壞，干擾AKA-7ACA的氧化脫羧而堆積，導(dǎo)致進(jìn)一步轉(zhuǎn)化反應(yīng)的終止。
E.coli D11(pMSS)或E.coli D11(pMSTO)對(duì)CPC的轉(zhuǎn)化由于E.coli D11(pMSS)和E.coli D11(pMSTO)對(duì)CPC的轉(zhuǎn)化的情況基本相同，故僅以E.coli D11(pMSTO)為例，來(lái)說(shuō)明產(chǎn)雙酶菌株對(duì)CPC進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化的情況。將E.coli D11(pMSTO)菌體與5m1 10g/L的CPC溶液按實(shí)施例5的要求混合并反應(yīng)。圖5是反應(yīng)進(jìn)行時(shí)反應(yīng)液中殘留CPC(％)、7-ACA生成率、及AKA-7ACA相對(duì)積累(以反應(yīng)液中積累AKA-7ACA最多時(shí)AKA-7ACA的濃度為100％)隨時(shí)間的變化圖。圖7是轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行至220分鐘時(shí)反應(yīng)液的HPLC檢測(cè)圖。從圖5可以看出，由于宿主菌E.coli D11中的過(guò)氧化氫酶已被鈍化失活，故整個(gè)反應(yīng)進(jìn)行中只有少量酮酸AKA-7ACA積累，且反應(yīng)至90分鐘時(shí)酮酸積累已達(dá)飽和，此后不斷下降。反應(yīng)體系中產(chǎn)物7-ACA則隨反應(yīng)的進(jìn)行不斷增加，至240分鐘時(shí)，CPC已被轉(zhuǎn)化完畢，基本不發(fā)生AKA-7ACA積累，7-ACA的生成率可達(dá)74.16％。
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1重組質(zhì)粒pMSS構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)施例中涉及的酶切、連接，或受態(tài)細(xì)胞制備、電擊轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)方法均參考“Molecular Cloning-A laboratory Mannual”ed.by J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，1989，CSHL Press.步驟1.用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對(duì)質(zhì)粒pKKCAIS進(jìn)行完全酶切，用華舜公司的膠回收試劑盒回收pKKCAIS酶切后產(chǎn)生的2.5kb的?；富?acy)片斷。步驟2.用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII消化質(zhì)粒pET28b。酶反應(yīng)結(jié)束后分別用酚，酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反應(yīng)液，以去除反應(yīng)液中的酶蛋白。之后加入兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，DNA重溶于重蒸水中。步驟3.混合由步驟1得到的acy基因片斷及步驟2得到的線性化pET28b載體DNA，加入T4 DNA連接酶，于16℃反應(yīng)12小時(shí)。步驟4.將步驟3的連接混合液經(jīng)酚，酚∶氯仿(1∶1)分別抽提后，加入1/3體積，7.5M的醋酸銨溶液及2倍體積無(wú)水乙醇沉淀連接反應(yīng)液中的DNA，重溶于5ul重蒸水中。用lul重懸的DNA電擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞，在含50ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上獲得轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步選取數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化子抽提DNA并酶切鑒定，確定轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒DNA中含有2.5kb的外源acy基因片斷，該質(zhì)粒命名為pMST。步驟5.用限制性內(nèi)切酶NheI和NotI對(duì)質(zhì)粒pMST進(jìn)行完全酶切，用華舜公司的膠回收試劑盒回收pMST酶切后產(chǎn)生的2.5kb的?；富?acy)片斷。步驟6.用限制性內(nèi)切酶SpeI和NotI消化質(zhì)粒pJL。酶反應(yīng)結(jié)束后分別用酚，酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反應(yīng)液，以去除反應(yīng)液中的酶蛋白。之后加入兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，DNA重溶于重蒸水中。步驟7.由于NheI與SpeI酶切后產(chǎn)生的粘性末端可以匹配。故混合步驟5得到的acy基因片斷和步驟6得到的線性化pJL載體質(zhì)粒DNA，加入T4 DNA連接酶，于16℃反應(yīng)12小時(shí)。步驟8.將步驟7的連接混合液經(jīng)酚，酚∶氯仿(1∶1)分別抽提后，加入1/3體積，7.5M的醋酸銨溶液及2倍體積無(wú)水乙醇沉淀連接反應(yīng)液中的DNA，重溶于5ul重蒸水中。用1ul重懸的DNA溶液電擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞，在含50ug/ml氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基上獲得轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步選取數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化子抽提DNA并酶切鑒定，確定轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒DNA中含有2.5kb的外源acy基因片斷，該質(zhì)粒命名為pMSS。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒pMSS的構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)施例中涉及的酶切、連接，或受態(tài)細(xì)胞制備、電擊轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)方法均參考“Molecular Cloning-A laboratory Mannual”ed.by J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，1989，CSHL Press.步驟1.用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對(duì)質(zhì)粒pKKCAIS進(jìn)行完全酶切，用華舜公司的膠回收試劑盒回收pKKCAIS酶切后產(chǎn)生的2.5kb的?；富?acy)片斷。步驟2.用限制性內(nèi)切酶NotI和NdeI對(duì)實(shí)施例1，步驟4所得質(zhì)粒pMST進(jìn)行完全酶切，用華舜公司的膠回收試劑盒回收pMST酶切后產(chǎn)生的2.5kb的?；富?acy)片斷。步驟3.用限制性內(nèi)切酶NotI和NdeI消化質(zhì)粒pALTER-Ex1。酶反應(yīng)結(jié)束后分別用酚，酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反應(yīng)液，以去除反應(yīng)液中的酶蛋白。之后加入兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，DNA重溶于重蒸水中。步驟4.混合由步驟1得到的acy基因片斷及步驟3得到的線性化pALTER-Ex1載體DNA，加入T4 DNA連接酶，于16℃反應(yīng)12小時(shí)。步驟5.將步驟4的連接混合液經(jīng)酚，酚∶氯仿(1∶1)分別抽提后，加入1/3體積，7.5M的醋酸銨溶液及2倍體積無(wú)水乙醇沉淀連接反應(yīng)液中的DNA，重溶于5ul重蒸水中。用1ul重懸的DNA電擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞，在含25ug/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上獲得轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步選取數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化子，抽提DNA并酶切鑒定，確定轉(zhuǎn)化菌株所含質(zhì)粒DNA中帶有2.5kb的外源acy基因片斷，該質(zhì)粒命名為pMSTW。步驟6.用限制性內(nèi)切酶HindIII對(duì)質(zhì)粒pMSTW進(jìn)行完全酶切，用華舜公司的膠回收試劑盒回收pMSTW酶切后產(chǎn)生的前端連有tac啟動(dòng)子的?；富?acy)片斷。步驟7.用限制性內(nèi)切酶HindIII消化質(zhì)粒pJL。酶反應(yīng)結(jié)束后分別用酚，酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反應(yīng)液，以去除反應(yīng)液中的酶蛋白。之后加入兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，DNA重溶于重蒸水中。步驟8.混合步驟5得到的帶tac啟動(dòng)子的acy基因片斷和步驟6得到的線性化pJL質(zhì)粒DNA，加入T4 DNA連接酶，于16℃反應(yīng)12小時(shí)。步驟9.將步驟7的連接混合液經(jīng)酚，酚∶氯仿(1∶1)分別抽提后，加入1/3體積，7.5M的醋酸銨溶液及2倍體積無(wú)水乙醇沉淀連接反應(yīng)液中的DNA，重溶于5ul重蒸水中。用1ul重懸的DNA電擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞，在含50ug/ml氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基上獲得轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步選取數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化子抽提DNA并酶切鑒定，選取其中pJL獲得了插入帶tac啟動(dòng)子的外源acy基因片斷的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pMSTO。
實(shí)施例3GL-7ACA?；富盍y(cè)定的實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)魏中荻，楊蘊(yùn)劉，金志坤等，中國(guó)專利，公開號(hào)1995 CN1104255A取0.5ml發(fā)酵液，4000rpm離心10分鐘，棄上清液，并用3ml磷酸緩沖液稀釋6倍。然后取0.5ml稀釋菌液，于37℃預(yù)熱10分鐘，再加入0.5ml預(yù)熱底物(5mg/ml GL-7-ACA，用同樣磷酸緩沖液現(xiàn)配)，37℃水浴反應(yīng)30分鐘。加入3ml終止液和0.5ml顯色液。靜置30分鐘后，于4000rpm離心15分鐘。取上清液于415nm測(cè)定光吸收值?？瞻讓?duì)照則先加終止液，后加底物，其余同上。
酶活力(u/m1)＝k×O.D.415×稀釋倍數(shù)(6倍)/(272×t×D)k標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率t反應(yīng)時(shí)間30minD反應(yīng)加入菌液的體積0.5ml2727-ACA分子量一個(gè)單位的GL-7ACA酰化酶活力定義為特定反應(yīng)條件下(37℃，0.1mol/LpH7.0磷酸緩沖液)每分鐘能轉(zhuǎn)化GL-7ACA生成1μmol 7-ACA的所需酶量。
實(shí)施例4D-氨基酸氧化酶活力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)步驟參考Aschwini et al，J Biosci 1987，11137～144取0.5mld-氨基酸氧化酶基因工程菌發(fā)酵液，4,000rpm離心15分鐘以收集菌體。再將濕菌體經(jīng)-20℃凍融，加入5ml用焦磷酸緩沖液(0.1M，pH8.5)配制的50mM DL-甲硫氨酸溶液，于37℃振蕩反應(yīng)30分鐘。然后用3ml 10％三氯乙酸終止反應(yīng)。將反應(yīng)液于4000rpm離心15分鐘，取上清液稀釋10倍，再取1ml加入0.4ml 0.2％的2，4-二硝基苯肼，靜置10分鐘，而后加入1.5ml3N的氫氧化鈉，靜置15分鐘，再離心、取上清液在550nm下測(cè)光吸收值，代入用丙酮酸鈉制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的公式，計(jì)算出酶活單位。酶活力(u/ml)＝k×O.D550×稀釋倍數(shù)/tk標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率
t反應(yīng)時(shí)間30min一個(gè)酶活單位的D-氨基酸氧化酶定義為在特定應(yīng)條件下(37℃，pH8.5)每分鐘氧化脫氨生成1μmol酮酸所需酶量。
實(shí)施例5DAO、GA基因工程菌轉(zhuǎn)化CPC的實(shí)驗(yàn)步驟將所構(gòu)造的DHO、GA工程菌的菌體細(xì)胞與10g/L的CPC-Na鹽溶液混合，加入1％(wt/vo1)的舒巴坦鈉以抑制重組質(zhì)粒上的氨卞抗性基因編碼的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)CPC及其衍生物的破壞。于28℃水浴200轉(zhuǎn)/min振蕩反應(yīng)，以5％氨水維持反應(yīng)液pH7.0。半小時(shí)取樣一次，用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行的程度及反應(yīng)物、產(chǎn)物濃度的變化。直至CPC轉(zhuǎn)化反應(yīng)完成。
實(shí)施例6HPLC檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)步驟使用Beckman Gold System HPLC，填料直徑5μ，柱容4.6mm×25cm的Ultrasphere ODS反相色譜柱，流速1ml/min，壓力1.7～2.2 Kpsi，流動(dòng)相為7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，在245nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)CPC及其衍生物。
權(quán)利要求
1.一種包含戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶基因(acy)與D-氨基酸氧化酶基因(daao)的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)如下所示 ，式中，n＝0或1，P＝0或Not I，R＝EcoR I或HindIII。
2.如權(quán)利要求
1所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，其特征是具有如下結(jié)構(gòu)式
3.如權(quán)利要求
1所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，其特征是具有如下結(jié)構(gòu)式
4.如權(quán)利要求
2所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，其特征是該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.0533。
5.如權(quán)利要求
3所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，其特征是該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.0534。
6.如權(quán)利要求
1所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，其特征是(daao-acy)m兩個(gè)基因相連接的順序及其多變體可以按多聚體形式存在于質(zhì)粒中，其中m＝1-3。
7.如權(quán)利要求
1所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)方法，其特征是采用基因重組的方法，使戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富?acy)與D-氨基酸氧化酶基因(daao)置于同一個(gè)啟動(dòng)子或分別在各自的啟動(dòng)子的調(diào)控下，獲得雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，該雙基因共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到基因工程菌后，接種于培養(yǎng)基，經(jīng)生長(zhǎng)培養(yǎng)后表達(dá)。
8.如權(quán)利要求
7所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征是所述的啟動(dòng)子是啟動(dòng)子trc或啟動(dòng)子tac。
9.如權(quán)利要求
7所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征是所述的基因工程菌的宿主菌是大腸桿菌E.coli JM109、E.coli MMR204或E.coli D11。
10.如權(quán)利要求
1所述的雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的用途，其特征是用于直接轉(zhuǎn)化頭孢菌素C生成7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種同時(shí)含D－氨基酸氧化酶基因和戊二酰－7－氨基頭孢烷酸?；富虻碾p基因共表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒是通過(guò)基因重組的方法,使戊二酰－7－氨基頭孢烷酸?；富?acy)與D－氨基酸氧化酶基因(daao)置于同一個(gè)啟動(dòng)子或分別在各自的啟動(dòng)子的調(diào)控下獲得。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到基因工程菌如CGMCC No.0533、CGMCC No.0534,可應(yīng)用于直接轉(zhuǎn)化頭孢菌素C生成7－氨基頭孢烷酸(7－ACA)。
文檔編號(hào)C12N1/21GKCN1371999SQ01105485
公開日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2001年2月28日
發(fā)明者楊蘊(yùn)劉, 朱彤波, 張益棻, 姜衛(wèi)紅, 陳軍, 焦瑞身 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan