專(zhuān)利名稱(chēng):一種新型dna疫苗載體的制作方法
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種高效、安全、可適合于人體內(nèi)使用的DNA疫苗用載體的構(gòu)建，及其本系列載體的實(shí)際用途。
DNA疫苗(DNA vaccine)又稱(chēng)基因疫苗(Gene vaccine)，其本質(zhì)為將外源蛋白編碼基因片段克隆在真核質(zhì)粒DNA表達(dá)載體上，直接接種機(jī)體后可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白并誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。由于它可克服傳統(tǒng)疫苗的部分缺陷、能同時(shí)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，并具有制備簡(jiǎn)便、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因而被認(rèn)為是繼減毒、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗，為未來(lái)疫苗的一個(gè)發(fā)展方向，近幾年來(lái)得到了廣泛關(guān)注和深入研究，已有許多組建針對(duì)不同目的基因表達(dá)質(zhì)粒DNA、在多種動(dòng)物體內(nèi)研究DNA疫苗誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答、保護(hù)動(dòng)物免受病原體攻擊或治療疾病如腫瘤、變態(tài)反應(yīng)和自身免疫病的報(bào)道，多個(gè)DNA疫苗也已獲準(zhǔn)進(jìn)行了人體臨床I期實(shí)驗(yàn)。分析已有研究結(jié)果可見(jiàn)，DNA疫苗在不同動(dòng)物中誘生免疫應(yīng)答的強(qiáng)度存在明顯差異，在小鼠中效果較為肯定，在大動(dòng)物(如靈長(zhǎng)目動(dòng)物)和人體中免疫效果則不理想。研究DNA疫苗在不同種動(dòng)物差異的機(jī)制及如何使DNA疫苗在大動(dòng)物、人體內(nèi)更有效正成為各國(guó)科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。
近年來(lái)，各國(guó)科學(xué)家開(kāi)展了大量研究工作以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果。與本發(fā)明相關(guān)的文獻(xiàn)及專(zhuān)利有Norman JA、Montgomery DL及Hartikka J(Norman JA，et al.Vaccine.1997，158801-803；Montgomery DL，et al.DNA and Cell Biology.1993，129777-783；Hartikka J，et al.Human Gene Therapy.1996，71205-1217)等分別報(bào)道了對(duì)真核載體的表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行優(yōu)化可提高表達(dá)水平，但沒(méi)有對(duì)載體的免疫原性及安全性的公開(kāi)。在專(zhuān)利號(hào)PCT WO97/28259和專(zhuān)利號(hào)PCT WO98/52581中，均有優(yōu)化CpG免疫刺激元件提高載體免疫原性的描述，但均未涉及本發(fā)明采用的構(gòu)建載體及優(yōu)化CpG免疫刺激元件序列的策略。專(zhuān)利號(hào)PCT WO98/06863報(bào)道了一種帶有RANTES啟動(dòng)子、可在抗原抗原提呈細(xì)胞中有效表達(dá)插入編碼基因的載體。專(zhuān)利號(hào)PCT WO99/43841構(gòu)建了一種以人乳頭瘤病毒基因?yàn)榭蚣?、可進(jìn)行自我復(fù)制的DNA疫苗用載體。孫樹(shù)漢等(中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN1231339)報(bào)道了一種人、豬共患囊蟲(chóng)病核酸疫苗，無(wú)對(duì)載體進(jìn)行改進(jìn)以提高轉(zhuǎn)錄和翻譯水平、免疫原性及保證安全性考慮的描述。迄今，沒(méi)有與本發(fā)明相同的DNA疫苗用載體。
本發(fā)明的目的是提供一種高效、安全、可適合于人體內(nèi)使用的DNA疫苗用載體及其實(shí)際用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)對(duì)載體表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行改進(jìn)以提高轉(zhuǎn)錄和翻譯水平、改變載體骨架中免疫刺激元件CpG結(jié)構(gòu)的類(lèi)型和數(shù)量來(lái)改善DNA疫苗的免疫效果、選擇合適的抗性基因及避免采用與人類(lèi)基因同源的載體序列以保證DNA疫苗在人體內(nèi)使用的安全性而構(gòu)建一種新型的載體。為評(píng)價(jià)優(yōu)化DNA疫苗用載體的效果，本發(fā)明將乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因克隆至相應(yīng)載體中，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)載體表達(dá)外源基因的能力，小鼠體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)載體誘生特異性體液免疫(檢測(cè)血清中抗HBsAg)和細(xì)胞免疫(細(xì)胞因子分泌)的能力。
本發(fā)明首先構(gòu)建了一個(gè)可在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源蛋白、具有卡那霉素抗性基因的真核表達(dá)載體作為人用DNA疫苗載體原型。本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)建的人用DNA疫苗載體具有以下幾個(gè)特點(diǎn)(1)載體小(3kb)，能容納較大的外源蛋白編碼序列；(2)拷貝數(shù)比通用載體高，易大量制備；(3)采用卡那霉素抗性基因，避免使用氨芐青霉素抗性基因帶來(lái)的對(duì)過(guò)敏人群的潛在危害性；(4)僅含有質(zhì)粒復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)和真核表達(dá)調(diào)控必需元件(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào))，減少質(zhì)粒與人體染色體發(fā)生整合的機(jī)率；(5)卡那霉素抗性基因兩側(cè)有特異性酶切位點(diǎn)，可允許插入CpG免疫刺激元件，以提高載體骨架免疫佐劑作用。本發(fā)明先采用高保真PCR技術(shù)從質(zhì)粒pCI-neo(Promega公司)和pVR1012(Vical公司)獲取含質(zhì)粒復(fù)制子、CMV IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、內(nèi)含子、多克隆位點(diǎn)和卡那霉素抗性基因的DNA片段，前者為2315bp，后者為1212bp，測(cè)序確認(rèn)后用SacII和SphI雙酶切，采用膠回收試劑盒從凝膠中回收DNA，將兩片段連接組成pYQ重組質(zhì)粒。進(jìn)一步采用PCR技術(shù)從pcDNA1.1(Invitrogen公司)獲取含CMV啟動(dòng)子及多克隆位點(diǎn)的DNA片段(685bp)，從質(zhì)粒pVR1012(Vical公司)獲取含BGH poly(A)的DNA片段(578bp)，用BglII+SphI酶切pYQ載體回收2037bp的大片段(含卡那霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制子)，將上述三個(gè)DNA片段經(jīng)T4DNA連接酶連接后組成pYQF。構(gòu)建流程圖及載體基因結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖(圖1、2、3、4)。
“CpG結(jié)構(gòu)”(CpG motif)為Krieg AM等在研究了300多種寡核苷酸對(duì)B細(xì)胞活化作用的基礎(chǔ)上提出的一個(gè)新概念(Krieg AM，et al.Nature.1995，3746522546-549)即一些中間為未甲基化的CpG二核苷酸、兩側(cè)分別為兩個(gè)嘌呤(5′側(cè))和兩個(gè)嘧啶(3′)的特定寡核苷酸序列，如5′-GACGTC-3′、5′-AGCGCT-3′、5′-AACGTT-3′。大量體外研究已發(fā)現(xiàn)，該特定結(jié)構(gòu)對(duì)哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)有激活作用，能刺激Mφ、DC、NK、T及B淋巴細(xì)胞，并使之分泌IL-2、IL-6、IL-12及IFN-γ等，使免疫反應(yīng)向TH1型轉(zhuǎn)變(Stacey KJ，et al.J Immunol.1996，15752116-2122；Sparwasser T，et al.Eur J Immunol.1998，2862045-2054；Yamamoto S，et al.Jpn J Cancer Res.1988，797866-873；Bendigs S，et al.Eur J Immunol.1999，29(4)1209-1218)。Sato等(Sato Y，et al.Science.1996，2735273352-354)發(fā)現(xiàn)，卡那霉素抗性基因中不含有在氨芐青霉素抗性基因中存在的CpG結(jié)構(gòu)，相應(yīng)載體的免疫原性較弱，由此推測(cè)載體骨架中的CpG結(jié)構(gòu)的存在與否決定了DNA疫苗的免疫原性。他們進(jìn)一步在含有卡那霉素抗性基因的載體中插入含CpG結(jié)構(gòu)的ODN發(fā)現(xiàn)可提高該載體的免疫效果。上述研究結(jié)果提示改變載體骨架中免疫刺激元件CpG結(jié)構(gòu)的類(lèi)型和數(shù)量有改善DNA疫苗免疫效果的可能性。然而對(duì)于是否插入越多越好、在哪個(gè)部位插入比較好，尚無(wú)明確規(guī)律可循。Krieg AM等發(fā)現(xiàn)插入了50個(gè)CpG結(jié)構(gòu)的載體的免疫原性反而比插入16個(gè)CpG結(jié)構(gòu)的載體差(Krieg AM，et al.Proc Natl Acad Sci USA.1998，952112631-12636)，可能的原因?yàn)檩d體中過(guò)多CpG結(jié)構(gòu)所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)干擾載體表達(dá)外源蛋白的水平。為尋找到在上述構(gòu)建的人用DNA疫苗載體原型中引入CpG結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)載體免疫效果的合適途徑，本發(fā)明先在pYQ載體的不同位點(diǎn)(Sac II及Sph I)插入已在小鼠中證實(shí)有刺激作用的“5′-AACGTT-3′”CpG結(jié)構(gòu)，共獲得四種載體pYQ-SacII-1CpG、pYQ-SacII-2CpG、pYQ-SphI-1CpG和pYQ-SphI-5CpG，它們分別在SacII位點(diǎn)插入了1和2個(gè)CpG元件(pYQ-SacII-1CpG、pYQ-SacII-2CpG)，在SphI位點(diǎn)插入了1和5個(gè)CpG元件(pYQ-SphI-1CpG和pYQ-SphI-5CpG)。上述載體中插入HBsAg基因后免疫BALB/c小鼠。每個(gè)免疫組12只小鼠。采用雙側(cè)后腿脛前肌注射方法，每只小鼠注射50μg DNA(濃度為0.5μg/μl，溶于生理鹽水中)。并設(shè)pYQ/HbsAg、空載pYQ對(duì)照和陰性小鼠對(duì)照(各2只小鼠)。初次免疫后第4周同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后每隔2周定期采血。ELISA結(jié)果顯示(圖5)，免疫后8周，pYQ-SacII-1CpG/HBs、pYQ-SacII-2CpG/HBs、pYQ-SphI-1CpG/HBs、pYQ-SphI-5CpG/HBs和pYQ/HBs誘生小鼠產(chǎn)生抗-HBs IgG的水平(血清1∶200稀釋時(shí)的A450)分別為1.63±0.30、1.37±0.22、1.17±0.20、1.54±0.20和0.77±0.13。比較pYQ-CpG/HBs各免疫組之間抗體水平的差異可見(jiàn)，插入CpG元件的載體pYQ-CpG/HBs(除pYQ-SphI-1CpG/S)誘生的抗體水平顯著高于pYQ/HBs(t檢驗(yàn)，P＜0.05)，說(shuō)明CpG免疫刺激元件的插入提高了載體的免疫原性。作為CpG結(jié)構(gòu)插入位點(diǎn)，Sac II切點(diǎn)比Sph I切點(diǎn)更優(yōu)越；此外，CpG的免疫增強(qiáng)作用同插入的數(shù)量亦有關(guān)系，在Sph I位點(diǎn)插入5個(gè)CpG比插入一個(gè)CpG效果好，在Sac II位點(diǎn)插入2個(gè)CpG比插入一個(gè)CpG免疫效果反而有所下降(圖5)。
通過(guò)以上研究，本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)含有卡那霉素抗性基因、有CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、BGH轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、在細(xì)胞內(nèi)可有效表達(dá)外源蛋白、可適用于人體使用的DNA疫苗載體原型，并尋找到插入CpG結(jié)構(gòu)以提高載體骨架免疫原性的合適位置。由于先前的工作主要在小鼠中進(jìn)行，故在載體原型中插入的為對(duì)小鼠有效的寡核苷酸5′-AACGTT-3′。已有研究發(fā)現(xiàn)，CpG免疫刺激序列存在種間差異，對(duì)小鼠有效的5′-GACGTT-3′、5′-GACGTC-3′、5′-AACGTT-3′等對(duì)人體免疫細(xì)胞刺激作用較弱(Liang H，et al.J Clin Invest.1996，9851119-1129)。為最終獲得一種可在人體內(nèi)誘生有效免疫應(yīng)答的DNA疫苗用載體，本發(fā)明進(jìn)一步應(yīng)用人外周血淋巴細(xì)胞體外刺激實(shí)驗(yàn)篩選能有效刺激人體免疫系統(tǒng)的寡核苷酸，以取代現(xiàn)有人用DNA疫苗載體原型中插入的鼠CpG結(jié)構(gòu)(5′-AACGTT-3′)。
可以假設(shè)人CpG結(jié)構(gòu)的通式為“5′-NNCpGNN-3′”，其中CpG兩側(cè)的N均可為嘌呤或嘧啶。理論推測(cè)，滿(mǎn)足該通式的6核苷酸序列可有256(44)種排列方式，除去抑制性CpG組合(5′-CCpG-3′和5′-CpGG-3′)，共144種排列方式。分析它們?cè)诖竽c桿菌和結(jié)核桿菌基因組中出現(xiàn)的頻率可以發(fā)現(xiàn)頻率波動(dòng)較大(表1)。機(jī)體免疫系統(tǒng)可識(shí)別細(xì)菌DNA中非甲基化CpG結(jié)構(gòu)而被激活對(duì)機(jī)體是一種非特異性防御反應(yīng)，對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)則是一種“壓力”。為適應(yīng)在宿主體內(nèi)的生存，細(xì)菌本身就會(huì)對(duì)CpG結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)化選擇(Evolutionary Selectionagiast CpG)，可出現(xiàn)“CpG抑制”(CpG Suppression)等現(xiàn)象。因此，一般認(rèn)為，細(xì)菌基因組中出現(xiàn)頻率高(大于2000次數(shù))的CpG序列可能不具有對(duì)人免疫系統(tǒng)較強(qiáng)的免疫刺激作用，以免過(guò)度激活機(jī)體免疫系統(tǒng)而引起對(duì)其本身的免疫清除。據(jù)此推測(cè)，只有那些細(xì)菌基因組中出現(xiàn)頻率較低(小于1500次數(shù))的CpG結(jié)構(gòu)才有被人免疫系統(tǒng)識(shí)別的可能性。應(yīng)用相似方法，本發(fā)明對(duì)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA免疫動(dòng)物和人體試驗(yàn)的載體序列進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)，這些載體中大多含有多個(gè)對(duì)鼠有效的CpG結(jié)構(gòu)，如5′-AACGTT-3′、5′-GACGTC-3′等，這與它們能在小鼠誘生有效免疫應(yīng)答的結(jié)果相一致；已報(bào)道對(duì)人有效的CpG結(jié)構(gòu)“TTCGAA”基本缺如，而“GTCGTT”則在部分載體中也存在多個(gè)拷貝。應(yīng)用上述載體未能在人體誘生較強(qiáng)免疫應(yīng)答的結(jié)果提示載體中現(xiàn)有的CpG結(jié)構(gòu)仍不足以有效激發(fā)人體免疫系統(tǒng)，而在上述載體中缺如的CpG結(jié)構(gòu)則有成為有效人CpG結(jié)構(gòu)的可能。綜合分析大腸桿菌、結(jié)核桿菌中比較低頻率(小于1500次數(shù))出現(xiàn)的CpG結(jié)構(gòu)及已有DNA疫苗載體中缺如的CpG結(jié)構(gòu)的信息，本發(fā)明選擇了6種CpG結(jié)構(gòu)并合成相應(yīng)的硫代寡核苷酸進(jìn)行篩選，以期從中獲得新的人用CpG免疫刺激元件，它們的保守序列分別為-AACGTC-、-AGCGCT-、-ATCGTC-、GGCGTC-、-GTCGCT-和GTCGTC(表3)。這6種CpG結(jié)構(gòu)在兩細(xì)菌基因組中均以較低頻率出現(xiàn)，并不存在于現(xiàn)有的載體之中，也未有它們對(duì)人免疫系統(tǒng)有無(wú)作用的報(bào)道。
由于難以直接使用人體評(píng)價(jià)寡核苷酸的免疫刺激作用，現(xiàn)有的有關(guān)CpG刺激人免疫系統(tǒng)的信息都來(lái)源于應(yīng)用人PBMC進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，包括刺激B淋巴細(xì)胞增殖、激發(fā)PBMC釋放IFN-α、IFN-γ及IL-12等。由于CpG免疫佐劑作用的發(fā)揮(包括DNA疫苗的免疫效果)最終是一個(gè)體內(nèi)過(guò)程，有必要選擇一個(gè)可預(yù)測(cè)、或與體內(nèi)免疫佐劑作用平行的體外實(shí)驗(yàn)作為指標(biāo)以用于體外篩選對(duì)人免疫系統(tǒng)有效的CpG結(jié)構(gòu)。Hartman等(Hartmann G，et al.J Immunol.2000，16431617-1624)通過(guò)小鼠中的研究認(rèn)為，CpG活化B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的能力與其體內(nèi)免疫佐劑作用相平行，據(jù)此利用來(lái)自人外周血的B細(xì)胞及NK細(xì)胞篩選到一個(gè)對(duì)人免疫系統(tǒng)有較強(qiáng)刺激作用的CpG結(jié)構(gòu)5′-GTCGTT-3′，他們認(rèn)為，與檢測(cè)單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-6、IL-12、TNF-α相比，人B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的功能不易受低劑量?jī)?nèi)毒素的干擾，比較真實(shí)地反映CpG的免疫刺激作用。本發(fā)明將合成的寡核苷酸分別作鼠脾細(xì)胞體外增殖試驗(yàn)和HBsAg蛋白的聯(lián)合免疫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，CpG結(jié)構(gòu)對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖能力與其體內(nèi)的免疫佐劑作用相平行，提示可應(yīng)用人外周血淋巴細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)篩選人特異性CpG免疫刺激元件。人外周血淋巴細(xì)胞體外刺激實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，上述自行設(shè)計(jì)的寡核苷酸對(duì)人PBMC的刺激作用依次為5′-AGCGCT-3′(SI＝4.4)，5′-AACGTC-3′(SI＝4.3)，5′-ATCGTC-3′(SI＝1.2)，5′-GGCGTC-3′(SI＝1.0)，5’-GTCGTC-3’(SI＝0.9)，5’-GTCGCT-3’(SI＝0.8)(表4)。本發(fā)明獲得了兩個(gè)對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞有較強(qiáng)刺激作用的寡核苷酸，其CpG結(jié)構(gòu)分別為5′-AGCGCT-3′、5′-AACGTC-3′，(表4)。分別合成以下兩個(gè)寡核苷酸5′-TCAAAGCGCTGATGGC-3′(16-mer)；5′-CATCAGCGCTTTGAGC-3′(16-mer)。兩個(gè)寡核苷酸相互退火形成的異源二聚體末端與Sac II酶切末端相匹配。質(zhì)粒pYQF經(jīng)Sac II酶切后與此二聚體相連接，組建成了含有對(duì)人免疫系統(tǒng)有較強(qiáng)刺激作用CpG元件的DNA疫苗載體pYQF-hCpG(圖6)。
通過(guò)上述工作，本發(fā)明對(duì)核酸疫苗用載體進(jìn)行了優(yōu)化并獲得了一個(gè)可應(yīng)用于人體的新型DNA疫苗用載體pYQF-hCpG(圖6)。它具有以下特點(diǎn)(1)載體小，僅3.0kb左右，能容納較大的外源基因片段；(2)拷貝數(shù)高，易大量制備；(3)采用卡那霉素抗性基因；(4)僅含有質(zhì)粒復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)、真核表達(dá)調(diào)控必需元件(如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，BGH轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)等)；(5)載體骨架中插入了人用CpG結(jié)構(gòu)；(6)在細(xì)胞內(nèi)可有效表達(dá)外源蛋白。本發(fā)明將有助于DNA疫苗早日應(yīng)用于人類(lèi)疾病的防治。鑒于CpG元件具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向Th1轉(zhuǎn)換的作用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞有較強(qiáng)刺激作用的寡核苷酸有進(jìn)一步發(fā)展為新型免疫佐劑的前景。
本發(fā)明的實(shí)施例與效果可由以下實(shí)例說(shuō)明，但必須指出，以下僅為實(shí)例，并不意味著限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一pYQF系列載體免疫接種后體內(nèi)的抗體和脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平。
將已插入乙型肝炎病毒表面抗原編碼基因的pYQF系列載體pYQF/HBs、pYQF-CpG/HBs等分別免疫BALB/c小鼠。每個(gè)免疫組12只小鼠。采用雙側(cè)后腿脛前肌注射方法，每只小鼠注射50μg/100μl DNA生理鹽水溶液。pCI-neo/HBs和HBsAg蛋白質(zhì)(1μg/鼠)各免疫6只小鼠，并設(shè)空載pYQF對(duì)照和陰性小鼠對(duì)照(各2只小鼠)。初次免疫后第4周同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后第2、4、6、8周定期采血，分離血清后-20℃保存。ELISA一并檢測(cè)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示(圖7、8)，pYQF/HBs、pYQF-1CpG/HBs和pYQF-2CpG/HBs均可誘生小鼠產(chǎn)生高水平的特異性抗體，滴度達(dá)104以上?？贵w的亞類(lèi)分析顯示該載體系列誘生的抗體主要是IgG2a。
BALB/c鼠在免疫后第10周時(shí)每組隨機(jī)挑取6只小鼠，脫頸椎處死，取脾臟，脾臟混合后制成單細(xì)胞懸液。用HBsAg刺激脾細(xì)胞(細(xì)胞濃度3×106/ml，HBsAg濃度10μg/ml)。48小時(shí)后檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4濃度，評(píng)價(jià)HBsAg特異性細(xì)胞免疫水平。結(jié)果顯示(表5)，pYQF系列載體和pCI-neo/S免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞經(jīng)HBsAg刺激后均可分泌高水平的IFN-γ，且pYQF載體系列高于pCI-neo，但檢測(cè)不出IL-4。
該系列載體誘生的IgG均以IgG2a為主，刺激免疫后小鼠脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子主要為IFN-γ，提示主要誘生Th1型免疫應(yīng)答。實(shí)施例二CpG ODN+HBsAg免疫小鼠后誘生的抗體水平。
將酵母重組表達(dá)的HBsAg分別與合成的CpG寡核苷酸(ODN)和Alum混合后免疫BALB/c小鼠，單獨(dú)接種HbsAg為對(duì)照。免疫4周后采血，血清1∶50稀釋后，ELISA方法測(cè)定抗-HBs抗體。結(jié)果顯示(表6)，Oligo-1(5′-AACGTT-3′)、Oligo-4(5′-AACGTC-3′)、Oligo-5(5′-AGCGCT-3′)及Oligo-7(5′-GGCGTC-3′)可提高HBsAg誘生小鼠產(chǎn)生特異性抗體的佐劑作用較強(qiáng)，具有免疫佐劑作用。實(shí)施例三pYQF-hCpG/HBs免疫接種后誘生的抗體水平。
將插入乙肝病毒表面抗原編碼基因的質(zhì)粒pYQF-hCpG/HBs和pYQF/HBs分別免疫BALB/c小鼠，每個(gè)免疫組6只小鼠，每只小鼠肌肉注射50μg DNA。并設(shè)空載pYQF對(duì)照和陰性小鼠對(duì)照(各2只小鼠)。初次免疫后第4周同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。第8周時(shí)免疫血清1∶2000稀釋后，ELISA方法測(cè)定抗-HBs IgG抗體。結(jié)果顯示(圖9)，pYQF-hCpG/HBs免疫組對(duì)應(yīng)的A450為1.12±0.47(均值±SD，n＝6)，pYQF/HBs免疫組對(duì)應(yīng)的A450值為0.63±0.54(均值±SD，n＝6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CpG元件5′-AGCGCT-3′插入pYQF/HBs載體后對(duì)其誘生特異性免疫應(yīng)答的能力有一定刺激作用，pYQF-hCpG/HBs免疫小鼠后可誘生小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答，這可能與插入該載體的CpG結(jié)構(gòu)(5′-AGCGCT-3′)也具有一定的刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用有關(guān)。

圖1為載體pYQ構(gòu)建流程圖圖2為載體pYQ結(jié)構(gòu)及多克隆區(qū)示意圖圖3為載體pYQF構(gòu)建流程圖圖4為載體pYQF結(jié)構(gòu)及多克隆區(qū)示意圖圖5為pYQ系列載體誘生的抗HBs IgG抗體其中免疫血清1∶200稀釋?zhuān)珹450以平均值±SEM表示，n＝10-12。
1pYQ/HBs，0.77±0.13，n＝122pYQ-SphI-1CpG/HBs，1.17±0.20，n＝123pYQ-SphI-5CpG/HBs，1.54±0.20，n＝11
4pYQ-SacII-1CpG/HBs，1.63±0.30，n＝115pYQ-SacII-2CpG/HBs，1.37±0.22，n＝10圖6為載體Pyqf-hCpG示意圖圖7為pYQF系列載體誘生的抗-HBs IgG抗體其中終點(diǎn)稀釋滴度(1g)4.15，4.25，4.25，3.95。血清1∶2000稀釋?zhuān)蛰d免疫組和陰性小鼠血清1∶200稀釋?zhuān)珹450±SEM。
1pYQF/HBs，0.96±0.12，n＝122pYQF-1CpG/HBs，1.14±0.17，n＝123pYQF-2CpG/HBs，1.69±0.16，n＝124pCI-neo/HBs，1.49±0.12，n＝6圖8為pYQF系列載體誘生的IgG抗體亞類(lèi)，其中IgG2a/IgG11.47；2.63；2.97；0.98；0.08小鼠個(gè)數(shù)(n)12； 12； 12； 6； 6免疫血清1∶300稀釋)。圖9為質(zhì)粒Pyqf-hCpG/HBs誘生的抗-HBs IgG抗體，其中免疫血清1∶2000稀釋?zhuān)蛰d免疫組和陰性對(duì)照組血清1∶200稀釋?zhuān)珹450以均值±SEM表示。表1.各種CpG序列組合在大腸桿菌和結(jié)核桿菌基因組中出現(xiàn)的次數(shù)A
B
注大腸桿菌，E.coli K12，4639221bp結(jié)核桿菌，M.Tuberculosis H37kv，4411529bp表2.各種CpG結(jié)構(gòu)在載體中出現(xiàn)次數(shù)pYQ pYQF pCI-neo pcDNA3.1 pVR1012 pcDNA1.1 pUC19已有報(bào)道對(duì)小鼠有效5′-GACGTC-3′ 4 4 5 5 5 4 15′-GACGTT-3′ 1 0 2 2 1 0 05′-AACGTT-3′ 0 1 3 2 2 1 2對(duì)人有效5′-GTCGTT-3′ 0 0 0 3 2 0 15′-TTCGAA-3′ 0 2 1 1 0 2 0自行設(shè)計(jì)5′-AACGTC-3′ 0 1 0 0 0 1 15′-AGCGCT-3′ 0 0 0 0 0 0 05′-ATCGTC-3′ 0 0 0 1 1 0 05′-GGCGTC-3′ 0 0 0 1 0 0 05′-GTCGCT-3′ 0 1 0 0 1 1 05′-G3TCGTC-3′ 0 0 0 0 1 0 0表3.本發(fā)明設(shè)計(jì)、合成的寡核苷酸已有報(bào)道 5′-TCAA AACGTT GATG-3′5′-TCAA TTCGAA GATG-3′5′-TCAA GTCGTT GATG-3′自行設(shè)計(jì) 5′-TCAA AACGTC GATG-3′5′-TCAA AGCGCT GATG-3′5′-TCAA ATCGTC GATG-3′5′-TCAA GGCGTC GATG-3′5′-TCAA GTCGCT GATG-3′5′-TCAA GTCGTC GATG-3′陰性對(duì)照 5′-TCAA TTGCAA GATG-3′5′-TCAA AAGCTT GATG-3′表4 CpG ODN刺激人PBMC增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)cpm(均值±SD) 刺激指數(shù)(SI)已有報(bào)道1.5′-AACGTT-3′ 2155±160 3.32.5′-TTCGAA-3′ 612±45 0.53.5′-GTCGTT-3′ 1191±100 1.9自行設(shè)計(jì)4.5′-AACGTC-3′ 2182±109 4.35.5′-AGCGCT-3′ 2241±121 4.46.5′-ATCGTC-3′ 912±88 1.27.5′-GGCGTC-3′ 811±72 1.08.5′-GTCGCT-3′ 748±61 0.89.5′-GTCGTC-3′ 796±70 0.9對(duì)照組ConA 7772±1991 17.0Medium 414±64 010.5′-TTGCAA-3′ 633±81 0.5表5.HBsAg刺激免疫小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4情況免疫組 IFN-γ(pg/ml) IL-4(pg/ml)PYQF/S 9520 NPYQF-1CpG/S 8145 NPYQF-2CpG/S 8509 NpCI-neo/S 5730 NHBsAg 1930 N陰性小鼠 187 N培養(yǎng)基對(duì)照 N NnELISA方法未能檢測(cè)出該細(xì)胞因子；(加強(qiáng)后第6周)表6.HBsAg+CpG ODN免疫小鼠后誘生的抗體水平免疫組 IgGHbsAg+5′-AACGTC-3′ 0.57±0.13HbsAg+5′-AGCGCT-3′ 0.76±0.39HbsAg+5′-GGCGTC-3′ 0.59±0.25HbsAg+5′-GTCGTC-3′ 0.30±0.03HbsAg+5′-AACGTT-3′ 0.74±0.40HbsAg+5′-AAGCTT-3′ 0.32±0.15HBSAg+Alum 1.44±0.58HBSAg alone 0.26±0.01注圖中數(shù)據(jù)為A450±SD，免疫血清1∶50稀釋?zhuān)琻＝4
權(quán)利要求
1.一種新型的可適合于人體內(nèi)使用的DNA疫苗用載體，其特征在于由真核表達(dá)調(diào)控元件、質(zhì)粒復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)、抗生素抗性基因、可有效刺激人免疫系統(tǒng)的免疫刺激元件及外源蛋白編碼基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的DNA疫苗用載體，其特征在于其中的真核表達(dá)調(diào)控必需元件為CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、BGH轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的DNA疫苗用載體，其特征在于其中的抗生素抗性基因?yàn)榭敲顾乜剐曰颉?br>4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的DNA疫苗用載體，其特征在于其中的可有效刺激人免疫系統(tǒng)的免疫刺激元件為具有5′-AGCGCT-3′、5′-AACGTC-3′結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1和4所述的DNA疫苗用載體，其特征在于所述的可有效刺激人免疫系統(tǒng)的寡核苷酸，它們?cè)诖竽c桿菌和結(jié)核桿菌基因組中以小于1500次的低頻率出現(xiàn)、在已有真核表達(dá)載體中缺如。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1和4所述的DNA疫苗用載體，其特征在于所述的可有效刺激人免疫系統(tǒng)的寡核苷酸，采用了人外周血淋巴細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)進(jìn)行篩選。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1和4所述的DNA疫苗用載體，其特征在于所述的可有效刺激人免疫系統(tǒng)的寡核苷酸，與蛋白抗原同時(shí)使用可提高誘生小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力，可作為免疫佐劑、用于疾病的預(yù)防和治療。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的DNA疫苗用載體，其特征在于與有效刺激人免疫系統(tǒng)的寡核苷酸同時(shí)使用的蛋白抗原為乙肝病毒表面抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的DNA疫苗用載體，其特征在于其中的外源蛋白編碼基因?yàn)閬?lái)自微生物(細(xì)菌或病毒)的蛋白編碼基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1和9所述的DNA疫苗用載體，其特征在于其中的外源蛋白編碼基因?yàn)橐腋尾《颈砻婵乖幋a基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的DNA疫苗用載體，其特征在于接種機(jī)體后可誘生特異性細(xì)胞和體液免疫，具有預(yù)防或治療疾病的作用。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域：
,是一種新型的可適合于人體內(nèi)使用的DNA疫苗用載體,由CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、BGH轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、多克隆位點(diǎn)、卡那霉素抗性基因、可有效刺激人免疫系統(tǒng)的免疫刺激元件及外源蛋白編碼基因組成?？捎行Т碳と嗣庖呦到y(tǒng)的免疫刺激元件為具有5′－AGCGCT－3′、5′－AACGTC－3′結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。DNA疫苗用載體接種機(jī)體后可誘生有效的特異性細(xì)胞和體液免疫;可有效刺激人免疫系統(tǒng)的寡核苷酸與蛋白抗原同時(shí)使用可提高誘生特異性細(xì)胞和體液免疫的能力。兩者均可用于疾病的預(yù)防或治療。本發(fā)明也涉及所述DNA疫苗用載體及可有效刺激人免疫系統(tǒng)的寡核苷酸的構(gòu)建及篩選方法。
文檔編號(hào)C12N15/31GKCN1382492SQ01105250
公開(kāi)日2002年12月4日 申請(qǐng)日期2001年1月18日
發(fā)明者袁正宏, 邱海軍, 聞?dòng)衩?申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan