專利名稱:染色體上fadR基因被敲除的微生物以及通過該突變體發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法
發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物及通過用該微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
更具體地，本發(fā)明涉及能夠高產(chǎn)L-蘇氨酸的突變微生物，其染色體上的fadR基因已經(jīng)通過使用位點特異性的同源重組系統(tǒng)如cre基因和loxp位點被“敲除”，這樣在L-蘇氨酸的生物合成期間aceBAK操縱子的表達就不會受到部分抑制，本發(fā)明還涉及通過用該突變體發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
現(xiàn)有技術(shù)的描述L-蘇氨酸是一種必需氨基酸，被廣泛的用作飼料和食品的添加劑，還被用于藥物以及合成某些藥品的原料。它已經(jīng)通過用埃希氏菌屬(Escherichia)、棒狀桿菌屬(Corgneform bateria)、沙雷氏菌屬(seratia)和普羅威登斯菌屬(Providencia)的人工突變體發(fā)酵生產(chǎn)得到。例如，日本專利公開號S56-10037公開了使用埃希氏菌屬菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該菌株需要營養(yǎng)物質(zhì)二氨基庚二酸(diaminopimeric acid)和蛋氨酸，且在蘇氨酸生物合成系統(tǒng)中具有抗蘇氨酸反饋抑制的能力。日本專利特許公開號S58-224684公開了用短桿菌屬(Brevibacterium)菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該菌株具有抗S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和α-氨基-β-羥基戊酸的能力，其需要營養(yǎng)物質(zhì)L-異亮氨酸和L-賴氨酸。韓國專利申請?zhí)卦S公開號87-8022公開了用必需蛋氨酸的、抗α-氨基-β-羥基戊酸的埃希氏菌屬菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該菌株還對至少一種選自利福平、賴氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸和高絲氨酸的物質(zhì)具有抗性作用，其對L-蘇氨酸的分解能力減小。日本專利申請?zhí)卦S公開號H2-219582公開了用普羅威登斯菌屬菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該菌株對α-氨基-β-羥基戊酸、L-乙硫氨酸、硫異亮氨酸、羥基硫氨素和磺胺胍具有抗性作用，需要營養(yǎng)物質(zhì)為L-亮氨酸，及不嚴(yán)格地需要L-異亮氨酸。
然而，上述已知方法存在L-蘇氨酸產(chǎn)量不高或者需要加入成本較高的物質(zhì)如二氨基庚二酸(diaminopimeric)和異亮氨酸作為必需營養(yǎng)物的缺點。換句話說，應(yīng)用必需二氨基庚二酸(diaminopimeric)的菌株包含額外的二氨基庚二酸(diaminopimeric)發(fā)酵過程，這樣就增加了L-蘇氨酸的生產(chǎn)成本。對于應(yīng)用需要營養(yǎng)物質(zhì)異亮氨酸的菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸的情況來說，需要向發(fā)酵介質(zhì)中加入昂貴的異亮氨酸，因而增加了成本。
為了克服這些缺陷，本發(fā)明人開發(fā)了一種生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌(Escherichia coli)菌株，該菌株具有抗L-蛋氨酸、L-蘇氨酸和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸的作用，必需營養(yǎng)物蛋氨酸及不嚴(yán)格地需要異亮氨酸，而且用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸比現(xiàn)有菌株的產(chǎn)率更高。該菌株以及用所述菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法已經(jīng)在韓國被授予專利權(quán)，韓國專利公開號92-8365。
本發(fā)明人繼續(xù)研究以開發(fā)具有更高L-蘇氨酸產(chǎn)率的菌株，研究焦點在于脂肪酸分解相關(guān)操縱子(fad操縱子)和乙醛酸支路操縱子(aceBAK操縱子)表達的調(diào)控因子-fadR基因。眾所周知，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的濃度較高時，F(xiàn)adR蛋白抑制fad操縱子和aceBAK操縱子的表達，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的濃度較低時FadR蛋白增加脂肪酸生物合成相關(guān)操縱子的表達(J.E.Cronan Jr.和D.Lapore，E.coli and Salmonella，Vol 1，pp 211-214)。AceBAK操縱子參與由丙酮酸生物合成草酰乙酸的過程該過程包括檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))的中間體異檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙醛酸、乙醛酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸和蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的過程。同時，檸檬酸循環(huán)還通過八(8)通路參與丙酮酸生物合成草酰乙酸，且在此過程中，中間體被轉(zhuǎn)化為其它代謝中間體包括二氧化碳。在這種情況下，當(dāng)aceBAK操縱子的表達減少時，乙醛酸循環(huán)則受到抑制，因而增加了碳源通過檸檬酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為其它代謝中間體的轉(zhuǎn)化率，導(dǎo)致等量碳源生產(chǎn)L-蘇氨酸的產(chǎn)量的降低。
因此，為了開發(fā)出能夠通過增加aceBAK表達而生產(chǎn)高濃度L-蘇氨酸的菌株，必須將fadR基因敲除。
另外，當(dāng)抗生素標(biāo)記整合到染色體中之后，該標(biāo)記就不能再用于敲除另一個基因。因此還要求將標(biāo)記從染色體上除去，因而本發(fā)明人將位點特異性重組系統(tǒng)cre/loxp應(yīng)用于fadR基因的敲除。
發(fā)明概述本發(fā)明人通過敲除菌株染色體上fadR基因而開發(fā)出一種高產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株，并通過用所述菌株發(fā)酵成功的獲得顯著提高的L-蘇氨酸的產(chǎn)率。
首先，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物，該微生物染色體上的fadR被敲除。
第二，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物的方法，包括構(gòu)建fadR基因或其DNA片段的敲除盒，將該構(gòu)建物導(dǎo)入提到的生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物中，使該外來構(gòu)建物與該微生物染色體上的fadR基因進行重組，并篩選fadR基因被敲除的突變微生物。
第三，本發(fā)明提供一種通過發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，包括培養(yǎng)染色體上fadR基因被敲除的微生物，及純化培養(yǎng)物中的L-蘇氨酸。
第四，本發(fā)明提供fadR或其DNA片段的敲除盒，該盒通過將兩端側(cè)翼連接loxp位點的抗生素標(biāo)記插入fadR基因而構(gòu)建，而loxp位點用于由表達編碼loxp位點特異性重組酶的cre基因而去除整合突變體的染色體上的抗生素標(biāo)記。
附圖的簡要說明
圖1描述了本發(fā)明的重組質(zhì)粒pT7Blue/fadR的構(gòu)建。
圖2描述了由重組質(zhì)粒pT7fadR∷loxpcat構(gòu)建DNA片段ΔfadR∷loxpcat。
圖3通過DNA印跡分析顯示本發(fā)明的fadR基因的染色體重組。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，用于發(fā)酵的微生物表征為fad操縱子和aceBAK操縱子表達的調(diào)控因子fadR基因被敲除。具體地，本發(fā)明應(yīng)用該突變微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸，該微生物染色體上的fadR基因已經(jīng)通過同源重組被敲除，這樣aceBAK操縱子的表達就不會受到fadR蛋白的抑制，而在L-蘇氨酸的生物合成中有利地進行。
一些具有生產(chǎn)L-蘇氨酸能力的原核和真核微生物可以用于本發(fā)明。合適微生物的代表性實例包括但不限于屬于埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、沙雷氏菌屬和普羅威登斯菌屬的菌株，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用這些菌屬菌株的發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，微生物包括但不限于生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株，該菌株抗L-蛋氨酸、L-蘇氨酸、和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸，并且需要營養(yǎng)物質(zhì)蛋氨酸，不嚴(yán)格地需要異亮氨酸。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，微生物包括突變體，在該突變體中，除了含有編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)和蘇氨酸操縱子所包含的酶類的內(nèi)源基因外，至少一個拷貝的選自外源ppc基因和蘇氨酸操縱子所包含的thrA、thrB以及thrC基因的基因被另外引入染色體DNA中。
位于生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物的染色體上的fadR基因的敲除可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的合適的敲除突變技術(shù)實現(xiàn)。此處所述的“敲除突變”指在體外以遺傳工程破壞天然染色體DNA，一般在蛋白質(zhì)編碼區(qū)，從而使能夠方便地但非必須地提供顯性選擇性標(biāo)記的外來DNA片段被插入到天然序列中。在蛋白編碼區(qū)進行敲除突變可以防止野生型蛋白的表達，而這常導(dǎo)致喪失該蛋白正常功能。
敲除的操作步驟可以通過將敲除盒與能夠攝取DNA的生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物的培養(yǎng)物進行混和而進行。
由于微生物可以自然地被轉(zhuǎn)化，因此優(yōu)選通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ辜?xì)胞具備DNA攝取功能(參見例如LeBlanc等的Plasmid 28，130-145，1992；Pozzi等的J.Bacteriol.178，6087-6090，1996)?！扒贸小敝妇哂型鈦鞤NA片段的天然染色體DNA片段，該外來DNA片段可以提供選擇性的標(biāo)記。在一個實施方案中，“敲除突變盒”通過用外來DNA序列斷開基因組DNA片段，并以敲除盒置換野生型染色體序列拷貝實現(xiàn)。在該實施方案中，敲除流程包括將外來DNA片段克隆到目標(biāo)DNA中，以使含有目標(biāo)位點DNA的“尾”保留敲除盒的5’和3’端。該尾巴至少具有50個堿基對，優(yōu)選多于200至500個堿基對，以產(chǎn)生高效的重組和/或基因轉(zhuǎn)換。為方便起見，克隆至目標(biāo)DNA的外來基因也提供選擇性的標(biāo)記，例如，抗生素抗性基因。目標(biāo)DNA上插入抗生素抗性基因后，轉(zhuǎn)化株的篩選在含有適量的合適抗生素的瓊脂平板上進行。轉(zhuǎn)化后，部分?jǐn)z取了敲除盒的細(xì)胞將在盒的基因組DNA尾部進行同源重組或者基因轉(zhuǎn)換，結(jié)果使野生型基因組序列被敲除盒所置換。敲除重組的發(fā)生可以很容易地通過例如DNA印跡雜交或更方便地通過PCR進行鑒定。
在一個實施方案中，本發(fā)明的敲除突變包括以下步驟從具有生產(chǎn)L-蘇氨酸的能力的菌株中分離基因組DNA，以基因組DNA為模板，用常規(guī)技術(shù)進行PCR以擴增fadR基因，從而獲得PCR擴增產(chǎn)物，將fadR基因克隆至合適的質(zhì)?；蚱渌d體，所得重組載體通過轉(zhuǎn)導(dǎo)被引入宿主細(xì)胞例如大腸桿菌。轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基中生長增生后，將帶有fadR基因的重組載體提取出來。將抗生素抗性基因片段插入提取的載體的fadR基因中，構(gòu)建成敲除重組載體，該敲除重組載體通過轉(zhuǎn)化被引入宿主細(xì)胞，將宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。然后，將增殖的重組載體從所得的轉(zhuǎn)化株中分離出來，經(jīng)過合適的限制性酶處理獲得fadR基因的敲除盒片段。然后，通過常規(guī)的技術(shù)例如電穿孔將該片段導(dǎo)入能夠生產(chǎn)L-蘇氨酸的宿主中。結(jié)果，通過抗生素抗性分離出在反復(fù)生長中獲得具有敲除fadR基因特征的宿主，宿主染色體上的野生型fadR基因已被含抗生素標(biāo)記的fadR基因取代。
熟練的技術(shù)人員都知道本發(fā)明的敲除盒和DNA節(jié)段或其片段可以通過一般的克隆方法制得。優(yōu)選用針對此處公開的任何序列的任何合適區(qū)域的寡核苷酸引物的PCR擴增方法。PCR擴增的方法在本領(lǐng)域廣為人知。參見例如PCRProtocolsA Guide to Method and Application，Ed.M.Innis等，AcademicPress(1990)或美國專利號4889818，此處引用作為參考。PCR包括基因組DNA、合適的酶、引物和緩沖液，并在DNA熱循環(huán)儀中方便地進行(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，Conn.USA)。陽性PCR結(jié)果可以通過例如進行瓊脂糖凝膠電泳后檢測合適大小的DNA片段而鑒定。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明應(yīng)用生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株作為生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物，該菌株抗L-蛋氨酸、L-蘇氨酸和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸，并需要營養(yǎng)物質(zhì)蛋氨酸，及不嚴(yán)格地需要異亮氨酸。
L-蛋氨酸類似物包括但不限于D，L-乙硫氨酸、正亮氨酸、α-甲基蛋氨酸和L-蛋氨酸-D，L-硫代亞胺。L-蘇氨酸類似物包括但不限于α-氨基-β-羥基戊酸和D，L-蘇氨酸hydroxamate。
L-賴氨酸類似物包括但不限于S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-賴氨酸。
在特別優(yōu)選定實施方案中，本發(fā)明應(yīng)用新的大腸桿菌突變體KCCM 10236作為生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物，該突變體染色體的fadR基因已被敲除，該突變體比其母菌株KCCM10236具有更高的L-蘇氨酸生產(chǎn)力。該突變體通過電穿孔將敲除盒ΔfadR∷loxpcat轉(zhuǎn)化至大腸桿菌KCCM10236而制得，該菌株抗L-蛋氨酸、L-蘇氨酸和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸，并需要營養(yǎng)物質(zhì)蛋氨酸，及不嚴(yán)格地需要異亮氨酸。敲除盒ΔfadR∷loxpcat被從重組質(zhì)粒構(gòu)建物pT7fadR∷loxpcat中切出，該pT7fadR∷loxpcat由重組質(zhì)粒構(gòu)建物pT7blue/fadR衍生而來。該新的突變體被稱為大腸桿菌(Escherichia coli)FTR1201，并根據(jù)布達佩斯條約于2002年9月13日保藏于韓國微生物保藏中心，登記號為KCCM-10422。
大腸桿菌KCCM10236由大腸桿菌KCCM TF4076(KFCC 10718)突變而來，后者需要營養(yǎng)物質(zhì)蛋氨酸并抗L-蘇氨酸類似物(例如，α-氨基-β-羥基戊酸)、L-賴氨酸類似物(例如，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)、L-異亮氨酸類似物(例如，α-氨基丁酸)、蛋氨酸類似物(例如，乙硫氨酸)等。
大腸桿菌KCCM TF4076已在韓國專利公開號92-8365中進行描述，此處引用作為參考。大腸桿菌KCCM10236與大腸桿菌KCCM TF4076的不同點在于其具有兩個磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因和兩個L-蘇氨酸(thr)操縱子。源于大腸桿菌KCCM TF4076染色體的ppc基因和thr操縱子通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行擴增并另外整合到大腸桿菌KCCM TF4076中而生成大腸桿菌KCCM10236。
ppc基因催化磷酸烯醇丙酮酸形成草酰乙酸。這樣，磷酸烯醇丙酮酸就是蘇氨酸生物合成通路中間體的草酰乙酸的前體。因此大腸桿菌KCCM 10236的特征在于其可以增強ppc基因以及涉及從天門冬氨酸生物合成蘇氨酸的三個基因thrA、thrB和thrC的表達，這些基因分別編碼天門冬氨酸激酶、I/高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合成酶，從而提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量。
基因組DNA從大腸桿菌KCCM 10236中提取得到。以基因組DNA為模板對fadR基因進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物上樣于瓊脂糖凝膠進行電泳。這樣將分離得到的fadR基因或DNA片段克隆到合適的載體。將產(chǎn)生抗生素抗性的基因DNA片段插入到所構(gòu)建的重組載體上的fadR基因區(qū)域來誘導(dǎo)fadR基因的敲除。
包括抗生素抗性DNA片段的敲除fadR基因盒從所得重組載體上分離出來。將分離得到的敲除fadR基因盒通過常規(guī)方法如電穿孔轉(zhuǎn)化到生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物如大腸桿菌KCCM 10236，從而獲得具有高產(chǎn)L-蘇氨酸能力的突變菌株。
在敲除fadR基因或其片段的制備中用到的術(shù)語“載體”是指能夠攜帶外來fadR基因或其DNA片段的核酸分子，該載體被連接在fadR基因或其DNA片段上并能將其引入宿主細(xì)胞中。載體的實例有天然來源或重組合成的質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體。利用本發(fā)明的染色體上fadR基因被敲除的生產(chǎn)L-蘇氨酸的突變微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸，可以用普通培養(yǎng)宿主細(xì)胞例如細(xì)胞和酵母的方法進行。作為生產(chǎn)L-蘇氨酸培養(yǎng)基，只要含有適當(dāng)?shù)奶荚?、氮源、無機物質(zhì)和微量菌株必需的營養(yǎng)，任何合成的培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基都可以被應(yīng)用。
碳源的實例包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、乳糖、糖漿、纖維素水解物、粗制砂糖水解物和淀粉水解物，有機酸例如丙酮酸、乙酸、富馬酸、蘋果酸和乳酸，以及醇類如甘油和乙醇。氮源的實例包括氨、各種無機鹽(例如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨)，有機酸的銨鹽、胺、蛋白胨、肉類提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、豆餅水解物，各種發(fā)酵的細(xì)胞或其被消化的物質(zhì)。
無機物質(zhì)的實例包括KH2PO4，K2HPO4，MgCl2，NaCl，F(xiàn)e3(SO4)2，MgSO4，CuSO4，CaCl2和CaCO3。
培養(yǎng)在有氧的環(huán)境下進行，例如在有氧的條件下進行震蕩培養(yǎng)或自旋器培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度在20-40℃范圍內(nèi)，優(yōu)選28-37℃。培養(yǎng)基的pH范圍為pH5-9，優(yōu)選中性左右條件。pH通過用碳酸鈣、有機或無機酸、堿液、銨、pH緩沖液等進行調(diào)節(jié)。
通常，經(jīng)過1-7d的培養(yǎng)即可在培養(yǎng)物中形成和富集L-蘇氨酸?？蛇x的培養(yǎng)過程包括例如任何連續(xù)的操作或半連續(xù)操作以及分批操作。
培養(yǎng)完成后，除掉培養(yǎng)物中的沉降物例如細(xì)胞，結(jié)合使用離子交換色譜、濃縮、除鹽等方法可以回收出L-蘇氨酸。例如，通過以下方法從培養(yǎng)液中回收L-蘇氨酸除去培養(yǎng)液中的細(xì)胞，用鹽酸調(diào)節(jié)至pH2，然后通過強酸離子交換樹脂，吸附物用稀氨水進行洗脫，蒸餾除去氨，濃縮殘留液。然后濃縮物中加入乙醇，然后冷卻形成晶體，收集晶體即得L-蘇氨酸。
現(xiàn)在通過一些具體的實施例對本發(fā)明進行說明，但這不能被認(rèn)為是限定。
實施例1構(gòu)建重組質(zhì)粒以及敲除fadR基因應(yīng)用QIAGEN Genomic-tip系統(tǒng)從生產(chǎn)蘇氨酸的大腸桿菌KCCM10236菌株中提取基因組DNA。將包括fadR基因的ORF(開放讀框)的DNA片段(約0.8kb)用提取的基因組DNA作模板和一對寡核苷酸5’-TCG CGG AAG AGT ACA TTATTG-3’(正向引物)和5’-ATC GGC GCA AAG AAG TCC-3’(反向引物)通過PCR進行擴增。PCR進行30次循環(huán)，各包括依次的在94℃下變性30秒，在55℃退火30秒和在72℃擴增60秒。
將PCR產(chǎn)物上樣于1.0％瓊脂糖凝膠進行電泳。從凝膠上切下0.8kb的fadR基因條帶進行洗脫。將所得的fadR基因連接到克隆載體pT7Blue(Novagen Inc.USA)的EcoRV位點上于16℃過夜，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pT7Blue/fadR(參見圖1)。將所得質(zhì)粒構(gòu)建物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌NM522。轉(zhuǎn)化的菌株涂布在含50mg/L的羧芐青霉素的固體培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)過夜。
用鉑環(huán)挑取形成的克隆并轉(zhuǎn)接至3ml含羧芐青霉素的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)過夜后，用QIAGEN Mini Prep Kit從培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。所提取的質(zhì)粒DNA用限制酶SacII消化，確定fadR基因已被克隆。已確認(rèn)的質(zhì)粒pT7Blue/fadR基因用SacII進行切割，如此形成的DNA片段于0.8％的瓊脂糖凝膠進行電泳。從凝膠上切下約3.8kb條帶進行洗脫。將該3.8kb的DNA片段通過Klenow酶處理進行末端平端化。將所得DNA片段與包括loxp區(qū)的約1.1kb的氯霉素抗性基因片段進行平端連接，后者由HincII限制酶消化質(zhì)粒ploxpcat2(Gosset等人，A family of removable cassettes designed to obtain Al-resistance-freegenomic modification of E.coli，Gene 247，pp255-264)得到，從而構(gòu)建得到約5.0kb的重組質(zhì)粒pT7ΔfadR∷loxpcat(見圖2)。
將重組質(zhì)粒pT7ΔfadR∷loxpcat轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522。將所得轉(zhuǎn)化株在含50mg/L的羧芐青霉素和15mg/L氯霉素的固體培養(yǎng)基板上劃線培養(yǎng)，于32℃培養(yǎng)過夜。用鉑環(huán)挑取克隆并轉(zhuǎn)接至3ml含羧芐青霉素和氯霉素的液體培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)過夜后，用QIAGEN Mini Prep Kit提取質(zhì)粒DNA。將提取的質(zhì)粒DNA用KpnI和PstI限制酶消化，如此形成的DNA片段于0.7％瓊脂糖凝膠進行電泳。從凝膠中切下約2.2kb條帶進行洗脫(見圖2)。將所得的約2.2kbDNA片段ΔfadR∷loxpcat通過電穿孔轉(zhuǎn)化至大腸桿菌KCCM 10236中，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌KCCM 10236在含氯霉素的瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。將篩選的克隆產(chǎn)物于燒瓶中進行L-蘇氨酸生產(chǎn)試驗。
實施例2利用篩選的菌株在錐形瓶中生產(chǎn)L-蘇氨酸將從實施例1中篩選的三十個克隆產(chǎn)物于載有下表1所示的蘇氨酸滴定培養(yǎng)基(threonine titration medium)的錐形瓶中進行培養(yǎng)，并將L-蘇氨酸產(chǎn)物進行對比。
表1
每個克隆產(chǎn)物在LB瓊脂培養(yǎng)基上于32℃震搖培養(yǎng)。
用鉑環(huán)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到25ml滴定培養(yǎng)基中并于32℃和250/min的條件下進行震搖培養(yǎng)48h。滴定結(jié)果見下表2。
表2
從結(jié)果可以看出本發(fā)明的轉(zhuǎn)化株的L-蘇氨酸產(chǎn)量約24-25g/L。因此，本發(fā)明的fadR基因被敲除的轉(zhuǎn)化大腸桿菌KCCM10236比原型菌株KCCM 10236的23g/L L-蘇氨酸的產(chǎn)量更高。而且，可以觀測出本發(fā)明轉(zhuǎn)化的微生物與原型菌株相比發(fā)酵培養(yǎng)基的L-蘇氨酸的產(chǎn)出提高達約8％。其中一個菌株被稱為大腸桿菌FTR1201(KCCM-10422)。
實施例3通過DNA印跡確證fadR基因被敲除。
通過Southern印跡確證fadR基因是否已經(jīng)從選自實施例2的菌株中被敲除。將原型菌株KCCM10236和本發(fā)明的菌株FTR1201在3ml含氯霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。用QIAGEN基因組Kit20從培養(yǎng)物中提取基因組DNA。
將提取的基因組DNA用XmnI限制酶切割過夜。在0.7％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離合適大小的產(chǎn)物DNA片段。電泳完成后，瓊脂糖凝膠中DNA分子通過毛細(xì)轉(zhuǎn)移法(Molecular Cloning vol.1.pp6.31-6.38)轉(zhuǎn)移至尼龍膜上(YOUNG Sci.Biodyne B Membrane)。將膜干燥，DNA分子通過UV照射(120mJ/cm2，SpectroLinkerTM)被固定在干燥的膜上。
將該膜用預(yù)雜交溶液I(#1093657)在55℃下處理2h。加入變性DNA探針后，在55℃的烘箱(BAMBINO230300)中雜交過夜。
所用變性DNA探針的生產(chǎn)方法如下用HincII限制酶消化分離的質(zhì)粒ploxpcat2，通過QIAGEN Kit獲得約1.1kb的含loxp區(qū)的氯霉素抗性基因DNA片段。所得DNA片段于100℃水浴加熱5min，立即在冰上冷卻5min即得單鏈DNA分子，用DIG標(biāo)記和檢測試劑盒(Roche #1093657)在37℃下將其進行DIG標(biāo)記，即制得DIG-UDP標(biāo)記的DNA探針。
雜交完成以后，用洗滌溶液I和II(Roche #1093657)除去膜上非特異雜交的DNA分子。室溫下在膜上覆蓋一層預(yù)雜交緩沖液2(Roche #1093657)保持30min，將膜于室溫下與能與DIG-UTP特異結(jié)合的抗-DIG抗體反應(yīng)30min。
用洗滌液III(Roche #1093657)將與膜非特異結(jié)合的抗-DIG抗體除去，用上述標(biāo)記和檢測試劑盒(Roche #1093657)將膜進行染色處理(chromatized)以將條帶顯示出來。用FLA-5000成像系統(tǒng)(FUJIFLIM)對圖像進行掃描。結(jié)果見附圖3。原型菌株KCCM 10236(第3泳道)沒有顯示出條帶，因為其不具備氯霉素抗性基因。相比之下，本發(fā)明菌株FTR1201(KCCM 10422)(第2泳道)顯示出預(yù)期的約2.8kb的條帶。據(jù)悉該條帶包括1.7kb長度的fadR基因和約1.1kb的氯霉素抗性基因DNA片段。
實施例4在發(fā)酵槽中生產(chǎn)L-蘇氨酸在5L的發(fā)酵槽中用本發(fā)明的菌株FTR1201(KCCM-10422)生產(chǎn)L-蘇氨酸，將其與原型菌株KCCM 10236進行比較。接種培養(yǎng)基的成分見下表3。
表3
在LB培養(yǎng)基中補充10g/L的葡萄糖和0.1g/L的L-蛋氨酸，作為種子培養(yǎng)基。將發(fā)酵槽中初始接種體積調(diào)節(jié)為起始培養(yǎng)基的3％至5％。在葡萄糖的耗盡點補充葡萄糖共6次。每次補充后，葡萄糖的濃度為5％。在補充葡萄糖時，同時加入1％重量的單鉀磷酸鹽(KH2PO4)。起始和終止培養(yǎng)物體積分別為1.5L和3.0L，至發(fā)酵結(jié)束時所有加入的葡萄糖的濃度為250g/L。發(fā)酵在以0.5vvm流速通氧、1000rpm轉(zhuǎn)速攪拌和32℃溫度條件下進行90小時。pH通過自動進氣口通入25％至28％的氨氣進行調(diào)節(jié)使其維持在7.0。
結(jié)果見下表4。
表4
原型菌株10236生產(chǎn)出93.5g/L的L-蘇氨酸，以消耗的葡萄糖計算產(chǎn)率為37.4％。相比之下，本發(fā)明菌株FTR1201生產(chǎn)出102g/L的L-蘇氨酸，以消耗的葡萄糖計算產(chǎn)率為41％，因此與原型菌株相比L-蘇氨酸的產(chǎn)率增加了約9％。
本發(fā)明的fadR基因被敲除的生產(chǎn)L-蘇氨酸的突變微生物提高了L-蘇氨酸的產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-蘇氨酸的突變微生物，其特征在于其染色體上存在的fadR基因被敲除。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的突變微生物，其為大腸桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的突變微生物，其抗L-蛋氨酸、L-蘇氨酸和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸，且需要營養(yǎng)物質(zhì)蛋氨酸，及不嚴(yán)格地需要異亮氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的突變微生物，其染色體DNA含有下列基因的至少一個額外拷貝ppc基因和包含于蘇氨酸操縱子的thrA、thrB以及thrC基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1至4任意一項的突變微生物，其為大腸桿菌FTR1201(KCCM-10422)。
6.開發(fā)生產(chǎn)L-蘇氨酸的突變微生物的方法，其包括構(gòu)建fadR基因或其DNA片段的敲除，將該DNA構(gòu)建物導(dǎo)入指定的生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株以使外來DNA構(gòu)建物與該微生物染色體上存在的fadR基因進行同源重組，和篩選fadR基因被敲除的突變微生物。
7.fadR基因或其DNA片段的敲除盒，其特征在于將抗生素標(biāo)記插入fadR基因使其被敲除。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的盒，其中被敲除的fadR基因盒的DNA片段為ΔfadR∷loxpcat。
9.生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求
1的突變微生物以及從培養(yǎng)物中分離L-蘇氨酸。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L－蘇氨酸的微生物，特征在于其染色體上的fadR基因被敲除；以及一種應(yīng)用所述突變微生物生產(chǎn)L－蘇氨酸的方法。本發(fā)明的突變微生物提高了L－蘇氨酸的產(chǎn)量。
文檔編號C12R1/19GKCN1500863SQ200310113870
公開日2004年6月2日 申請日期2003年10月10日
發(fā)明者樸永薰, 李珍鎬, 李炳春, 金大哲, 趙載熔 申請人:第一制糖株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan