一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物基因工程領(lǐng)域中的基因敲除技術(shù)，特別涉及一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法，（a）構(gòu)建適用于幽門螺桿菌的敲除模板質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒；（b）設(shè)計(jì)目的基因同源重組雙交換同源臂，在敲除模板質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建目的基因敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入幽門螺桿菌中得到基因敲除突變株；（c）將輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上步驟得到的基因敲除突變株中，去除抗性基因，得到攜帶輔助質(zhì)粒的無痕基因敲除突變株；（d）輔助質(zhì)粒通過無抗生素傳代培養(yǎng)消除，最終獲得無痕基因敲除突變株。本發(fā)明，實(shí)現(xiàn)了幽門螺桿菌中無痕基因敲除突變株的構(gòu)建，相比普通的基因敲除，該方法在實(shí)現(xiàn)目的基因敲除的同時(shí)不引入外源基因，使對目的基因的功能分析更為準(zhǔn)確。
【專利說明】
一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及微生物基因工程領(lǐng)域中的基因敲除技術(shù)，特別涉及一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]幽門螺桿菌(/fe2ico/7acier pylori,H.是感染胃部的最常見的病原性細(xì)菌，幽門螺桿菌感染是慢性胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍等胃腸道疾病發(fā)生的重要病因，并與胃癌、胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。幽門螺桿菌的全世界感染率為50%-80%，高發(fā)地區(qū)集中在東亞，包括中國、日本和韓國。我國是胃癌發(fā)病率和病死率較高的地區(qū)，每年全球新發(fā)100余萬胃癌患者中，我國占42%，約80萬死亡胃癌患者中，我國占35%，發(fā)病率和病死率均超過世界平均水平兩倍多。目前一般認(rèn)為，幽門螺桿菌通過黏附定植于胃黏膜，釋放毒力因子，與宿主細(xì)胞相互作用產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致慢性炎癥、潰瘍、癌癥等臨床結(jié)果。多種致病因子參于了幽門螺桿菌的致病過程，對致病因子的深入研究大大促進(jìn)了我們對幽門螺桿菌致病機(jī)制的了解。然而迄今為止，幽門螺桿菌的致病機(jī)理仍不完全明確，而幽門螺桿菌感染導(dǎo)致的多樣化感染結(jié)局更不清楚。一些潛在的致病因子或功能基因仍有待于進(jìn)一步發(fā)掘來不斷完善對幽門螺桿菌致病機(jī)制的認(rèn)識。
[0003]基因操作是研究基因功能最直接和最有效的技術(shù)手段，經(jīng)過多年技術(shù)積累，幽門螺桿菌的基因操作技術(shù)得到深入發(fā)展。轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)被應(yīng)用在幽門螺桿菌致病因子的早期研究中。由于轉(zhuǎn)座子插入突變具有隨機(jī)性和極性效應(yīng)的劣勢，逐漸被基于同源重組的基因敲除方法所取代。幽門螺桿菌中大量致病因子的功能借助同源重組基因敲除的方法得以闡明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明構(gòu)建了一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法，與普通的同源重組基因敲除方法相比，在實(shí)現(xiàn)目的基因敲除的同時(shí)不引入外源基因，使得對目的基因的功能分析更為準(zhǔn)確。
[0005]本發(fā)明一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法，包括如下步驟:
(a)構(gòu)建適用于幽門螺桿菌的帶有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性敲除模板質(zhì)粒和表達(dá)FLP重組酶的氯霉素抗性輔助質(zhì)粒；
(b)設(shè)計(jì)目的基因同源重組雙交換同源臂，在敲除模板質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建目的基因敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入幽門螺桿菌中得到帶有FRT位點(diǎn)和卡那霉素抗性的基因敲除突變株；
(C)將表達(dá)FLP重組酶的氯霉素抗性輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上步驟得到的基因敲除突變株中，去除FRT位點(diǎn)之間的卡那霉素抗性基因，得到攜帶輔助質(zhì)粒的無痕基因敲除突變株；
(d)輔助質(zhì)粒通過無抗生素傳代培養(yǎng)消除，最終獲得無痕基因敲除突變株。
[0006]本發(fā)明，實(shí)現(xiàn)了幽門螺桿菌中無痕基因敲除突變株的構(gòu)建，相比普通的基因敲除，該方法在實(shí)現(xiàn)目的基因敲除的同時(shí)不引入外源基因，使對目的基因的功能分析更為準(zhǔn)確。此方法不僅可以用于幽門螺桿菌的基因敲除，而且可以用于適用此基因敲除原理的其它微生物基因敲除的構(gòu)建。
【附圖說明】
[0007]圖l:pTSKHP 質(zhì)粒圖；
圖2:pCHFHP質(zhì)粒圖；
圖3:pTSKHP-0788 質(zhì)粒圖；
圖4: 無痕基因敲除步驟。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例一
一般性說明
PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶是北京全式金生物技術(shù)有限公司的高保真PfuDNA聚合酶。質(zhì)粒構(gòu)建過程中酶切連接使用的各種限制性內(nèi)切酶為F ermentas公司產(chǎn)品，T 4DNA連接酶使用的是Takala公司產(chǎn)品。用于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5a感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司。
[0009]結(jié)合圖1至圖4，做如下具體說明:
1、在幽門螺桿菌中構(gòu)建FLP-FRT重組系統(tǒng)原件
(I)包含F(xiàn)RT位點(diǎn)的同源重組雙交換敲除模板質(zhì)粒的構(gòu)建
在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的同源重組雙交換敲除模板質(zhì)粒PSJHK的基礎(chǔ)上，構(gòu)建包含F(xiàn)RT位點(diǎn)的敲除模板質(zhì)粒。以 PKD3 為模板，以 FRT-1 (CTTAGAGCTCATCAAGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG )和FRT-2( CGGAGGTACCGAATTAGCCATGGTCCATATG)為引物擴(kuò)增包含F(xiàn)RT的基因片段，得到的基因片段經(jīng)SacI和KpnI酶切后連入實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的同源重組雙交換敲除模板質(zhì)粒pSJHK中，得到pSJHK-FRT。利用引物BssHI 1-KmF(CTAGCTGCGCGCTGCCGCAAGCACTCA)和BssHI1-KmR(GCCTTCGCGCGCGATACCCCTCGAATTGA)以pSJHK為模板擴(kuò)增卡那霉素抗性基因(apW)，經(jīng)BssHII酶切后重新連入pSJHK-FRT質(zhì)粒中，得到包含F(xiàn)RT位點(diǎn)的同源重組雙交換敲除模板質(zhì)粒pTSKHP。圖1顯示質(zhì)粒pSJHK-FRT的模式圖，在卡那霉素抗性基因的兩端分別有一個(gè)FRT位點(diǎn)，再向外是兩組多克隆位點(diǎn)，用于連入同源重組雙交換的同源臂。
[0010](2)幽門螺桿菌中FLP重組酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
利用在Cj i opAaga hutch in son i i中表達(dá)F LP重組酶的質(zhì)粒p CHF為模板構(gòu)建用于幽門螺桿菌中FLP重組酶的表達(dá)質(zhì)粒pCHFHP。以幽門螺桿菌中的內(nèi)源質(zhì)粒pHel I作為復(fù)制起始子，以pHel1-1(CTTGATGAGCTCGAAGCTTGTCCGTTAG)和pHel1-2(CGTCTTGGTCGACTAGAAAGGGAAATG)為引物擴(kuò)增PHell質(zhì)粒序列，得到的擴(kuò)增片段經(jīng)SacI和Sail酶切后連入到質(zhì)粒pCHF上的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pCHF-p。氯霉素抗性基因(ca t-GO 以cm_l (TCCGATGTCGACCCGGTTTTTGTTAATCC)和cm-2(CACCAGGCATGCGTAACTCCTTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATC)為引物，以質(zhì)粒PTnMax9為模板擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增片段經(jīng)SalI和SphI酶切后連入到質(zhì)粒pCHF-p上的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pCHFHP，如圖2所示。
[0011]2、利用FLP-FRT重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)幽門螺桿菌中基因無痕敲除以基因例說明利用FLP-FRT重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)幽門螺桿菌中基因無痕敲除的步驟(圖 4)。
[0012]如07斯含有1500個(gè)核苷酸，有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)如07斯對于K pWori在胃中的定植是不可缺少的，生物信息學(xué)分析預(yù)測A/707貓編碼一個(gè)外膜蛋白(HP0788，499個(gè)氨基酸)。對于這個(gè)外膜蛋白的功能研究目前還不清楚，推測它可能作為一個(gè)粘附因子，類似于其他已知的粘附因子(AlpAB，BabA，HopZ)在77.pj^ori的定植中發(fā)揮粘附作用；也可能作為一個(gè)表面蛋白，在菌體與胃黏液相互作用中起到穩(wěn)定細(xì)胞外膜、保護(hù)菌體的作用。
[0013]本研究中獲得的基因敲除突變株為深入研究基因功能提供了前提，而該基因功能的闡明有助于進(jìn)一步分析K的致病機(jī)制，同時(shí)可能作為疫苗開發(fā)的潛在靶位點(diǎn)。
[0014](I)同源重組雙交換敲除質(zhì)粒pTSKHP-0788的構(gòu)建
根據(jù)基因上下游核苷酸序列及引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并合成如下引物:
0788-1:GAACGGTGGATCCGAACAGGCGTAAAGAAATCG；
0788-2:TAAGCCAGGTACCTCATAAAGGTTTCGGTAGG；
0788-3:TAGACGGTCGACCCGCCACCGATCAAGACA；
0788-4:GGACTGGAGCTCTATTAACCAAAGCCACAAAGAC；
以幽門螺桿菌基因組DNA為模板，利用上述引物0788-1/0788-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到0.8kbp的核苷酸片段作為同源重組的上游同源臂(Hl)，經(jīng)BamHI和KpnI酶切后連入pTSKHP中；下游同源臂(H2)是以引物0788-3/0788-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的1.1 kbp的核苷酸片段，經(jīng)SalI和SacI酶切后再連入該質(zhì)粒中。由此構(gòu)建hp0788的同源重組雙交換敲除質(zhì)粒pTSKHP-0788，如圖3所示。
[0015](2)敲除質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化幽門螺桿菌
制備幽門螺桿菌電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)，將敲除質(zhì)粒pTSKHP-0788通過電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到幽門螺桿菌中，電擊后的感受態(tài)細(xì)胞先涂布于無抗生素的空腸彎曲菌血瓊脂上復(fù)蘇，然后利用15 yg/ml卡那霉素篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
[0016]設(shè)計(jì)同源重組驗(yàn)證引物testl/kt2，kt3/test4。如圖3所示，testl位于同源臂擴(kuò)增弓丨物0788-1的5’端，test4位于同源臂擴(kuò)增引物0788-4的3’端，kt2和kt3位于卡那霉素抗性基因內(nèi)部。以轉(zhuǎn)化子基因組為模板分別利用驗(yàn)證引物testl/kt2和kt3/test4進(jìn)行基因擴(kuò)增，野生型基因組為模板作為對照。若以轉(zhuǎn)化子基因組為模板分別能夠擴(kuò)增出理論大小的PCR產(chǎn)物，而以野生型基因組為模板無法擴(kuò)增出理論大小的PCR產(chǎn)物，則證明上、下游同源臂均發(fā)生同源重組。此時(shí)基因區(qū)域被卡那霉素抗性基因取代，在抗生素基因的兩端分別有FRT位點(diǎn)。
[0017](3)輔助質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化卡那霉素抗性陽性突變株
取上步驟中的陽性敲除株制備電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)，將輔助質(zhì)粒pCHFHP通過電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到突變株中，同理，電擊后的感受態(tài)細(xì)胞先涂布于無抗生素的空腸彎曲菌血瓊脂上復(fù)蘇，然后利用10yg/ml氯霉素篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
[0018]經(jīng)過10-15天的培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子菌落，提取基因組，利用PCR驗(yàn)證FRT位點(diǎn)之間序列是否被剪切，引物使用testl和test4。未轉(zhuǎn)化輔助質(zhì)粒的突變株基因組作為對照，若氯霉素陽性突變株擴(kuò)增出的基因片段較卡那霉素突變株擴(kuò)增出的基因片段小卡那霉素抗性基因的大小，說明FRT位點(diǎn)之間的核苷酸序列被剪切。
[0019](4)輔助質(zhì)粒的消除
取上步驟中的陽性敲除株在無抗生素的血瓊脂平板上培養(yǎng)，傳代3次后挑取菌落同時(shí)轉(zhuǎn)接無抗生素血平板，氯霉素血平板和卡那霉素血平板，菌落僅能在無抗生素血平板上生長，而不能在氯霉素血平板和卡那霉素血平板上生長說明菌株丟失輔助質(zhì)粒。該菌株即為如無痕基因敲除突變株。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種幽門螺桿菌基因無痕敲除的方法，包括以下步驟: (a)構(gòu)建適用于幽門螺桿菌的帶有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性敲除模板質(zhì)粒和表達(dá)FLP重組酶的氯霉素抗性輔助質(zhì)粒； (b)設(shè)計(jì)目的基因同源重組雙交換同源臂，在敲除模板質(zhì)粒基礎(chǔ)上構(gòu)建目的基因敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入幽門螺桿菌中得到帶有FRT位點(diǎn)和卡那霉素抗性的基因敲除突變株； (c)將表達(dá)FLP重組酶的氯霉素抗性輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上步驟得到的基因敲除突變株中，去除FRT位點(diǎn)之間的卡那霉素抗性基因，得到攜帶輔助質(zhì)粒的無痕基因敲除突變株； (d)輔助質(zhì)粒通過無抗生素傳代培養(yǎng)消除，最終獲得無痕基因敲除突變株。
【文檔編號】C12N15/74GK106086054SQ201610458378
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】季曉飛, 趙慧琳, 李波清, 張瑩, 王穎
【申請人】濱州醫(yī)學(xué)院