專利名稱:一種抗艾滋病病毒Ⅰ型的化合物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌及其制備的化合物，尤其是涉及一種假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas sp.)及其制備的抗艾滋病病毒I型(HIV-1)化合物。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的致死性傳染病，AIDS的防治成為當(dāng)代科學(xué)的前沿之一，尤其促進(jìn)了抗病毒藥物的研究。20多年來已獲批準(zhǔn)臨床使用的抗HIV藥物有16種，約有近百個品種正在進(jìn)行臨床前研究和臨床實(shí)驗(yàn)。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)治療AIDS取得了很好的效果，由于HAART的應(yīng)用，從1998年起，美國AIDS的死亡率已逐年下降。然而，HAART存在抗藥性、藥物毒副作用大、費(fèi)用昂貴和無法清除病毒等問題，這也促使我們還需要繼續(xù)尋找新的抗HIV藥物。目前已有多個抗AIDS藥物的體外篩選模型的報(bào)道，例如以某些細(xì)胞系細(xì)胞(C8166，MT-4)為對象，檢測化合物對HIV致細(xì)胞死亡的的保護(hù)作用(Pauwels R，Balzarini J，Baba M et al.Rapid and automated tet-razolium-basedcolorimetric assay for the detection of anti-HIV compounds.J Virol Methods，1988，20309-321；Weislow OS，Kiser R，F(xiàn)ine DL et al.New soluble-formazan assay for HIV-1cytopathic effectsapplication to high-flux screening of synthetic and naturalproducts for AIDS-antiviral activity.J Natl Cancer Inst，1989，81577-586)；以某些細(xì)胞(如C8166，MT-2)為對象，檢測化合物對HIV誘導(dǎo)宿主細(xì)胞形成合胞體的抑制反應(yīng)(鄭永唐，賁昆龍，金善煒.17種植物中蛋白質(zhì)提取物的抗HIV-1活性.中國病毒學(xué)，1998，13312-321)等。公開號為CN1206745A的發(fā)明“抗艾滋病(AIDS)藥物篩選新模型”提供了一種簡單快速的艾滋病藥物篩選方法，利用此方法初篩后再進(jìn)行人艾滋病毒I型的抗性實(shí)驗(yàn)測試，可以對某種化合物是否具有抗HIV-I病毒的活性做出準(zhǔn)確的分析。
深海中的生物資源尚未得到開發(fā)，從新的菌種中發(fā)現(xiàn)新的具有藥用活性化合物的可能性較高，因此本發(fā)明提供了一株新的深海細(xì)菌，以及一個具有抗艾滋病毒I型的化合物的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可制備抗艾滋病病毒I型的化合物(簡稱101X化合物)的深海菌株。
本發(fā)明的另一目的在于利用深海菌株產(chǎn)生抗艾滋病病毒I型化合物及其制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于將深海菌株制備的101X化合物用于制備抗艾滋病病毒I型病毒藥物。
本發(fā)明所說的深海菌株為假交替單胞菌屬101X(Pseudoalteromonas sp.101X)。已于2005年4月18日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM205039。
本發(fā)明所說的深海菌株樣品來源于東太平洋深海5600米水深的沉積物。菌株通過以下方法進(jìn)行篩選將泥樣用滅菌海水按10、100、1000的稀釋倍數(shù)稀釋后，涂布于改良的2216E培養(yǎng)基，于20℃培養(yǎng)一周。挑選出單菌落進(jìn)一步劃線分離，取單菌落鏡檢為純種后于-70℃超低溫冰箱中保藏。
所說的改良的2216E培養(yǎng)基為蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，自然陳海水，pH7～8。
101X菌株經(jīng)16S rDNA序列分析結(jié)果鑒定后屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)的一個種，與其同源性最近的為Pseudoalteromonas elyakovii菌株，同源性為97.6％。
對其形態(tài)學(xué)特征及抗性試驗(yàn)，在油鏡下觀察，101X細(xì)胞呈短桿狀，單個排列。革蘭氏染色為陰性，菌體大小為(8～10)μm×(2～3)μm。菌落呈圓形，表面濕潤，有反光，邊緣整齊無皺褶，顏色為乳白色。
本發(fā)明所說的抗艾滋病病毒I型(HIV-1)化合物的制備方法，其步驟為1)101X菌株發(fā)酵液的制備將保藏的菌株101X用無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體2216E培養(yǎng)基中，在5～30℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長期，得發(fā)酵液；2)將發(fā)酵液離心，棄沉淀，上清液備用；3)在上清液中加入乙酸乙酯萃取，收集水相，量取大孔吸附樹脂，清洗、活化后裝柱，將水相溶液上柱，用純水洗柱后抽干，再用甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮去除洗脫液中的甲醇，濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥，即得101X化合物干粉樣品。
在步驟1)中，活化菌種時的無機(jī)鹽培養(yǎng)基可采用MM培養(yǎng)基(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO40.7％，KH2PO4 0.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.5～2.0％，蒸餾水配制。
在步驟2)中，最好將上清液保存于4℃中備用。
在步驟3)中，在上清液中加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相，再次加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相。量取的大孔吸附樹脂的平均孔徑為250～330mm，按說明書清洗、活化后裝柱，按量取的大孔吸附樹脂的1～2倍的水相溶液上柱，用量取的大孔吸附樹脂的1～3倍的純水洗柱后抽干，再用量取的大孔吸附樹脂的2～4倍的甲醇洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮以去除洗脫液中的甲醇。最后的少量濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥，即得101X化合物干粉樣品。
大孔吸附樹脂選用S-8(Crosslinked-polystyrene)極性樹脂，粒徑為0.3～1.25mm，平均孔徑為280～300mm。過大孔吸附樹脂柱時的水相溶液體積為量取的大孔吸附樹脂的1.7倍。洗脫時的純水體積為量取的大孔吸附樹脂的2倍。甲醇洗脫時的體積為量取的大孔吸附樹脂的3倍。減壓濃縮的時間以濃縮液能夠冷凍成塊為標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明所說的101X化合物具有抗艾滋病病毒I型病毒活性，可用于制備抗艾滋病病毒I型病毒藥物。
101X化合物體外抗HIV-1型活性檢測經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)研究，采用臺吩蘭染色計(jì)數(shù)法測定101X對CEM細(xì)胞(人T-淋巴瘤細(xì)胞系細(xì)胞)48小時半數(shù)毒性劑量(TC50)，結(jié)果為1/4.8原液，毒性較小。用HIV-I型病毒吸附CEM細(xì)胞2小時后，洗去病毒，檢測101X菌株抑制病毒引起細(xì)胞融合病變及病毒P24抗原的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)論為該樣品能抑制HIV-1病毒引起CEM細(xì)胞融合特征性病變和在CEM細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，對HIV病毒P24抗原的半數(shù)抑制濃度為原液的1/21，具有較高的抗HIV-I病毒活性。
本發(fā)明的101X化合物由新的深海菌株產(chǎn)生，具有體外抗HIV-1型病毒的活性，能抑制HIV-I病毒引起CEM細(xì)胞融合特征性病變和在CEM細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。在101X化合物的制備方法中，用乙酸乙酯萃取兩次可以最大限度地去除非活性化合物，而且操作方法相對簡單；選用大孔吸附樹脂化合物分離可以同時達(dá)到脫鹽和富集活性化合物的目的，并能去除大量的非活性化合物。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1制備101X菌株發(fā)酵液，將保藏的菌株101X用MM培養(yǎng)基(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO4 0.7％，KH2PO4 0.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂2.0％，蒸餾水配制。進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體2216E培養(yǎng)基中，在20℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長期，得發(fā)酵液；將發(fā)酵液離心，棄沉淀，上清液保存于4℃中備用；在上清液中加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相，再次加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相。量取的大孔吸附樹脂的平均孔徑為300mm，按說明書清洗、活化后裝柱，按量取的大孔吸附樹脂的1.7倍的水相溶液上柱，用量取的大孔吸附樹脂的1.7倍的純水洗柱后抽干，再用量取的大孔吸附樹脂的3倍的甲醇洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮以去除洗脫液中的甲醇。最后的少量濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥，即得101X化合物干粉樣品。
大孔吸附樹脂選用S-8(Crosslinked-polystyrene)極性樹脂，粒徑為1mm，平均孔徑為290mm。過大孔吸附樹脂柱時的水相溶液體積為量取的大孔吸附樹脂的1.7倍。洗脫時的純水體積為量取的大孔吸附樹脂的2倍。甲醇洗脫時的體積為量取的大孔吸附樹脂的3倍。減壓濃縮的時間以濃縮液能夠冷凍成塊為標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例2與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于制備101X菌株發(fā)酵液，將保藏的菌株101X用MM培養(yǎng)基(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO4 0.7％，KH2PO4 0.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.5％，蒸餾水配制。進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體2216E培養(yǎng)基中，在15℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長期，得發(fā)酵液；將發(fā)酵液離心，棄沉淀，上清液保存于4℃中備用；在上清液中加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相，再次加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相。量取的大孔吸附樹脂的平均孔徑為280mm，按說明書清洗、活化后裝柱，按量取的大孔吸附樹脂的1.5倍的水相溶液上柱，用量取的大孔吸附樹脂的2倍的純水洗柱后抽干，再用量取的大孔吸附樹脂的2倍的甲醇洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮以去除洗脫液中的甲醇。最后的少量濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥，即得101X化合物干粉樣品。
大孔吸附樹脂選用S-8(Crosslinked-polystyrene)極性樹脂，粒徑為0.8mm，平均孔徑為280mm。過大孔吸附樹脂柱時的水相溶液體積為量取的大孔吸附樹脂的1.7倍。洗脫時的純水體積為量取的大孔吸附樹脂的2倍。甲醇洗脫時的體積為量取的大孔吸附樹脂的3倍。減壓濃縮的時間以濃縮液能夠冷凍成塊為標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于制備101X菌株發(fā)酵液，將保藏的菌株101X用MM培養(yǎng)基(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO4 0.7％，KH2PO4 0.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.8％，蒸餾水配制。進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體2216E培養(yǎng)基中，在30℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長期，得發(fā)酵液；將發(fā)酵液離心，棄沉淀，上清液保存于4℃中備用；在上清液中加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相，再次加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相。量取的大孔吸附樹脂的平均孔徑為330mm，按說明書清洗、活化后裝柱，按量取的大孔吸附樹脂的2倍的水相溶液上柱，用量取的大孔吸附樹脂的1倍的純水洗柱后抽干，再用量取的大孔吸附樹脂的2.5倍的甲醇洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮以去除洗脫液中的甲醇。最后的少量濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥，即得101X化合物干粉樣品。
大孔吸附樹脂選用S-8(Crossl inked-polystyrene)極性樹脂，粒徑為1.25mm，平均孔徑為300mm。過大孔吸附樹脂柱時的水相溶液體積為量取的大孔吸附樹脂的1.7倍。洗脫時的純水體積為量取的大孔吸附樹脂的2倍。甲醇洗脫時的體積為量取的大孔吸附樹脂的3倍。減壓濃縮的時間以濃縮液能夠冷凍成塊為標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例4與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于制備101X菌株發(fā)酵液，將保藏的菌株101X用MM培養(yǎng)基(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO4 0.7％，KH2PO4 0.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂2％，蒸餾水配制。進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體2216E培養(yǎng)基中，在5℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長期，得發(fā)酵液；將發(fā)酵液離心，棄沉淀，上清液保存于4℃中備用；在上清液中加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相，再次加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相。量取的大孔吸附樹脂的平均孔徑為250mm，按說明書清洗、活化后裝柱，按量取的大孔吸附樹脂的1倍的水相溶液上柱，用量取的大孔吸附樹脂的3倍的純水洗柱后抽干，再用量取的大孔吸附樹脂的4倍的甲醇洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮以去除洗脫液中的甲醇。最后的少量濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥，即得101X化合物干粉樣品。
大孔吸附樹脂選用S-8(Crosslinked-polystyrene)極性樹脂，粒徑為0.3mm，平均孔徑為285mm。過大孔吸附樹脂柱時的水相溶液體積為量取的大孔吸附樹脂的1.7倍。洗脫時的純水體積為量取的大孔吸附樹脂的2倍。甲醇洗脫時的體積為量取的大孔吸附樹脂的3倍。減壓濃縮的時間以濃縮液能夠冷凍成塊為標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種深海菌株，為假交替單胞菌屬101X(Pseudoalteromonas sp.101X)，已于2005年4月18日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM205039。
2.如權(quán)利要求
1所述的一種深海菌株，其特征在于深海菌株的篩選方法為將泥樣用滅菌海水按10、100、1000的稀釋倍數(shù)稀釋后，涂布于改良的2216E培養(yǎng)基，于20℃培養(yǎng)一周，挑選出單菌落進(jìn)一步劃線分離，取單菌落鏡檢為純種后于-70℃超低溫冰箱中保藏。
3.如權(quán)利要求
2所述的一種深海菌株，其特征在于所說的改良的2216E培養(yǎng)基為蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，自然陳海水，pH7～8。
4.一種抗艾滋病病毒I型化合物的制備方法，其特征在于其步驟為1)制備101X菌株發(fā)酵液將保藏的菌株101X用無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體2216E培養(yǎng)基中，在5～30℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長期，得發(fā)酵液；2)將發(fā)酵液離心，棄沉淀，上清液備用；3)在上清液中加入乙酸乙酯萃取，收集水相，量取大孔吸附樹脂，清洗、活化后裝柱，將水相溶液上柱，用純水洗柱后抽干，再用甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮去除洗脫液中的甲醇，濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥，即得101X化合物干粉樣品。
5.如權(quán)利要求
4所述的一種抗艾滋病病毒I型化合物的制備方法，其特征在于在步驟1)中，活化菌種時的無機(jī)鹽培養(yǎng)基采用MM培養(yǎng)基(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO4 0.7％，KH2PO4 0.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.5～2.0％，蒸餾水配制。
6.如權(quán)利要求
4所述的一種抗艾滋病病毒I型化合物的制備方法，其特征在于在步驟2)中，將上清液保存于4℃中備用。
7.如權(quán)利要求
4所述的一種抗艾滋病病毒I型化合物的制備方法，其特征在于在步驟3)中，在上清液中加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相，再次加入1/2體積乙酸乙酯萃取，收集水相。
8.如權(quán)利要求
4所述的一種抗艾滋病病毒I型化合物的制備方法，其特征在于量取的大孔吸附樹脂的平均孔徑為250～330mm，按量取的大孔吸附樹脂的1～2倍的水相溶液上柱，用量取的大孔吸附樹脂的1～3倍的純水洗柱后抽干，再用量取的大孔吸附樹脂的2～4倍的甲醇洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮以去除洗脫液中的甲醇，最后的少量濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥，即得101X化合物干粉樣品。
9.如權(quán)利要求
4或8所述的一種抗艾滋病病毒I型化合物的制備方法，其特征在于大孔吸附樹脂選用S-8極性樹脂，粒徑為0.3～1.25mm，平均孔徑為280～300mm，過大孔吸附樹脂柱時的水相溶液體積為量取的大孔吸附樹脂的1.7倍，洗脫時的純水體積為量取的大孔吸附樹脂的2倍，甲醇洗脫時的體積為量取的大孔吸附樹脂的3倍，減壓濃縮的時間以濃縮液能夠冷凍成塊為標(biāo)準(zhǔn)。
10.如權(quán)利要求
4所述的一種抗艾滋病病毒I型化合物用于制備抗艾滋病病毒I型病毒藥物。
專利摘要
一種抗艾滋病病毒I型的化合物制備方法，涉及一種細(xì)菌及其制備的化合物，尤其是涉及一種假交替單胞菌屬及其制備的抗艾滋病病毒I型化合物。提供一種可制備抗艾滋病病毒I型的化合物的深海菌株。深海菌株為假交替單胞菌屬101X(Pseudoalteromonas sp.101X)，保藏編號為CCTCC NOM205039。將菌株101X用無機(jī)鹽培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基，培養(yǎng)至指數(shù)生長期，得發(fā)酵液；將發(fā)酵液離心，棄沉淀，上清液備用；在上清液中加入乙酸乙酯萃取，收集水相，量取大孔吸附樹脂，清洗、活化后裝柱，將水相溶液上柱，用純水洗柱后抽干，用甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮去除甲醇，經(jīng)真空冷凍干燥，得化合物。
文檔編號C12P1/04GKCN1884479SQ200510081630
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月23日
發(fā)明者曾潤穎, 林昱 申請人:國家海洋局第三海洋研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan