專利名稱:用于從肟基酸生產(chǎn)氨基酸衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從肟基酸(hydroxyimino acid)生產(chǎn)氨基酸衍生物的方法，具體涉及通過酶促還原從羥亞胺酸(hydroxyimine acid)生產(chǎn)氨基酸衍化物的方法。
背景技術(shù)：
氨基酸在工業(yè)中作為例如藥物、食品、試劑以及化學(xué)合成中間體是非常重要的組分。用于生產(chǎn)氨基酸的方法大致分成四種方法，即提取法、發(fā)酵法、酶法以及化學(xué)合成法。酶法是將具有與目的氨基酸相似結(jié)構(gòu)的前體作為起始原料經(jīng)過酶反應(yīng)的一個至幾個階段而快速轉(zhuǎn)變?yōu)榘被岬姆椒āＭǔ?，酶法可得到具有高純度、副產(chǎn)物量很少的氨基酸。當(dāng)可以廉價得到作為底物的前體時，酶法是非常有效的生產(chǎn)方法。
Monatin，一種氨基酸衍化物，是天然存在的、甜味的氨基酸分離物，并可從南非的灌木根中提取。Monatin具有比蔗糖高出數(shù)十倍至數(shù)千倍的甜度，并預(yù)期用作甜味劑。
作為用于生產(chǎn)Monatin的化學(xué)合成法的實例，現(xiàn)有的方法是將吲哚乙酸(indolacetic acid)衍生物和天冬氨酸鹵化物作為合成酮衍化物的起始原料，并由此獲得氰醇(cyanohydrin)衍生物，其隨后在堿性條件下水解(例如，專利文獻(xiàn)1)。作為酶法的實例，現(xiàn)有的方法是從吲哚-3-丙酮酸生成作為中間體的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-2-酮戊二酸(也稱為IHOG)，然后在酶的存在下由此生成Monatin(例如，專利文獻(xiàn)2)。還有在酶的存在下生產(chǎn)上述IHOG的已知方法(例如，專利文獻(xiàn)3)。
作為從IHOG生成Monatin的另一種方法，現(xiàn)有的方法是IHOG用來生產(chǎn)IHOG-肟(或4-羥基-4-(3-吲哚甲基)-2-羥基亞胺戊二酸)，其隨后在還原催化劑例如銠的存在下轉(zhuǎn)變?yōu)镸onatin(例如，專利文獻(xiàn)4)。然而，沒有用于在微生物或酶的存在下從比IHOG更穩(wěn)定的IHOG-肟中生產(chǎn)Monatin的任何已知的方法。
在專利文獻(xiàn)5和非專利文獻(xiàn)1至4中描述了通過微生物或酶(酶促還原)來還原肟(羥亞胺)。例如，專利文獻(xiàn)5描述了用于從苯乙酮肟生產(chǎn)α-甲基芐胺的方法。然而，沒有在微生物或酶的存在下用于還原肟基酸來生產(chǎn)氨基酸的任何已知的方法。
引用的參考文獻(xiàn)列表專利文獻(xiàn)1日本專利申請公開(Laid-open)號2003-171365；專利文獻(xiàn)2國際公開WO2003/056026單行本(Pamphlet)；專利文獻(xiàn)3國際公開WO2004/018672單行本；專利文獻(xiàn)4國際公開WO2003/059865單行本；專利文獻(xiàn)5日本專利申請公開號H4-234993A；非專利文獻(xiàn)1Pharmacology，13，234(1975)；非專利文獻(xiàn)2Clement等，Arch.der Parmazie，321，955(1998)；非專利文獻(xiàn)3Clement等，JBC，272，19615(1997)；非專利文獻(xiàn)4Gibbs等，Tetrahedron Lett.，31，555(1990)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題通過化學(xué)合成法來生產(chǎn)氨基酸衍生物的方法可用于生產(chǎn)難以分離和提取的氨基酸衍生物。然而，就工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的成本而言，化學(xué)合成法有許多缺點，例如設(shè)備費用高并且需要使用昂貴的催化劑。相反，利用微生物或酶的方法可用于工業(yè)上許多方面以生產(chǎn)氨基酸衍生物。在這種情況下，本發(fā)明目的在于提供用于生產(chǎn)氨基酸衍生物的工業(yè)上有利的方法。
解決問題的方法本發(fā)明者對生產(chǎn)氨基酸衍生物例如Monatin的新方法進(jìn)行了廣泛研究。結(jié)果，他們已發(fā)現(xiàn)通過使用微生物和/或酶還原肟基酸來生產(chǎn)氨基酸衍生物的方法，從而完成本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)氨基酸衍生物的下列方法。
(1)生產(chǎn)氨基酸衍生物的方法，該方法包括如下步驟在微生物和/或酶的存在下從由下列通式(I)表示的肟基酸
其中R1表示選自下列取代基任選取代的C2至C6烷基、任選取代的C6至C14的芳基、任選取代的C6至C10的環(huán)烷基、任選取代的C7至C19的芳烷基、任選取代的C2至C10的烷氧基烷基、任選取代的基團(tuán)，其與上述任何一個基團(tuán)相同，除了在其碳架中含有雜原子，和下列通式(II)表示取代基R3 其中R4表示選自下列的取代基任選取代的C2至C6的烷基、任選取代的C6至C14的芳基、任選取代的C6至C10的環(huán)烷基、任選取代的C7至C19的芳烷基、任選取代的C2至C10的烷氧基烷基、任選取代的基團(tuán)，其與上述任何一個基團(tuán)相同，除了在其碳架中含有雜原子；X1和X2獨立地表示羥基或羰基，R2表示C1至C3的烷基或氫原子；以及n是0或1，反應(yīng)產(chǎn)生由下列通式(III)表示的氨基酸衍生物 其中R1和n具有與通式(I)中R1和n相同的含義，其中微生物和/或酶能催化該反應(yīng)。
(2)根據(jù)(1)所述的方法，其中n是0，并且由此產(chǎn)生的氨基酸衍生物是α-氨基酸衍生物。
(3)根據(jù)(1)所述的方法，其中由此產(chǎn)生的氨基酸衍生物是α-L-氨基酸。
(4)根據(jù)(1)所述的方法，其中由此產(chǎn)生的氨基酸衍生物是α-D-氨基酸。
(5)根據(jù)(1)所述的方法，其中n是1，并且由此生成的氨基酸衍生物是β-氨基酸衍生物。
(6)根據(jù)(1)所述的方法，其中芳基是任選取代的苯基或萘基。
(7)根據(jù)(1)所述的方法，其中芳烷基是任選取代的苯烷基或萘烷基。
(8)根據(jù)(1)所述的方法，其中在碳架中含有雜原子的基團(tuán)是任選取代的吡啶基或吲哚基。
(9)用于生產(chǎn)Monatin的方法，包括在微生物和/或酶的存在下，從由通式(IV)表示的IHOG-肟 反應(yīng)生成由下列通式(V)表示的Monatin 其中微生物和/或酶能催化該反應(yīng)。
(10)用于生產(chǎn)β-苯基-β-丙氨酸的方法，包括在微生物和/或酶的存在下從由通式(VI)表示的BAE-肟 反應(yīng)生成β-苯基-β-丙氨酸，其中微生物和/或酶能催化該反應(yīng)。
(11)用于生產(chǎn)色氨酸的方法，包括在微生物和/或酶的存在下從由通式(VII)表示的吲哚-3-丙酮酸-肟 反應(yīng)生成色氨酸，其中微生物和/或酶能催化該反應(yīng)。
(12)根據(jù)(1)、(9)、(10)以及(11)中任意一項所述的方法，其中微生物是屬于選自下組的任何屬的一種或多種微生物檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)以及紅球菌屬。
(13)根據(jù)(1)、(9)、(10)以及(11)中任意一項所述的方法，其中微生物選自下組弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、中間埃希氏菌(Escherichiaintermedia)、大腸桿菌(Escherichia coli)以及海生紅球菌(Rodococcusmarinonascens)。
(14)根據(jù)(1)、(9)、(10)以及(11)中任意一項所述的方法，其中將選自NADH、NADPH、吡哆醛-5′-磷酸以及MgCl2中的一種或多種化合物加入由通式(I)表示的化合物產(chǎn)生由通式(III)表示的化合物的反應(yīng)溶液。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，提供了容易地生產(chǎn)氨基酸的方法，其在成本方面是有利的。
實施發(fā)明的最佳方式在根據(jù)本發(fā)明所述的生產(chǎn)氨基酸衍生物的方法中，通過微生物和/或酶的催化作用將通式(I)的肟基酸轉(zhuǎn)變成通式(III)的化合物。在本說明書中，“氨基酸衍生物”包括氨基酸自身及其衍生物。
在本發(fā)明中使用的具有催化此反應(yīng)的能力的微生物優(yōu)選實例，包括屬于選自下組的任何屬的微生物檸檬酸桿菌屬、埃希氏菌屬、棒桿菌屬(Corynebacterium)、紅球菌屬、沙門氏菌屬(Salmonella)以及歐文氏菌屬(Erwinia)。更優(yōu)選的微生物實例包括弗氏檸檬酸桿菌、中間檸檬酸桿菌(Citrobacter intermedius)、中間埃希氏菌、大腸桿菌、馬棒桿菌(Corynebacteriumequi)、海生紅球菌(Rohodococcus marinonascens)、沙門氏菌屬的菌種、解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)以及腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)。
更具體地說，可舉例說明下列菌株作為優(yōu)選的微生物，其菌株名稱及保藏單位如下所示(1)弗氏檸檬酸桿菌IFO 13546(i)保藏號IFO 13546(iii)保藏單位(地址)獨立行政法人制品評價技術(shù)機(jī)構(gòu)生物技術(shù)本部生物遺傳資源部門(2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba 292-0818，日本)。
(2)中間埃希氏菌AJ 2607(i)保藏號FERM BP-10401(由FERM P-20215轉(zhuǎn)來)
(ii)原始保藏日期2004年9月8日；(iii)保藏單位(地址)獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本)。
(3)大腸桿菌ATCC 13070(i)保藏號ATCC 13070(iii)保藏單位(地址)美國典型培養(yǎng)物保藏中心，郵政信箱1549，Manassas，VA 20110，美國(4)大腸桿菌ATCC 12814(i)保藏號ATCC 12814(iii)保藏單位(地址)美國典型培養(yǎng)物保藏中心，郵政信箱1549，Manassas，VA 20110，美國(5)海生紅球菌AJ110354(i)保藏號FERM BP-10400(由FERM P-20213轉(zhuǎn)來)(ii)原始保藏日期2004年9月8日；(iii)保藏單位(地址)獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本)。
從上述微生物等可分離和純化本發(fā)明所用的酶。術(shù)語“在微生物和/或酶的存在下”是指使微生物和/或酶存在于將由通式(I)表示的肟基酸轉(zhuǎn)變成由通式(III)表示的氨基酸衍生物的反應(yīng)系統(tǒng)中的操作。只要具有本發(fā)明要求的活性，并不具體限制“微生物和/或酶”的來源、制備方法等等。作為微生物，不僅能使用催化本發(fā)明反應(yīng)的上述微生物，而且能使用以編碼催化反應(yīng)的酶的基因(包括重組基因)轉(zhuǎn)化的宿主微生物、或由所述宿主微生物產(chǎn)生的酶。也就是說，只要將由通式(I)表示的肟基酸轉(zhuǎn)變成由通式(III)表示的氨基酸衍生物，微生物和/或酶能以任何形式存在于反應(yīng)系統(tǒng)中。可使用微生物或酶，或它們兩者。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法中使用的“微生物和/或酶”可具有下列形式。具體形式的實例可包括微生物的培養(yǎng)產(chǎn)物、從培養(yǎng)產(chǎn)物分離的微生物細(xì)胞以及通過處理微生物細(xì)胞而得到的物質(zhì)。微生物的培養(yǎng)產(chǎn)物是通過培養(yǎng)微生物而得到的物質(zhì)，具體地可以是含有微生物細(xì)胞、用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)液以及微生物產(chǎn)生的物質(zhì)的混合物。可洗滌微生物細(xì)胞并用作洗滌的微生物細(xì)胞。通過處理微生物細(xì)胞而得到的物質(zhì)可包括通過破碎、溶解或凍干微生物細(xì)胞而得到的物質(zhì)，以及在處理微生物細(xì)胞后回收的粗酶。通過處理微生物細(xì)胞而得到的物質(zhì)還包括通過進(jìn)一步純化粗酶而得到的純化酶。純化酶可包括通過任何多種純化方法而得到的部分純化的酶，和固定化酶(即通過共價連接、吸附、包合(inclusion)等而固定的酶)。所用的一些微生物在培養(yǎng)期間被部分溶解。在這種情況下，培養(yǎng)液的上清也可被用作上述的“微生物和/或酶”。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法中使用的“微生物和/或酶”也包括遺傳工程構(gòu)建的菌株，這些菌株表達(dá)用于將由通式(I)表示的肟基酸轉(zhuǎn)變成由通式(III)表示的氨基酸衍生物的酶；通過處理所述的微生物細(xì)胞而得到的物質(zhì)，所述處理包括丙酮處理和凍干法；以及固定化微生物細(xì)胞或通過共價連接、吸附、包合等固定的固定化微生物處理的物質(zhì)。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法包括以通式(I)的肟基酸作為起始原料的反應(yīng)。通式(I)中的R1的具體實例可包括下列基團(tuán)。
作為R1的C2至C6烷基的具體實例包括乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基以及異己基。
作為R1的C6至C14芳基的具體實例包括苯基、甲苯基、二甲苯基、聯(lián)苯基、萘基、蒽基以及菲基，并優(yōu)選苯基和萘基。
作為R1的C6至C10環(huán)烷基的具體實例包括環(huán)己基、環(huán)庚基(cycloheptanyl)、環(huán)辛基(cyclooctanyl)、環(huán)壬基(cyclononanyl)以及環(huán)癸基(cyclodecanyl)。
作為R1的C7至C19芳烷基的具體實例包括苯烷基(例如苯甲基、二苯甲基、苯乙基和三苯甲基)、肉桂基、苯乙烯基以及萘烷基，并且優(yōu)選苯烷基和萘烷基。
作為R1的C2至C11烷氧基烷基的具體實例包括用選自下組的基團(tuán)取代的C1至C10烷基甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、戊氧基、苯氧基、庚氧基(heptoxy)、辛氧基(octoxy)、壬氧基(nonanoxy)、癸氧基(decanoxy)以及十一烷氧基(undecoxy)。
作為R1在上述基團(tuán)碳架中含有雜原子的基團(tuán)的一個實施方案可為含有雜環(huán)的烴基?！昂须s環(huán)的烴基”是在環(huán)狀化合物的環(huán)上摻入雜原子的環(huán)狀烴基。含有雜環(huán)的烴基可以是雜芳基。含有雜環(huán)的烴基并不限于有或沒有芳香性。含有雜環(huán)的烴基可以是單環(huán)的或多環(huán)的。含有雜環(huán)的烴基的具體實例包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基(piperidyl)、哌啶子基(piperidino)、嗎啉代基、吲哚基以及用上述的任何雜環(huán)基取代的烷基，其優(yōu)選的實例包括吡啶基和吲哚基。
可用選自下列的至少一種取代基進(jìn)一步取代上述的R1鹵原子、羥基、C3或更短的烷基、C3或更短的烷氧基以及氨基。
R2表示C1至C3的烷基或氫原子。C1至C3的烷基實例包括乙基、甲基、正丙基以及異丙基。
R4的烷基、芳基、環(huán)烷基、芳烷基、烷氧基烷基、在上述基團(tuán)的碳架中含有雜原子的基團(tuán)以及上述基團(tuán)、以及上述基團(tuán)可任選具有的取代基，都與上述R1的情況相同。
通過各種生成肟的反應(yīng)(即，將對應(yīng)于肟基的CO基團(tuán)轉(zhuǎn)變成CNOH基團(tuán)的反應(yīng))可獲得由通式(I)表示的化合物。具體地說，通過在國際公開WO2003/056026單行本、WO2004/018672單行本以及WO2003/059865單行本中描述的方法，可獲得化合物(I)。
在中性或堿性的條件下，通過將由下列通式(VIII)表示的胺化合物或其鹽與相應(yīng)的酮基化合物反應(yīng)，來進(jìn)行用于生產(chǎn)肟(用于生產(chǎn)肟基的轉(zhuǎn)變)的方法，其中R5表示氫原子、烷基、芳基或芳烷基H2N-OR5...(VIII)當(dāng)R5是烷基、芳基或芳烷基時，優(yōu)選R5是C1至C3的烷基、芳基或芳烷基。就結(jié)晶而言，優(yōu)選R5選自甲基和苯甲基。
使用通式(VIII)的羥胺(其中R5是氫原子)很容易實施生產(chǎn)肟的方法。舉例來說，在中性或弱堿性條件下，通過將鹽酸羥胺加到含有酮基化合物的溶液中，然后在室溫至約10℃的條件下攪拌溶液0.5至60小時，即可生成肟。優(yōu)選在pH 6至10，更優(yōu)選在pH 7至9來進(jìn)行用于生產(chǎn)肟的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。不必具體限定將酮基化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的反應(yīng)條件，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員通過簡單初試可測定產(chǎn)生肟的轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，將由通式(I)表示的化合物轉(zhuǎn)變成由通式(III)表示的化合物產(chǎn)物。通式(III)中的R1、n及其它定義與上述通式(I)中的相同。
當(dāng)通式(I)中n是0時，可得到作為通式(III)中的化合物的α-氨基酸衍生物。當(dāng)n是1時，得到β-氨基酸衍生物。例如，通過選擇通式(I)中的L-或D-化合物，可生成通式(III)中的L-或D-化合物。當(dāng)?shù)玫阶鳛長和D化合物混合物的化合物(III)時，可從混合物分離并純化其中的任意一種。
根據(jù)待用的微生物、酶和起始原料的具體種類，可適當(dāng)調(diào)節(jié)使用微生物和/或酶的反應(yīng)系統(tǒng)的條件。所用的微生物量和/或酶量可以是顯示目的效果的量(有效量)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在簡單的初步實驗中，可容易地確定有效量。例如，當(dāng)使用酶時，其優(yōu)選量可以是約0.01至100單位(U)。當(dāng)使用洗滌的微生物時，其優(yōu)選量可以是約0.1至500g/L。通常在所用的酶具有活性的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，溫度優(yōu)選在10至50℃、更優(yōu)選在20至40℃、以及更加優(yōu)選在25至37℃的范圍內(nèi)。通常將酶反應(yīng)溶液的pH值調(diào)節(jié)到2至12、優(yōu)選7至11、更優(yōu)選8至9的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法的優(yōu)選實施方案中，可加入選自NADH、NADPH、吡哆醛-5′-磷酸(在下文可稱為PLP)以及MgCl2的一種或多種化合物。通過加入這些添加劑，可提高由通式(III)表示的氨基酸衍生物的生產(chǎn)量。
根據(jù)微生物種類等等，適當(dāng)選擇四種添加劑的組合。其優(yōu)選的組合是含有至少三種添加劑的組合NADH、NADPH以及PLP，并且更優(yōu)選含有全部四種添加劑的組合。如下所示反應(yīng)液中各種添加劑的優(yōu)選量NADH的量優(yōu)選是0.01至200mM，更優(yōu)選是0.1至50mM；NADPH的量優(yōu)選是0.01至200mM，更優(yōu)選是0.1至50mM；MgCl2的量優(yōu)選是0.01至10mM，更優(yōu)選是0.1至1mM；以及PLP的量優(yōu)選是0.01至10mM，更優(yōu)選是0.1至1mM。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法優(yōu)選用于生產(chǎn)R1是芳環(huán)或含有雜環(huán)基團(tuán)的氨基酸衍生物，并且更優(yōu)選用于生產(chǎn)Monatin、色氨酸、苯丙氨酸等。為了生產(chǎn)Monatin，將IHOG-肟用作由通式(I)表示的化合物。為了生產(chǎn)色氨酸，將IPA-肟(吲哚-3-丙酮酸-肟)用作由通式(I)表示的化合物。為了生產(chǎn)苯丙氨酸，將BAE-肟(3-肟基-3-苯基-丙酸甲酯)用作由通式(I)表示的化合物。BAE是苯甲酰乙酸乙酯(benzoyl acetate ethyl ester)的縮寫。
實施例參考下列實施例將詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。
在實施例中，使用由GL Sciences，Inc.制造的Inertsil ODS-80A(5μm，6×150mm)，通過高效液相色譜法進(jìn)行Monatin的定量。分析條件如下所示。
流動相12％(v/v)乙腈/0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速1.5ml/min；
柱溫30℃；以及檢測UV 210nm。
在上述的分析條件下，對(2S，4S)-Monatin和(2R，4R)-Monatin進(jìn)行分級并在保留時間12.1分鐘時定量，而(2S，4R)-Monatin和(2R，4S)-Monatin在保留時間9.7分鐘時定量。
如果需要，也可用光學(xué)拆析柱(optical resolution column)CROWNPAKCR(+)(4.6×150mm)(由Daicel Chemical Industries，Ltd.制造)通過高效液相色譜法進(jìn)行分析。分析條件如下所示。
流動相高氯酸水溶液(pH1.5)/10％(v/v)甲醇；流速0.5ml/min；柱溫30℃；以及檢測UV 210nm。
在上述的分析條件下，可對Monatin光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分級，并分別在保留時間42、57、64和125分鐘時按(2R，4S)、(2R，4R)、(2S，4R)以及(2S，4S)的順序進(jìn)行定量。
生產(chǎn)實施例1IHOG-肟二銨鹽(4-羥基-4-(3-吲哚甲基)-2-羥基亞胺戊二酸二銨鹽)的生產(chǎn)加入73.8g(352mmol)吲哚-3-丙酮酸并溶于917g的1.6wt％氫氧化鈉水溶液。調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液溫度至35℃。當(dāng)用30％氫氧化鈉水溶液將溶液pH保持在11.1時，經(jīng)過2小時逐滴加入310.2g(1761mmol)的50％丙酮酸水溶液。另外將反應(yīng)混合物反應(yīng)4.5小時來獲得含有4-羥基-4-(3-吲哚甲基)-2-酮戊二酸的反應(yīng)溶液。當(dāng)用30％氫氧化鈉水溶液將反應(yīng)溶液的pH保持在7時，向其中加入367.2g(2114mmol)的40％鹽酸羥胺水溶液，并將混合物在5℃攪拌17.5小時。用濃鹽酸將反應(yīng)溶液的pH值調(diào)節(jié)至2，然后用乙酸乙酯提取其有機(jī)物質(zhì)。用飽和的鹽水洗滌有機(jī)層，然后濃縮得到殘余物(residue)。將殘余物在60ml 28％氨水和1350ml 2-丙醇中進(jìn)行重結(jié)晶，來獲得43.4g 4-羥基-4-(3-吲哚甲基)-2-羥基亞胺戊二酸二銨鹽(142mmol；相對于吲哚-3-丙酮酸，產(chǎn)率為40％)作為晶體。
生產(chǎn)實施例2IHOG-肟二鉀鹽(4-羥基-4-(3-吲哚甲基)-2-羥基亞胺戊二酸二鉀鹽)的生產(chǎn)將生產(chǎn)實施例1所生產(chǎn)的10g 4-羥基-4-(3-吲哚甲基)-2-羥基亞胺戊二酸二銨鹽溶于20ml水，然后流過100ml陽離子交換樹脂DIAION PK228(鉀型，由Mitsubishi Chemical公司制造)充填的柱子，來將化合物轉(zhuǎn)變成期望的離子。將洗脫液濃縮成20g濃縮物，以獲得4-羥基-4-(3-吲哚甲基)-2-羥基亞胺戊二酸二鉀鹽的含水溶液。
生產(chǎn)實施例3吲哚丙酮酸肟的生產(chǎn)將4.06g(0.02mol)吲哚丙酮酸和1.32g(0.02mol)的85％氫氧化鉀溶于50ml水，并在其中加入1.53g(0.022mol)鹽酸羥胺。另外在其中加入1.45g(0.022mol)的85％氫氧化鉀，并在室溫下過夜攪拌混合物。用鹽酸將反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)至pH2，并通過過濾收集析出的晶體。干燥所得的濕晶體來獲得3.34g吲哚丙酮酸肟。相對于吲哚丙酮酸，產(chǎn)品的產(chǎn)率是76.5％，并獲得ESI-MS219.1[M+H]+信號。
生產(chǎn)實施例4苯甲酰乙酸乙酯肟的生產(chǎn)將3.84(0.02mol)苯甲酰乙酸乙酯溶于50ml的MeOH，并在其中加入1.53g(0.022mol)鹽酸羥胺。在其中加入2.23g(0.022mol)三乙胺，并在室溫下過夜攪拌混合物。在減壓條件下濃縮反應(yīng)溶液。然后將水加入殘余物，并通過過濾收集析出的晶體。由此獲得3.27g干燥的苯甲酰乙酸乙酯肟。相對于苯甲酰乙酸乙酯，產(chǎn)率是78.9％，并獲得ESI-MS208.2[M+H]+信號。
(分析條件)防護(hù)柱(Guard column)Shodex IC YK-G(Showa Denko K.K.)柱Shodex IC YK-421(Showa Denko K.K.)檢測電導(dǎo)檢測器洗脫液4mM磷酸+5mM 18-Crown-6流速0.6ml/min；分析溫度40℃實施例1篩選還原IHOG-肟的微生物篩選具有還原4-羥基-4-(3-吲哚甲基)-2-肟基戊二酸(IHOG-肟)活性的微生物菌株，即可從底物IHOG-肟生產(chǎn)Monatin的菌株。
將樣品微生物(細(xì)菌或酵母)接種到肉湯平板(bouillon plate)(EikenChemical Co.Ltd.制造)，并于30℃培養(yǎng)24小時。將所得的培養(yǎng)物接種到平板上，該平板含有0.5g/dl甘油、0.5g/dl富馬酸、0.3g/dl酵母提取物、0.2g/dl蛋白胨、0.5g/dl硫酸銨、0.3g/dl K2HPO4、0.1g/dl KH2PO4、0.05g/dlMgSO4·7H2O、0.2g/dl IHOG-肟二銨鹽以及2g/dl瓊脂粉(pH6.5)。然后將微生物在30℃培養(yǎng)24小時。將所得微生物細(xì)胞接種到下列兩種反應(yīng)溶液中的每一種，使所得的濕微生物細(xì)胞重量為約1％(w/v)，然后將反應(yīng)混合物在30℃反應(yīng)24小時。
反應(yīng)溶液1100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM IHOG-肟二銨鹽、1mMMgCl2、1mM吡哆醛-5’-磷酸(PLP)、20mM NADH、20mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
然后通過TLC定性分析由此生產(chǎn)的Monatin。將1μl反應(yīng)溶液點樣到TLC硅膠板60F254(由Merck制造)上，然后將這樣得到的平板浸入由正丁醇∶乙酸∶水(＝4∶1∶2)組成的溶液中并用茚三酮(ninhydrin)顯色?？稍赗f約0.39的位置將Monatin檢測為粉色斑點。
為了定量分析產(chǎn)生的Monatin，用HPLC分析已經(jīng)確認(rèn)產(chǎn)生了Monatin的反應(yīng)溶液。結(jié)果，確定了用表1所示的菌株產(chǎn)生了Monatin。也就是說，通過微生物轉(zhuǎn)化，從IHOG-肟生產(chǎn)了Monatin。
表1從IHOG-肟形成的Monatin


實施例2從底物IHOG-肟二鉀鹽生產(chǎn)Monatin將如表2所示的菌株用于轉(zhuǎn)化底物IHOG-肟二鉀鹽。以與實施例1相同的方式，實施制備微生物細(xì)胞的方法。使用如下所示的反應(yīng)溶液2和3作為反應(yīng)溶液。在30℃反應(yīng)24小時后，通過HPLC定量測定Monatin的生產(chǎn)量。結(jié)果，如表2所示，證實也可從IHOG-肟二鉀鹽生產(chǎn)Monatin。由反應(yīng)溶液3和反應(yīng)溶液4之間的比較，發(fā)現(xiàn)通過將NADH、NADPH、MgCl2、吡哆醛-5′-磷酸(PLP)等加入反應(yīng)溶液，可提高M(jìn)onatin的生產(chǎn)量。
反應(yīng)溶液2100mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM IHOG-肟二鉀鹽、1mM MgCl2、1mM吡哆醛-5′-磷酸(PLP)、25mM NADH、25mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
反應(yīng)溶液3100mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM IHOG-肟二鉀鹽以及1％(v/v)甲苯。
表2從底物IHOG-肟二鉀鹽生產(chǎn)的Monatin的量(mM)。


實施例3添加PLP、MgCl2、NAD(P)H的效果檢查加入PLP、MgCl2和NAD(P)H對弗氏檸檬酸桿菌IFO13546和中間埃希氏菌AJ2607的IHOG-肟的還原反應(yīng)的效果。
制備具有如表3所示組分的反應(yīng)溶液(反應(yīng)溶液4至9)，并以與實施例1相同的方法將其用于實施IHOG-肟的還原反應(yīng)，并定量由此生產(chǎn)的Monatin。
結(jié)果(表4)表明通過添加PLP、MgCl2或NAD(P)H，可提高由各個菌株生產(chǎn)的Monatin量。
用光學(xué)拆析柱CROWNPAK CR(+)鑒定由反應(yīng)溶液4生產(chǎn)的Monatin。結(jié)果，顯示產(chǎn)物是(2S，4S)-Monatin。
表3反應(yīng)溶液組分(單位mM)


表4Monatin的生產(chǎn)量(mM)


實施例4從IPA-肟(吲哚-3-丙酮酸-肟)生產(chǎn)色氨酸(Trp)將弗氏檸檬酸桿菌IFO 13546和中間埃希氏菌AJ 2607分別接種到肉湯平板(由Eiken Chemical Co.Ltd.制造)，并在30℃培養(yǎng)24小時。將所得的培養(yǎng)物接種到平板上，該平板含有0.5g/dl甘油、0.5g/dl富馬酸、0.3g/dl酵母提取物、0.2g/dl蛋白胨、0.5g/dl硫酸銨、0.3g/dl K2HPO4、0.1g/dl KH2PO4、0.05g/dl MgSO4·7H2O、0.2g/dl IHOG-肟二銨鹽以及2g/dl瓊脂粉(pH6.5)。然后將微生物在30℃培養(yǎng)24小時。將所得微生物細(xì)胞接種到下列反應(yīng)溶液10中，使?jié)裎⑸锛?xì)胞重量為約1％(w/v)，然后將反應(yīng)混合物在30℃反應(yīng)24小時。
反應(yīng)溶液10100mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM IPA-肟、1mMMgCl2、1mM吡哆醛-5′-磷酸(PLP)、25mM NADH、25mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
通過TLC對所產(chǎn)生的色氨酸進(jìn)行定性分析。將1μl反應(yīng)溶液點樣到TLC板硅膠60F254(由Merck制造)上，然后將這樣得到的平板浸入由正丁醇∶乙酸∶水(＝4∶1∶2)組成的溶液中并用茚三酮顯色。在Rf約0.52的位置將色氨酸檢測為紫色斑點。
為了定量分析產(chǎn)生的色氨酸，用HPLC分析已經(jīng)確認(rèn)產(chǎn)生了色氨酸的反應(yīng)溶液。結(jié)果，確定產(chǎn)生了色氨酸。也就是說，通過微生物轉(zhuǎn)化，從IHOG-肟生成了色氨酸。
(分析條件)柱Inertsil ODS-80A(GL Sciences，Inc.)檢測UV210nm洗脫液12％(v/v)乙腈/0.05％三氟乙酸水溶液流速1.5ml/min分析溫度30℃表5Trp的生產(chǎn)量


實施例5從BAE-肟生產(chǎn)β-苯基-β-丙氨酸(β-Phe)將弗氏檸檬酸桿菌IFO 13546和中間埃希氏菌AJ 2607作為測試菌株，并以與實施例4相同的方法將每種得到的微生物細(xì)胞接種到下列反應(yīng)溶液11中，使得濕微生物細(xì)胞重量為約1％(w/v)，然后將反應(yīng)混合物在30℃反應(yīng)24小時。
反應(yīng)溶液11110mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM BAE-肟、1mMMgCl2、1mM吡哆醛-5′-磷酸(PLP)、25mM NADH、25mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
通過TLC對所生成的產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。將1μl反應(yīng)溶液點樣到TLC板硅膠60F254(由Merck制造)上，然后將這樣得到的平板浸入由正丁醇∶乙酸∶水(＝4∶1∶2)組成的溶液中并用茚三酮顯色。在Rf約0.72的位置將β-苯基-β-丙氨酸乙酯檢測為黃斑，并在Rf約0.51的位置將β-苯基-β-丙氨酸檢測為褐斑。結(jié)果，在與β-苯基-β-丙氨酸相同的Rf附近檢測到了斑點。
然后通過HPLC分析已經(jīng)確定產(chǎn)生了β-苯基-β-丙氨酸的反應(yīng)溶液。結(jié)果，確定產(chǎn)生了β-苯基-β-丙氨酸。也就是說，通過微生物轉(zhuǎn)化，從BAE-肟產(chǎn)生了β-苯基-β-丙氨酸。
(分析條件)柱Inertsil ODS-80A(GL Sciences，Inc.)檢測UV210nm洗脫液12％(v/v)乙腈/0.05％三氟乙酸水溶液流速1.5ml/min分析溫度30℃表6β-苯基-β-丙氨酸的生成量


實施例6從15N標(biāo)記的IPA-肟(15N同位素標(biāo)記的吲哚-3-丙酮酸-肟)生產(chǎn)色氨酸(Trp)以與實施例4相同的方式培養(yǎng)中間埃希氏菌AJ 2607，來獲得濕微生物細(xì)胞。將所得微生物細(xì)胞接種到下列反應(yīng)溶液12中，使?jié)裎⑸锛?xì)胞重量為約1％(w/v)，然后將反應(yīng)混合物在30℃反應(yīng)24小時。
反應(yīng)溶液12100mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM15N-標(biāo)記的IPA-肟、1mM MgCl2、1mM吡哆醛-5′-磷酸(PLP)、25mM NADH、25mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
根據(jù)下列方法，制備15N-標(biāo)記的IPA-肟。在25℃在氬氣流中將1.413g(6.95mmol)吲哚丙酮酸和0.913ml 8N NaOH加入并溶于60ml水中。將0.5g(7.09mmol)15NH2OH鹽酸鹽和0.913ml 8N NaOH加入溶液，并在25℃攪拌1小時。用4.9ml 1N鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，并在25℃過夜攪拌。通過過濾來分離析出的晶體，并在減壓條件下于40℃干燥2.07g濕晶體，從而獲得0.81g(3.58mmol)15N-標(biāo)記的IPA-肟(面積純度(area purity)97.5％)。
作為通過LC-MS分析反應(yīng)溶液的結(jié)果，在15N-標(biāo)記的部分(section)中檢測到+206(相當(dāng)于15N)的峰，這表明肟已經(jīng)被酶促還原。
工業(yè)實用性本發(fā)明可用于生產(chǎn)各種氨基酸衍生物。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)氨基酸衍生物的方法，所述的方法包括如下步驟在微生物和/或酶的存在下，從由下列通式(I)表示的肟基酸 其中R1表示選自下列取代基任選取代的C2至C6的烷基、任選取代的C6至C14的芳基、任選取代的C6至C10的環(huán)烷基、任選取代的C7至C19的芳烷基、任選取代的C2至C10的烷氧基烷基、任選取代的基團(tuán)，其與上述任何一個基團(tuán)相同，除了在其碳架中含有雜原子，和下列通式(II)表示取代基R3 其中R4表示選自下列的取代基任選取代的C2至C6的烷基、任選取代的C6至C14的芳基、任選取代的C6至C10的環(huán)烷基、任選取代的C7至C19的芳烷基、任選取代的C2至C10的烷氧基烷基以及任選取代的基團(tuán)，其與上述任何一個基團(tuán)相同，除了在其碳架中含有雜原子；X1和X2獨立地表示羥基或羰基，R2表示C1至C3的烷基或氫原子；以及n是0或1，反應(yīng)生成由下列通式(III)表示的氨基酸衍生物 其中R1和n具有與通式(I)中R1和n相同的含義，其中微生物和/或酶能催化該反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1中所述的方法，其中n是0，并且由此生產(chǎn)的氨基酸衍生物是α-氨基酸衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1中所述的方法，其中由此生產(chǎn)的氨基酸衍生物是α-L-氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1中所述的方法，其中由此生產(chǎn)的氨基酸衍生物是α-D-氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1中所述的方法，其中n是1，并且由此生產(chǎn)的氨基酸衍生物是β-氨基酸衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1中所述的方法，其中芳基是任選取代的苯基或萘基。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1中所述的方法，其中芳烷基是任選取代的苯烷基或萘烷基。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1中所述方法，其中在碳架中含有雜原子的基團(tuán)是任選取代的吡啶基或吲哚基。
9.一種用于生產(chǎn)Monatin的方法，步驟包括在微生物和/或酶的存在下，從由通式(IV)表示的IHOG-肟 反應(yīng)生成由下列通式(V)表示的Monatin 其中微生物和/或酶能催化該反應(yīng)。
10.一種用于生產(chǎn)β-苯基-β-丙氨酸的方法，包括在微生物和/或酶的存在下從由通式(VI)表示的BAE-肟 反應(yīng)生成β-苯丙氨酸，其中微生物和/或酶能催化上述反應(yīng)。
11.一種用于生產(chǎn)色氨酸的方法，包括在微生物和/或酶的存在下從由通式(VII)表示的吲哚-3-丙酮酸-肟 反應(yīng)生成色氨酸，其中微生物和/或酶能催化該反應(yīng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1、9、10以及11中任意一項所述的方法，其中微生物是屬于選自下組的任何屬的一種或多種微生物檸檬酸桿菌屬、埃希氏菌屬以及紅球菌屬。
13.根據(jù)1、9、10以及11中任意一項所述的方法，其中微生物選自下組弗氏檸檬酸桿菌、中間埃希氏菌、大腸桿菌以及海生紅球菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1、9、10以及11中任意一項所述的方法，其中將選自NADH、NADPH、吡哆醛-5′-磷酸以及MgCl2中的一種或多種化合物加入由通式(I)表示的化合物產(chǎn)生由通式(III)表示的化合物的反應(yīng)溶液。
專利摘要
本發(fā)明提供工業(yè)上生產(chǎn)氨基酸衍生物的有利方法。提供用于生產(chǎn)氨基酸衍生物的方法，包括在微生物和/或酶的存在下從由上列通式(I)表示的肟基酸，其中R
文檔編號C12P13/22GKCN101035903SQ200580034027
公開日2007年9月12日 申請日期2005年9月29日
發(fā)明者杉山雅一, 渡部乙比古, 竹本正, 森健一 申請人:味之素株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan