專利名稱:經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶及其用途的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶(expandase)，特別是對(duì)于底物例如青霉素G具有增加的特異性的青霉素N擴(kuò)展酶。
發(fā)明背景由于低毒性、高特異性和抗多種多樣的病原生物體的臨床功效，β-內(nèi)酰胺抗生素占據(jù)了抗感染領(lǐng)域的主要部分。細(xì)菌和真菌物種中的許多生物產(chǎn)生傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺抗生素例如青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類，和非傳統(tǒng)的抗生素例如克拉維酸和沙納霉素。真菌家族的產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)和頂頭孢(Cephalosporiumacremonium)分別產(chǎn)生青霉素G和頭孢菌素C。帶小棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)這種細(xì)菌產(chǎn)生傳統(tǒng)的抗生素頭霉素和非傳統(tǒng)的抗生素克拉維酸，它因其β-內(nèi)酰胺酶抑制而被人們所熟知?？梢詤⒖季C述，例如Jensen，S.E.& Demain，A.L.(1993)，Biochemistryand Genetics of Antibiotics/Biosynthesis，eds Vining，L.C & Stuttard，C.，Butterworth-Heinemann，Boston，以獲得關(guān)于參與這些抗生素合成的各種酶的生物合成、基因調(diào)控和生物化學(xué)表征。
許多傳染性生物變得對(duì)于天然出現(xiàn)的青霉素抗生素具有抗性，抗性機(jī)制通過經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶的降解而起作用，因而需要新的且更有效的抗生素。頭孢菌素類在它們抵抗具有抗性的細(xì)菌的有效性方面是卓越的，因此重要的研究用于開發(fā)新的半合成衍生物。頭孢菌素衍生物例如頭孢氨芐、cephadoxyl和頭孢拉定通過將7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)與合適的側(cè)鏈偶聯(lián)來產(chǎn)生。目前，7-ADCA從苯基乙酰基7-ADCA生產(chǎn)，而苯基乙?；?-ADCA需通過昂貴的且有污染的化學(xué)工藝過程從青霉素G合成。因而需要生物轉(zhuǎn)化，其是本身環(huán)境友好的且能夠比化學(xué)工藝過程更便宜的過程。
也稱為去乙酰氧基頭孢菌素C合酶(DAOCS)的青霉素N擴(kuò)展酶是在諸如帶小棒鏈霉菌、耐內(nèi)酰胺鏈霉菌(Streptomyceslactamdurans)、Xanthomonas lactamgenus、黃桿菌屬物種(Flavobacterium sp)、Streptomyces organanensis、Streptomyceslactamgens、弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)和Streptomyces ofivaceus的物種中發(fā)現(xiàn)的酶，其催化青霉素的五元噻唑烷環(huán)轉(zhuǎn)化成頭孢菌素類的六元二氫噻嗪環(huán)，它正成為合成頭孢菌素衍生物的替代途徑的明顯的選擇。
已經(jīng)廣泛地表征了從帶小棒鏈霉菌分離的青霉素N擴(kuò)展酶，并描述于Kovacevic S等人，J.Bacteriol.171(2)754-760，1989，Dotzlaf，J.E.等人，J.Biol.Chem.26410219-10226，1989，和Valegard，K.等人，Nature 394805-809，1998之中。青霉素N是擴(kuò)展酶的一種天然底物，其不容易獲得，并且切割己二酰側(cè)鏈的效率很低。另一方面，青霉素G容易獲得，并且苯基乙酰基側(cè)鏈基團(tuán)能夠用青霉素G酰胺酶高效地切割?？墒?，青霉素G對(duì)于青霉素N擴(kuò)展酶來說是一種差的底物。因此，商業(yè)資本化要求對(duì)該擴(kuò)展酶進(jìn)行工程改造，這樣的經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶及其用途描述在WO01/85951、US6,699,699B2和US20030186354中。
US公開號(hào)20030186354公開了突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其在相應(yīng)于野生型擴(kuò)展酶的殘基位置的一個(gè)或多個(gè)殘基位置處包含氨基酸取代，所述殘基位置選自第73位的甲硫氨酸、第79位的甘氨酸、第275位的纈氨酸、第277位的亮氨酸、第281位的半胱氨酸、第300位的甘氨酸、第304位的天冬酰胺、第305位的異亮氨酸、第91位的蘇氨酸、第106位的丙氨酸、第155位的半胱氨酸、第184位的酪氨酸、第188位的甲硫氨酸和第244位的組氨酸，條件是在第304位的天冬酰胺殘基位置處的氨基酸取代不是N304L，和在第155位的半胱氨酸殘基位置處的氨基酸取代是C155Y。
本發(fā)明的主要目標(biāo)是提供突變的擴(kuò)展酶，其對(duì)于底物例如青霉素G或青霉素V具有比野生型擴(kuò)展酶高多倍的擴(kuò)展活性。
附圖描述
圖1SEQ ID NO1描述了帶小棒鏈霉菌的青霉素N擴(kuò)展酶的核苷酸和氨基酸序列。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明提供了具有修飾的或改進(jìn)的環(huán)擴(kuò)展活性的突變型青霉素?cái)U(kuò)展酶。優(yōu)選地，該擴(kuò)展酶是青霉素N擴(kuò)展酶，其經(jīng)過修飾從而與野生型擴(kuò)展酶相比具有增加的對(duì)于作為底物的青霉素G或青霉素V的活性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼所述擴(kuò)展酶突變的經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶基因。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶活性的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶基因的表達(dá)載體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主株系。
在另一方面，本發(fā)明提供了突變型青霉素?cái)U(kuò)展酶，其在相應(yīng)于野生型擴(kuò)展酶的殘基位置的一個(gè)或多個(gè)殘基位置處包含氨基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第152位的苯丙氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的氨基酸取代不是酪氨酸。特別地，本發(fā)明提供了突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其包含選自下列的一個(gè)或多個(gè)特殊的氨基酸取代T42A，I50V，H57R，T67A，V133I，T143S，P145L，G148E，F(xiàn)152L，P196S，A240T，C281R，S309P，V133I和P196S；F152L和C281R；T42A，F(xiàn)152L和S309P；V133I，T143S，P196S和S309P，其中氨基酸取代的殘基位置相應(yīng)于野生型擴(kuò)展酶的殘基位置。
在另一方面，本發(fā)明提供了在生物體中見到的天然或非天然出現(xiàn)的擴(kuò)展酶變體，所述生物體例如為耐內(nèi)酰胺鏈霉菌、Xanthomonaslactamgenus、黃桿菌屬物種(Flavobacterium sp.)、Flavobacieriumchitinovoruna、Streptomyces organanensis、耐內(nèi)酰胺諾卡氏菌(Nocardia lactamdurans)、利波曼鏈霉菌(Streptomyces limanii)、Streptomyces jumonjinensis、和田山鏈霉菌(Streptomyceswadayamensi)、卡特利鏈霉菌(Streptomyces cattleya)、Streptomyceslactamgens、弗氏鏈霉菌、灰色鏈霉菌、橄欖鏈霉菌(Streptomycesolivaceus)、鏈霉菌屬物種(Streptomyces sp.)和產(chǎn)黃支頂孢(Acremonium chrysogenun)，所述擴(kuò)展酶變體于在本發(fā)明中公開的類似位置處具有取代。
在另一方面，本發(fā)明提供了擴(kuò)展酶例如也稱為去乙酰氧基/去乙?；^孢菌素C合酶的擴(kuò)展酶/羥化酶的變體，其具有顯著的擴(kuò)展活性，并來自諸如產(chǎn)黃支頂孢的生物。所述變體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過將變體與SEQ ID NO1的序列進(jìn)行比對(duì)而得到鑒定。例如，通過將變體與SEQ ID NO1的序列進(jìn)行比對(duì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒定與SEQ ID NO1的第304位的天冬酰胺等價(jià)的氨基酸，從而鑒定出對(duì)于SEQ ID NO1的第304位來說等價(jià)的殘基。
含有經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶基因的經(jīng)修飾的大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在印度昌迪加爾(Chandigarh)的微生物模式培養(yǎng)物保藏中心(Microbial Type Culture CollectionCenter)，登錄號(hào)如下于2004年3月23日保藏的MTCC5133、MTCC5134、MTCC5135、MTCC5136、MTCC5137、MTCC5138、MTCC5139、MTCC5140、MTCC5141、MTCC5142、MTCC5143，和于2004年7月20日保藏的MTCC5160、MTCC5161、MTCC5162、MTCC5163、MTCC5164、MTCC5165和MTCC5166。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了突變型青霉素?cái)U(kuò)展酶，其與野生型擴(kuò)展酶相比顯示出優(yōu)選對(duì)于作為底物的青霉素G或青霉素V的增加的或修飾的環(huán)擴(kuò)展活性。
根據(jù)本發(fā)明的突變型青霉素?cái)U(kuò)展酶包括源自帶小棒鏈霉菌的擴(kuò)展酶或源自其他生物的擴(kuò)展酶。
來自帶小棒鏈霉菌的青霉素N擴(kuò)展酶的核苷酸和氨基酸序列顯示在SEQ ID NO1(圖1)中。
本發(fā)明的首要方面是提供對(duì)于青霉素G或青霉素V具有更好的底物特異性的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其中突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶在相應(yīng)于野生型擴(kuò)展酶的殘基位置的一個(gè)或多個(gè)殘基位置處包含氨基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第152位的苯丙氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的氨基酸取代不是酪氨酸。
在SEQ ID NO1的序列中的變化如下第50位的異亮氨酸被纈氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代；第67位的蘇氨酸被丙氨酸取代；第145位的脯氨酸被亮氨酸取代；第148位的甘氨酸被谷氨酸取代；
第152位的苯丙氨酸被亮氨酸取代；第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代；第133位的纈氨酸被異亮氨酸取代，和第196位的脯氨酸被絲氨酸取代；第152位的苯丙氨酸被亮氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸而非酪氨酸取代；第42位的蘇氨酸被丙氨酸取代，第152位的苯丙氨酸被亮氨酸取代，和第309位的絲氨酸被脯氨酸取代；第133位的纈氨酸被異亮氨酸取代，第143位的蘇氨酸被絲氨酸取代，第196位的脯氨酸被絲氨酸取代，和第309位的絲氨酸被脯氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代；第67位的蘇氨酸被丙氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代；第50位的異亮氨酸被纈氨酸取代，第152位的苯丙氨酸被亮氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第305位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，和第305位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代，和第305位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代；第67位的蘇氨酸被丙氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代，和第305位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代。
根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的肽可整合入所述的修飾，例如第50位的異亮氨酸的修飾。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明可以修飾具有不同于SEQ ID NO1的氨基酸序列的變體多肽。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用的變體是具有擴(kuò)展酶活性的變體。根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的變體是這樣的變體，即當(dāng)與未經(jīng)如此修飾的變體序列進(jìn)行比較時(shí)，其顯示出提高的擴(kuò)展環(huán)底物例如青霉素G或青霉素V的能力。
可以對(duì)氨基酸序列進(jìn)行氨基酸取代。SEQ ID NO1的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以可選擇地或附加地被刪除。本發(fā)明的多肽還包括上述序列的片段。這樣的片段保持了擴(kuò)展酶活性。
這樣的片段可用于通過使用源自其他擴(kuò)展酶多肽的酶的部分來產(chǎn)生嵌合型酶。
本發(fā)明的多肽可以是基本上分離的形式?？梢岳斫?，多肽可以和不會(huì)干擾所希望的該多肽的目的的載體或稀釋劑混合，而仍然被認(rèn)為是基本上分離的。本發(fā)明的多肽還可以是基本上純的形式，在此情況下，將會(huì)通常在制劑中包含多肽，在所述制劑之中超過90％，例如95％、98％或99％(重量)的制劑中的多肽是本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的多肽可以通過從重組表達(dá)載體原位表達(dá)該多肽而被引入細(xì)胞中。表達(dá)載體可選地?cái)y帶有可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子以控制該多肽的表達(dá)。
其中表達(dá)本發(fā)明多肽的這樣的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生苯基乙酰基7-ADCA。
本發(fā)明將用下面的實(shí)施例進(jìn)行舉例說明，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為限制了本發(fā)明的范圍。
所有的生化藥劑、試劑和寡核苷酸從Sigma-Aldrich ChemicalsPvt.Ltd或USB，USA獲得。限制酶和株系從New England Biolabs Inc，USA購買。pET24a(+)載體和BugBuster試劑從Novagen，USA購買。帶小棒鏈霉菌和產(chǎn)黃青霉菌株從ATCC獲得。
擴(kuò)展酶基因的克隆在具有180rpm的轉(zhuǎn)速的旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中，讓帶小棒鏈霉菌(ATCC27064)培養(yǎng)物于26℃在處于250ml錐形瓶中的50ml YMG培養(yǎng)基(每升含有酵母提取物4g，麥芽提取物10g，葡萄糖4g(pH7.0))之中生長，直至在600nm的O.D.達(dá)到3.00。將培養(yǎng)物于20℃在13000rpm下離心10分鐘以收獲細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸在含有10mg溶菌酶(200μl的50mg/ml原液)TE緩沖液pH8.0(培養(yǎng)物體積的1/10)中，并將混合物在30℃溫育30分鐘，隨后加入1ml 10％SDS、5ml用Tris-HCl(pH8.0)飽和的苯酚(phenol)和750μl 5M NaCl。將含有混合物的管輕輕地顛倒幾次，并在室溫下保持20分鐘。將懸浮液于20℃在16,000rpm下離心10分鐘以分離相。在將含水層轉(zhuǎn)移至新的離心管中之后，加入兩倍體積的異丙醇和將管輕輕地顛倒幾次，并將得到的混合物在室溫下保持10分鐘。再次于20℃在16,000rpm下離心10分鐘，并將沉淀重懸在TE緩沖液pH8.0中。在溶解了DNA之后，加入RNA酶A至終濃度為20μg/ml，并將懸浮液于50℃溫育1小時(shí)。然后，加入蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，隨后加入100mMNaCl和0.4％SDS，并將混合物在37℃下溫育1小時(shí)。再次用相同體積的苯酚萃取懸浮液，于20℃在16000rpm下離心10分鐘，和將含水層轉(zhuǎn)移至新的管中。類似地用氯仿萃取混合物，用異丙醇處理含水層并在-20℃保持1小時(shí)。通過于20℃在13,000rpm下離心10分鐘來沉淀出DNA，并將沉淀重懸在50μl TE(pH8)中。
使用寡核苷酸(5’GAGCATATGGACACGACGGTGCCC3’，5’GATTGCTGCTGTGACCATGACGGT3’)，從如上所述分離的帶小棒鏈霉菌(ATCC27064)基因組DNA中擴(kuò)增出擴(kuò)展酶基因，反應(yīng)體積為100μl，其中含有1X Vent DNA聚合酶緩沖液、10％DMSO、1mM MgSO4、2.5個(gè)單位的Deep Vent DNA聚合酶，并具有50μl的油覆蓋層。擴(kuò)增過程的組成為1個(gè)循環(huán)，95℃，5分鐘；25個(gè)循環(huán)，95℃，40秒用于變性，60℃，30秒用于退火，和72℃，5分鐘用于延伸；最后1個(gè)循環(huán)，72℃，15分鐘以進(jìn)行延伸。純化從擴(kuò)增產(chǎn)生的片段，并克隆入用SmaI進(jìn)行限制性消化的pUC19載體中。通過測(cè)序進(jìn)一步檢驗(yàn)基因的序列。
突變體的產(chǎn)生使用易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過偏置核苷酸濃度來誘變擴(kuò)展酶基因，其使用寡核苷酸(5’ATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATT3’，5’CTCACTCATTAGGCACCCCAGGCT3’)，反應(yīng)體積為100μl，其中含有1X Taq DNA聚合酶緩沖液、10％DMSO、10ng模板和3個(gè)單位的Taq DNA聚合酶。如對(duì)于擴(kuò)展酶基因的克隆所描述的，實(shí)施擴(kuò)增過程。進(jìn)一步純化片段，并用NdeI和BamHI進(jìn)行消化。將其以3∶1的摩爾比加入經(jīng)類似消化的pET24a中，并使用0.5mM ATP、10x T4DNA連接酶緩沖液和3個(gè)單位的T4 DNA連接酶通過在12℃溫育過夜而進(jìn)行連接。然后，將1μl連接混合物用于轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)。在卡那霉素下挑選出重組子。在一些情況下，將突變型模板用于產(chǎn)生附加的突變。
定位誘變單獨(dú)地或以多個(gè)組合，將整合有錯(cuò)配以引起希望的突變的寡核苷酸與單鏈模板退火，所述單鏈模板是在M13KO7輔助噬菌體的幫助下從大腸桿菌CJ236中產(chǎn)生的。通過如在Sambrook等人的“MolecularCloning，A laboratory Manual”，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989中所述的標(biāo)準(zhǔn)程序，分離天然或突變型擴(kuò)展酶基因模板的單鏈。然后，在存在200μM每種dNTPs、0.2mg/ml BSA、0.5mM ATP、2個(gè)單位的T4 DNA連接酶、3個(gè)單位的T4 DNA聚合酶和10mM MgCl2的情況下，以20μl的反應(yīng)體積，于42℃進(jìn)行體外第二條鏈合成20分鐘。在用EDTA終止反應(yīng)之后，將1μl用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。用限制酶切分析，并隨后用DNA測(cè)序來確認(rèn)突變體。
擴(kuò)展酶突變體的表達(dá)將擁有推定的突變型構(gòu)建體的大腸桿菌BL21(DE3)的單個(gè)菌落接種在含有補(bǔ)充了抗生素的LB的96孔培養(yǎng)板中，并在37℃和220rpm下生長。當(dāng)光密度達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG以誘導(dǎo)表達(dá)，并在25℃下再培養(yǎng)3小時(shí)。然后，將板在微量培養(yǎng)板離心機(jī)中以4000rpm進(jìn)行離心，并將沉淀重懸在含有50mM Tris.HCl(pH7.5)、1mM二硫蘇糖醇、0.01mM EDTA、10％甘油和50mM葡萄糖的緩沖液中，然后貯存于-80℃。
擴(kuò)展酶突變體的測(cè)定將表達(dá)分離物在冰上融化，并用100μl BugBuster試劑在25℃處理10分鐘以促進(jìn)細(xì)菌的裂解。通過如下步驟來開始擴(kuò)展酶測(cè)定向孔中加入30μl新制的10X混合物和30μl 100mM青霉素G底物，混合，用密封材料(breathseal)覆蓋，并在搖動(dòng)器中于25℃溫育30分鐘。混合物中的組分的終濃度為50mM硫酸胺、1mMα-酮戊二酸、50μM抗壞血酸鹽、2mM二硫蘇糖醇、2mM FeSO4和10mM青霉素G。通過加入150μlCH3OH和150μl H2O而淬滅反應(yīng)。
擴(kuò)展酶突變體的初級(jí)篩選將25μl測(cè)定混合物加載至空白的圓形紙片上，讓其干燥，并置于涂布有大腸桿菌ESS(由S.E.Jensen教授，University of Alberta，Canada友情提供)并含有青霉素酶的LB平板上。將平板在37℃溫育過夜，并將具有比天然擴(kuò)展酶大的抑制區(qū)域的克隆列入候選名單中以用于進(jìn)一步的定量和通過測(cè)序的確認(rèn)。
使用HPLC的擴(kuò)展酶活性的定量將測(cè)定樣品于4℃離心30分鐘，取20μl進(jìn)行注射，并在C18柱中使用甲醇和磷酸鹽緩沖液的混合物，通過HPLC監(jiān)測(cè)洗脫特性。青霉素G向頭孢菌素G的轉(zhuǎn)化通過使用頭孢菌素G作為標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行定量，少數(shù)幾個(gè)擴(kuò)展酶突變體的相對(duì)活性水平顯示在表1中。
表1擴(kuò)展酶突變體的相對(duì)比活性
權(quán)利要求
書(按照條約第19條的修改)1.突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其在相應(yīng)于野生型擴(kuò)展酶的殘基位置的一個(gè)或多個(gè)殘基位置處包含氨基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的氨基酸取代不是酪氨酸。
2.權(quán)利要求
1的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其中所述野生型擴(kuò)展酶獲自帶小棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)。
3.權(quán)利要求
1的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處包含選自下列的氨基酸取代T42A，I50V，H57R，T67A，V133I，T143S，P145L，G148E，P196S，A240T，C281R和S309P。
4.權(quán)利要求
1的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其包含下列的氨基酸取代V133I/P196S，F(xiàn)152L/C281R，T42A/F152L/S309P，V133I/T143S/P196S/S309P，H57R/A240T，H57R/A240T/C281R，T67A/A240T/C281R，I50V/F152L/A240T/C281R，H57R/A240T/I305M，H57R/I305M，H57R/A240T/C281R/I305M和T67A/A240T/C281R/I305M。
5.經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶基因，其編碼權(quán)利要求
1所述的擴(kuò)展酶突變。
6.經(jīng)修飾的來自產(chǎn)黃支頂孢(Acremonium chrysogenum)的去乙酰氧基/去乙?；^孢菌素C合酶，其在類似的權(quán)利要求
1所述位置處具有取代。
7.具有權(quán)利要求
1所述的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶的宿主株系。
8.具有權(quán)利要求
1所述的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶的表達(dá)載體。
權(quán)利要求
1.突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其在相應(yīng)于野生型擴(kuò)展酶的殘基位置的一個(gè)或多個(gè)殘基位置處包含氨基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第152位的苯丙氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的氨基酸取代不是酪氨酸。
2.權(quán)利要求
1的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其中所述野生型擴(kuò)展酶獲自帶小棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)。
3.權(quán)利要求
1的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處包含選自下列的氨基酸取代T42A，150V，H57R，T67A，V133I，T143S，P145L，G148E，F(xiàn)152L，P196S，A240T，C281R和S309P。
4.權(quán)利要求
1的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶，其包含下列的氨基酸取代V1331/P196S，F(xiàn)152L/C281R，T42A/F152L/S309P，V133I/T143S/P196S/S309P，H57R/A240T，H57R/A240T/C281R，T67A/A240T/C281R，I50V/F152L/A240T/C281R，H57R/A240T/I305M，H57R/I305M，H57R/A240T/C281R/I305M和T67A/A240T/C281R/I305M。
5.經(jīng)修飾的擴(kuò)展酶基因，其編碼權(quán)利要求
1所述的擴(kuò)展酶突變。
6.經(jīng)修飾的來自產(chǎn)黃支頂孢(Acremonium chrysogenum)的去乙酰氧基/去乙?；^孢菌素C合酶，其在類似的權(quán)利要求
1所述位置處具有取代。
7.具有權(quán)利要求
1所述的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶的宿主株系，于2004年3月23日保藏的MTCC 5133、MTCC 5134、MTCC 5135、MTCC 5136、MTCC 5137、MTCC 5138、MTCC 5139、MTCC 5140、MTCC 5141、MTCC 5142、MTCC 5143，和于2004年7月20日保藏的MTCC 5160、MTCC 5161、MTCC 5162、MTCC 5163、MTCC5164、MTCC 5165和MTCC 5166。
8.具有權(quán)利要求
1所述的突變的青霉素?cái)U(kuò)展酶的表達(dá)載體。
專利摘要
本發(fā)明涉及突變型青霉素?cái)U(kuò)展酶(expandase)，其在相應(yīng)于野生型擴(kuò)展酶的殘基位置的一個(gè)或多個(gè)殘基位置處包含氨基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第152位的苯丙氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的氨基酸取代不是酪氨酸。
文檔編號(hào)C12N1/21GKCN1965083SQ200580018407
公開日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年4月20日
發(fā)明者M·杜賴?yán)? V·維納亞加姆, V·蒂瓦里, B·阿西爾, T·J·馬西拉馬尼, M·拉溫德拉納塞恩 申請(qǐng)人:幽蘭化學(xué)醫(yī)藥有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan