專利名稱:一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于固定化酶技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及以精氨酸修飾交聯(lián)殼聚糖微球?yàn)檩d體，制備共固定化葡萄糖氧化酶(GOD)/過氧化氫酶(CAT)微球的技術(shù)。
背景技術(shù)：
固定化酶是將可溶性的酶束縛于水不溶性載體上的新型生物催化劑，與只能使用一次的游離酶相比較，固定化酶既具有游離酶的催化特性，又具有穩(wěn)定性好、可反復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，還可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝的連續(xù)化、自動(dòng)化，是生物催化劑的主要發(fā)展方向。
葡萄糖氧化酶(GOD)專一性催化β -D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。在食品行業(yè)，用于面粉改良、海產(chǎn)品保鮮、測(cè)定發(fā)酵液中糖含量；在醫(yī)藥領(lǐng)域，用于制備尿糖、血糖檢測(cè)試紙及口腔疾病防治；在生物技術(shù)領(lǐng)域：
，作傳感器電極等。過氧化氫酶(CAT)，專一性催化過氧化氫分解為水和氧氣，用于去除殘留的過氧化氫，廣泛應(yīng)用于紡織印染、造紙、廢水處理、牛奶保鮮以及臨床分析等方面。在GOD的催化反應(yīng)體系中，引入CAT，即將兩種酶固定于同一體系中，實(shí)現(xiàn)共固定化。這樣GOD催化反應(yīng)生成的過氧化氫，擴(kuò)散至CAT微環(huán)境的距離縮短，兩種酶的催化效率都得到提高。
現(xiàn)有的制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的工藝，例如《浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué)版)》2002年第2期中的“葡萄糖氧化酶-過氧化物酶膜共固定化的研究” 一文中，公開的方法是將葡萄糖氧化酶和過氧化物酶共同固定在尼龍-66薄膜載體上，用于制備檢測(cè)血糖濃度的試紙等。該方法的缺點(diǎn)是尼龍的強(qiáng)疏水性導(dǎo)致固定化酶的損失大，加之酶直接固定于膜表面，與膜表面的距離太近，形成大量細(xì)小窄縫，會(huì)阻礙血液大分子的傳遞，甚至導(dǎo)致阻塞；此外兩個(gè)酶隨機(jī)固定于膜上`，葡萄糖氧化酶產(chǎn)生的過氧化氫需要擴(kuò)散較長(zhǎng)的時(shí)間和距離才能到達(dá)過氧化物酶的活性中心，響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)。又如2008年10月15日公開的公開號(hào)為CN101285060的“殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法”專利，公開的方法是用半交聯(lián)法先制備出殼聚糖-精氨酸陰離子微球，然后以該微球?yàn)檩d體，以二環(huán)己基碳二亞胺為交聯(lián)劑，制備固定化胰凝乳蛋白酶的工藝。該法的優(yōu)點(diǎn)是以"柔性手臂"的精氨酸殘基固定化胰凝乳蛋白酶，獲得的固定化酶具有作用范圍較大、活力回收高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，說明殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂是性能優(yōu)良的固定化酶載體。該方法的主要缺點(diǎn)是，載體只固定了一個(gè)酶，而在相同的條件下，同種酶帶有相同電荷，相互排斥，難以實(shí)現(xiàn)氨基的充分利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有共固定化葡萄氧化酶和過氧化物酶的不足之處，提供一種以殼聚糖-精氨酸陰離子微球?yàn)檩d體，制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化物酶(G0D/CAT)微球的方法，該方法具有反應(yīng)條件溫和，酶活力回收較高，固定化酶半衰期長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單，成本較低，清潔安全等特點(diǎn)。
本發(fā)明的原理接枝于交聯(lián)殼聚糖上的精氨酸殘基含有兩個(gè)游離氨基，精氨酸殘基的兩氨基之間相隔4個(gè)碳-碳鍵與一個(gè)碳-氮鍵，均可分別接受GOD或CAT，因此，可通過交聯(lián)劑戊二醛分別與精氨酸殘基及酶表面的氨基反應(yīng)，形成固定化酶；即以該微球?yàn)檩d體，可制備出共固定化G0D/CAT ；共固定化酶中的GOD氧化葡萄糖為葡萄糖酸并產(chǎn)生過氧化氫，CAT分解過氧化氫為氧氣及水，從而保證GOD的穩(wěn)定性及高活性。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，以殼聚糖-精氨酸陰離子微球?yàn)檩d體，加入GOD和CAT混合溶液及戊二醛，經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)、過濾、洗滌、冷凍干燥，制備出共固定化GOD和CAT微球。其具體的方法步驟如下
(I)制備殼聚糖-精氨酸陰離子微球
依據(jù)《應(yīng)用化學(xué)》2009年7月第26卷第7期公開的“殼聚糖_精氨酸樹脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性質(zhì)” 一文，制備出殼聚糖-精氨酸陰離子微球。
(2)配制GOD和CAT混合溶液
第(I)步完成后，按照GOD CAT的活力比為1:1 6的比例，將GOD和CAT溶解于pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，收集含GOD和CAT的溶解液。對(duì)于收集的含GOD和CAT的混合溶液，用于制備共固定化G0D/CAT。
(3) GOD和CAT共固定化
第(2)步完成后，按照第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質(zhì)量(g)第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積(mL)比為1: 3 8的比例，先將殼聚糖-精氨酸陰離子微球分散于含GOD和CAT的混合溶液中，攪拌吸附30 60分鐘后，再按照戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 5 10的比例，將戊二醛溶液加入分散液中，在4 10°C下，反應(yīng)2 3小時(shí)，用于GOD和CAT的共固定化，收集反應(yīng)液。對(duì)于收集的反應(yīng)液，用于制備共固定化G0D/CAT微球。
(4)制備共固定化G0D/CAT微球
第(3)步完成后，將第(3)步收集的反應(yīng)液，進(jìn)行過濾，棄濾液，收集濾渣。對(duì)于收集的濾渣，用pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌3 5次，用于除去未固定的G0D/CAT，分別收集洗滌液和洗滌渣。對(duì)于收集的洗滌液，調(diào)節(jié)pH為3 8后，再次用于第(2)步；對(duì)于收集的洗滌渣，在溫度為-40 _50°C、真空度為20 50Pa的條件下，進(jìn)行冷凍干燥24 30小時(shí)，就制備出殼聚糖-精氨酸樹脂共固定化G0D/CAT微球。其中共固定化葡萄糖氧化酶的活力回收以GOD活力計(jì)為60. 25% 69. 37%。
本發(fā)明主要有以下效果
1、本發(fā)明方法充分利用了精氨酸作為“柔性手臂”，實(shí)現(xiàn)了在“柔性手臂”上的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的共固定化，減小了固定化酶的空間位阻效應(yīng)。
2、本發(fā)明充分利用了 GOD與CAT催化反應(yīng)的協(xié)同性，消除了 H2O2對(duì)GOD活性的破壞，共固定化酶的活力回收高，顯著延長(zhǎng)了共固定化G0D/CAT的使用壽命，可反復(fù)使用29 45次、連續(xù)使用45 70小時(shí)，生產(chǎn)成本低，有利于可持續(xù)發(fā)展。
3、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了兩種酶共固定于同一體系中。CAT微環(huán)境中的底物由距離很近的GOD催化反應(yīng)生成，兩種酶的穩(wěn)定性及催化效率均得以提高，從而提高了工業(yè)生產(chǎn)效率。
4、本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)單易行、反應(yīng)條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)單易得、無“三廢”排放等特點(diǎn)，是一種綠色環(huán)保的生產(chǎn)方法。
采用本發(fā)明方法制備出的產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品，水處理、水泥等行業(yè)中。還能作為除葡萄糖、脫氧、殺菌劑、葡萄糖定量分析試劑等。
四具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例1
一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，具體方法步驟如下
(I)制備殼聚糖-精氨酸陰離子微球
依據(jù)《應(yīng)用化學(xué)》2009年7月第26卷第7期公開的“殼聚糖_精氨酸樹脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性質(zhì)” 一文，制備出殼聚糖-精氨酸陰離子微球。
(2)配制GOD和CAT混合溶液
第(I)步完成后，按照GOD CAT的活力比為1:1 6的比例，將GOD和CAT溶解于pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，收集含GOD和CAT的溶解液。對(duì)于收集的含GOD和CAT的混合溶液，用于制備共固定化G0D/CAT。
(3) GOD和CAT共固定化
第(2)步完成后，按 照第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質(zhì)量(g)第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積(mL)比為1: 3 8的比例，先將殼聚糖-精氨酸陰離子微球分散于含GOD和CAT的混合溶液中，攪拌吸附30 60分鐘后，再按照戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 5 10的比例，將戊二醛溶液加入分散液中，在4 10°C下，反應(yīng)2 3小時(shí)，用于GOD和CAT的共固定化，收集反應(yīng)液。對(duì)于收集的反應(yīng)液，用于制備共固定化G0D/CAT微球。
(4)制備共固定化G0D/CAT微球
第(3)步完成后，將第(3)步收集的反應(yīng)液，進(jìn)行過濾，棄濾液，收集濾渣。對(duì)于收集的濾渣，用pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌3 5次，用于除去未固定的G0D/CAT，分別收集洗滌液和洗滌渣。對(duì)于收集的洗滌液，調(diào)節(jié)pH為3 8后，再次用于第(2)步；對(duì)于收集的洗滌渣，在溫度為-40 _50°C、真空度為20 50Pa的條件下，進(jìn)行冷凍干燥24 30小時(shí)，就制備出殼聚糖-精氨酸樹脂共固定化G0D/CAT微球。其中共固定化葡萄糖氧化酶的活力回收以GOD活力計(jì)為60. 25% 69. 37%。
實(shí)施例2
一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，同實(shí)施例1，其中
第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 4，將GOD和CAT溶解于pH 5的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中；
第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質(zhì)量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 5mL,攪拌吸附45分鐘后戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 7，在7°C下，反應(yīng)2. 5小時(shí)；
第⑷步中，用pH 5的O. 2mol/L磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖溶液液洗滌4次，冷凍干燥機(jī)的溫度為_45°C、真空度為35Pa，進(jìn)行冷凍干燥27小時(shí)。
實(shí)施例3
一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，同實(shí)施例1，其中[0040]第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 6，將GOD和CAT溶解于pH 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中；
第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質(zhì)量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 8mL，攪拌吸附60分鐘后戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 10，在10°C下，反應(yīng)3小時(shí)；
第(4)步中，用pH 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌5次，冷凍干燥機(jī)的溫度為_50°C、真空度為50Pa，進(jìn)行冷凍干燥30小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，其特征在于具體方法步驟如下 (1)制備殼聚糖-精氨酸陰離子微球 依據(jù)《應(yīng)用化學(xué)》2009年7月第26卷第7期公開的“殼聚糖_精氨酸樹脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性質(zhì)” 一文，制備出殼聚糖-精氨酸陰離子微球； (2)配制GOD和CAT混合溶液 第⑴步完成后，按照GOD CAT的活力比為1:1 6的比例，將GOD和CAT溶解于pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，收集含GOD和CAT的溶解液； (3)GOD和CAT共固定化 第(2)步完成后，按照第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質(zhì)量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 3 8mL的比例，先將殼聚糖-精氨酸陰離子微球分散于含GOD和CAT的混合溶液中，攪拌吸附30 60分鐘后，再按照戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 5 10的比例，將戊二醛溶液加入分散液中，在4 10°C下，反應(yīng)2 3小時(shí)，用于GOD和CAT的共固定化，收集反應(yīng)液； (4)制備共固定化G0D/CAT微球 第(3)步完成后，將第(3)步收集的反應(yīng)液，進(jìn)行過濾，棄濾液，收集濾渣，對(duì)于收集的濾渣，用pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌3 5次，分別收集洗滌液和洗滌渣，對(duì)于收集的洗滌渣，在溫度為-40 _50°C、真空度為20 50Pa的條件下，進(jìn)行冷凍干燥24 30小時(shí)，就制備出殼聚糖-精氨酸樹脂共固定化G0D/CAT微球。
2.按照權(quán)利要求
1所述的一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，其特征在于 第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 1，將GOD和CAT溶解于pH 3的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中； 第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質(zhì)量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 3mL,攪拌吸附30分鐘后，戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 5，在4°C下，反應(yīng)2小時(shí)； 第(4)步中，用pH 3的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌3次，冷凍干燥機(jī)的溫度為-40°C、真空度為20Pa,進(jìn)行冷凍干燥24小時(shí)。
3.按照權(quán)利要求
1所述的一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，其特征在于 第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 4，將GOD和CAT溶解于pH 5的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中； 第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質(zhì)量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 5mL，攪拌吸附45分鐘后，戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 7，在7°C下，反應(yīng)2. 5小時(shí)； 第(4)步中，用pH 5的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌4次，冷凍干燥機(jī)的溫度為_45°C、真空度為35Pa，進(jìn)行冷凍干燥27小時(shí)。
4.按照權(quán)利要求
1所述的一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，其特征在于 第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 6，將GOD和CAT溶解于pH 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中； 第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質(zhì)量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 8mL,攪拌吸附60分鐘后，戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 10，在10°C下，反應(yīng)3小時(shí)； 第(4)步中，用pH 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌5次，冷凍干燥機(jī)的溫度為_50 °C、真空度為50Pa，進(jìn)行冷凍干燥30小時(shí)。
專利摘要
一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，屬于固定化酶技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明以殼聚糖-精氨酸陰離子微球?yàn)檩d體，加入GOD和CAT混合溶液及戊二醛，經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)、過濾、洗滌、冷凍干燥，制備出共固定化GOD和CAT微球。本發(fā)明具有方法反應(yīng)條件溫和，酶活力回收較高，固定化酶半衰期長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單，成本較低，清潔安全等特點(diǎn)。采用本發(fā)明方法制備出的產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品，水處理、水泥等行業(yè)中。還能作為除葡萄糖、脫氧、殺菌劑、葡萄糖定量分析試劑等。
文檔編號(hào)C12N11/18GKCN102199592 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110084111
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年4月2日
發(fā)明者周小華, 王穎利, 康宏寬, 付雪梅, 周興 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),