專利名稱:一種利用rna干擾技術(shù)防治煙粉虱的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種利用RNA干擾技術(shù)防治煙粉虱的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
煙粉風(fēng)Bemisia tabaci (Gennadius)廣泛分布于全球除南極洲外的各大洲，是熱帶、亞熱帶及相鄰溫帶地區(qū)棉花、蔬菜和園林花卉等植物及大田作物的主要害蟲(chóng)之一(Brown et al.，1995)。它不僅取食寄主植物汁液，而且能夠傳播100多種病毒，分泌大量蜜露誘發(fā)煤污病影響光合作用(Liu et al. ,2006 ；Jiu et al.，2007)。煙粉虱也是科技界有史以來(lái)唯一被冠以“超級(jí)害蟲(chóng)”(superbug)的昆蟲(chóng)，近20年來(lái)給世界許多國(guó)家農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。煙粉虱在我國(guó)廣大地區(qū)已暴發(fā)成災(zāi)并造成嚴(yán)重危害，近年來(lái)煙粉虱傳播的雙生病毒在山東、浙江、江蘇等地區(qū)給番茄等蔬菜造成毀滅性的危害?，F(xiàn)在防治煙粉虱的主要手段為化學(xué)防治。如公開(kāi)號(hào)為CN1826890A(申請(qǐng)?zhí)枮?00510024189. 9)的中國(guó)專利，公開(kāi)了一種殺滅B型煙粉虱和有害節(jié)肢動(dòng)物的組合物，其特征在于它含有吡丙醚(4-苯氧基苯基(RS)-2-(2-吡啶基氧)丙基醚)和吡蟲(chóng)啉(1-(6_氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺)兩種活性成分，其吡丙醚和吡蟲(chóng)啉兩者的重量比在1/0.5至1/25之間?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用，不僅導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，破壞了環(huán)境與生態(tài)系統(tǒng)平衡，而且導(dǎo)致煙粉虱抗藥性逐年增強(qiáng)。目前，傳統(tǒng)的煙粉虱防治策略難以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，急需新的防控手段。
凋亡抑制蛋白(inhibitorof apoptosis protein, IAP)結(jié)合并抑制活性caspase的活性，從而阻止細(xì)胞死亡，甚至可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Deveraux and Reed,1999 ；ffei et al. , 2008 ；RumbIe and Duckett, 2008)。通過(guò) RNAi 或 cycloheximide 處理在果蜆S2細(xì)胞和草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) Sf21細(xì)胞去除IAP蛋白導(dǎo)致快速而廣泛的凋亡(Muro et al. ,2002)
RNA干擾(RNA interference, RNAi)應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)行精準(zhǔn)抗蟲(chóng)已成為近年來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn)(Gordon and Waterhouse, 2007 ；Castanotto and Rossi, 2008 ；Price and Gatehouse, 2008),已在鱗翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)中試驗(yàn)成功。例如，Mao等(2007)研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)P450基因(CYP6AE14)和谷胱甘肽基因GSTl dsRNA的棉花對(duì)取食的棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera(Hubner)幼蟲(chóng)誘導(dǎo)了 RNAi,阻礙了幼蟲(chóng)的發(fā)育,這一技術(shù)為防治農(nóng)作物害蟲(chóng)提供了新的策略。Baum等(2007)鑒定了玉米根螢葉甲Diabrotica virgiferavirgifera (Le Conte) 290個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，利用RNAi飼喂該蟲(chóng)幼蟲(chóng)的方法篩選出14個(gè)在低dsRNA濃度對(duì)昆蟲(chóng)具有致害效應(yīng)的基因。例如，低濃度的V型ATP酶A基因的dsRNA在攝食24小時(shí)內(nèi)快速下調(diào)內(nèi)源性mRNA，誘發(fā)特異性RNAi反應(yīng)；編碼V型ATP酶亞單位和β -微管蛋白的dsRNA能夠使昆蟲(chóng)產(chǎn)生系統(tǒng)性基因沉默。這些研究成果表明，RNAi在農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)行精準(zhǔn)抗蟲(chóng)方面具有重大的應(yīng)用前景。
由于煙粉虱為刺吸式昆蟲(chóng)，吸食植物汁液，所以不能直接飼喂煙粉虱dsRNA ;通過(guò)注射法也可進(jìn)行RNA干擾，但不能大量應(yīng)用于防治煙粉虱，并且由于煙粉虱蟲(chóng)體較小，注射容易損傷煙粉虱，導(dǎo)致其死亡。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用RNA干擾技術(shù)防治煙粉虱的方法。
—種利用RNA干擾技術(shù)防治煙粉虱的方法，步驟如下
(I)根據(jù)煙粉虱的基因序列選取RNAi的靶序列IAP基因，并設(shè)計(jì)靶序列的PCR擴(kuò)增引物，上游引物的5’端引入BglII酶切位點(diǎn)，下游引物的5’端引入Xho I酶切位點(diǎn)；
(2)提取煙粉虱的RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后用步驟⑴制得的PCR擴(kuò)增弓丨物對(duì)cDNA中含有的IAP基因的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化后制得目的基因；
(3)將步驟(2)制得的目的基因插入到PMD18-T載體中，用BglII和Xho I酶切獲得酶切片段，將其反向連接至pUC-RNAi載體，再用BamH I和Sal I酶切獲得酶切片段，將其正向連接至pUC-RNAi載體，用Pst I酶切pUC-RNAi載體，回收酶切片段，將其插入用Pst I酶切的表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S中，制得含有目的基因的表達(dá)載體；
(4)將步驟(3)制得的含有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化作物，獲得具有防治煙粉虱的轉(zhuǎn)基因作物，種植該作物即可。
所述步驟(I)中的引物，序列如下
上游引物IAP F :5’ -GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGTTTAG-3，, SEQ ID NO. I
下游引物IAP R :5’ -CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGAC-3，, SEQ ID NO. 2，上游引物的5’端引入BglII酶切位點(diǎn)，下游引物的5’端引入Xho I酶切位點(diǎn)(如下劃線所示)。
所述步驟⑵中PCR擴(kuò)增體系為2 μ I cDNA，20yM引物0·5μ 1(上游引物與下游引物濃度分別為2(^] )，5~4 1 Taq酶O. 5 μ 1，IOXTaq Buffer 5 μ I, IOmM dNTP I μ I,補(bǔ)ddH20至總體積50 μ I ;
PCR擴(kuò)增擴(kuò)增條件為94°C變性lmin，5rC退火lmin，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min,4°C保溫。
所述步驟⑷中的轉(zhuǎn)化為葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化。
所述作物為煙草(Nicotianatabacum) Nc89。
步驟(I)中所述煙粉風(fēng)的基因序列可參考Leshkowitz et al. (2006)；Whitefly (Bemisia tabaci) genome pro ject中的附件I的相關(guān)論述(該論文可登陸如下網(wǎng)址查看 http: //www. ncbi. nlm. nih. Rov/pmc/articles/PMC1488848/ tool = pubmed)。
上述方法的專用引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
上述步驟中，如無(wú)特別說(shuō)明，均可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，步驟(3)中將目的基因插入到pMD18-T載體、將酶切后的片段反向連接至pUC-RNAi載體、將酶切后的片段正向連接至pUC-RNAi載體、將酶切后的片段插入用Pst I酶切的表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S的具體操作步驟也可參見(jiàn)PMD18-T載體、pUC-RNAi載體、pCAMBIA2300_35S載體的使用說(shuō)明書(shū)。
有益效果
(I)本發(fā)明中通過(guò)篩選目的基因IAP基因，然后設(shè)計(jì)引物構(gòu)建含有IAP基因的轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)載體，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到作物中，生物學(xué)研究表明轉(zhuǎn)基因作物可導(dǎo)致50-70%煙粉虱死亡，為煙粉虱的防治提供了新的方法。
(2)本發(fā)明對(duì)于利用RNAi技術(shù)研究煙粉虱的基因功能、利用RNAi技術(shù)防治煙粉虱和轉(zhuǎn)基因植物防治煙粉虱具有重要的指導(dǎo)價(jià)值和理論意義。本發(fā)明是對(duì)以農(nóng)藥為主的防治煙粉虱的有益補(bǔ)充，為煙粉虱防治提供新的策略。
(3)通過(guò)飼喂表達(dá)IAP基因的轉(zhuǎn)基因植物來(lái)沉默特定基因進(jìn)而控制害蟲(chóng)，符合煙粉虱的習(xí)性，為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治領(lǐng)域提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持，迄今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)同類研究報(bào)道。表達(dá)IAP dsRNA基因的轉(zhuǎn)基因植物誘導(dǎo)害蟲(chóng)RNAi實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物抗害蟲(chóng)技術(shù)，可推廣到其它病害(包括病毒、細(xì)菌、真菌和昆蟲(chóng))，從而建立全面的農(nóng)作物改良分子調(diào)控技術(shù)體系。從這一思路出發(fā)，在將來(lái)的研究中針對(duì)災(zāi)區(qū)害蟲(chóng)的實(shí)際情況，選擇害蟲(chóng)的高度保守序列及與生命活動(dòng)相關(guān)的關(guān)鍵基因，利用本發(fā)明的分子調(diào)控技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)控制害蟲(chóng)的目的。因此，本發(fā)明具有較為廣闊的應(yīng)用前景。


圖I是PCR擴(kuò)增IAP基因片段；
其中M, Marker DL2000 ;1，PCR擴(kuò)增的IAP基因片段；2，PCR擴(kuò)增的IAP基因片段；3，PCR擴(kuò)增的IAP基因片段；4，PCR擴(kuò)增的IAP基因片段；5，PCR擴(kuò)增的IAP基因片段；6，PCR擴(kuò)增的IAP基因片段；
圖2是載體pCAMBIA2300-35S中表達(dá)IAP-dsRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；
圖3是Pst I酶切表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S進(jìn)行驗(yàn)證；
其中M，Marker DL2000 ;l，Pst I酶切表達(dá)載體的片段；2，Pst I酶切表達(dá)載體的片段；3，Pst I酶切表達(dá)載體的片段；4，Pst I酶切表達(dá)載體的片段；
圖4是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的IAP基因在RNA水平的表達(dá)；
其中M，Marker DL2000 ;1，轉(zhuǎn)基因煙草；2，正常煙草；
圖5是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的IAP基因在DNA水平的表達(dá)；
其中M，Marker DL2000 ;1，轉(zhuǎn)基因煙草；2，轉(zhuǎn)基因煙草；3，轉(zhuǎn)基因煙草；4，轉(zhuǎn)基因煙草；5，轉(zhuǎn)基因煙草；6，轉(zhuǎn)基因煙草；7，轉(zhuǎn)基因煙草；8，轉(zhuǎn)基因煙草；9，正常煙草；10，正常煙草；11，正常煙草；12，正常煙草；
圖6是檢測(cè)飼喂轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)煙粉虱IAP基因表達(dá)影響的電泳圖；
圖7是檢測(cè)飼喂轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)煙粉虱IAP基因表達(dá)影響的直方圖；其中*:P< O. 05 ；
圖8是檢測(cè)飼喂轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)煙粉虱死亡率的影響。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)內(nèi)容不僅限于此。
實(shí)施例中的pMD18-T載體購(gòu)于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；PCAMBIA2300-35S表達(dá)載體購(gòu)自CAMBIA公司；pUC_RNAi載體可為市售產(chǎn)品，本實(shí)施例中根據(jù)如下文獻(xiàn)制得Chen S, Hofius D, Sonnewald U,Bo+.rnke F (2003) Temporal and spatialcontrol of gene silencing in transgenic plants by inducible expression of double-stranded RNA. Plant J 36 :731_740 ;煙草種子Nc89購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所。
實(shí)施例I[0041]一種利用RNA干擾技術(shù)防治煙粉虱的方法，步驟如下
(I)根據(jù) Leshkowitz et al. (2006) Whitefly (Bemisia tabaci) genome project中的附件I選取RNAi的靶序列IAP基因，并設(shè)計(jì)靶序列的PCR擴(kuò)增引物，上游引物的5’端引入BglII酶切位點(diǎn)，下游引物的5’端引入Xho I酶切位點(diǎn)。
引物序列如下IAPF :5’ -GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGTTTAG-3，, IAP R 5 -CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGAC-3’，上下游引物的5’端各引入BglII和Xho I位點(diǎn)(下劃線)。
(2)收集煙粉虱，按TaKaRa RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)提取其RNA，用MBI公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, #K1622)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈。
PCR反應(yīng)體系為2 μ I。0嫩，引物2(^] 各0.5 4 1，5“4 1 Taq酶O. 5 μ 1，IOXTaqBuffer 5 μ 1，IOmM dNTP I μ 1，補(bǔ) ddH20 至總體積 50 μ I ;
PCR反應(yīng)條件為94°C變性lmin，51°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min，4°C保溫；經(jīng)電泳純化后制得目的基因；結(jié)果如圖I所示。
(3)將目的基因的PCR片段插入到pMD18-T載體中(條件步驟參見(jiàn)pMD18_T載體的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))，用BglII和Xho I內(nèi)切酶酶切，獲得大約441bp左右的片段，將其反向連接至pUC-RNAi載體(條件步驟參見(jiàn)pMD18-T載體的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))，再用BamH I和Sal I內(nèi)切酶酶切，獲得大約470bp左右的片段，將其正向連接至pUC-RNAi載體(條件步驟參見(jiàn)pMD18_T載體的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))，用Pst I內(nèi)切酶酶切pUC-RNAi載體，獲得1132bp左右的片段，回收酶切片段，將其插入用Pst I內(nèi)切酶酶切的表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S(購(gòu)自CAMBIA，Canberra，Australia,可登陸網(wǎng)址www. cambia. org購(gòu)買(mǎi))中(條件步驟參見(jiàn)pMD18_T載體的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))，并進(jìn)行酶切驗(yàn)證(如圖2和圖3所示)，制得含有目的基因的表達(dá)載體；
通過(guò)Pst I酶切含有目的基因的表達(dá)載體，獲得1132bp的片段，與預(yù)期相符，表明含有目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建成功。
(4)將步驟(3)制得的含有目的基因的表達(dá)載體葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草Nc89，提取抗性苗DNA，進(jìn)行目的基因PCR檢測(cè)(圖4和圖5)。
葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草Nc89為本領(lǐng)域常用技術(shù)，可參考如下步驟
I)煙草種子于70 %乙醇消毒30秒，無(wú)菌水沖洗3次，然后用10% H2O2消毒10分鐘，無(wú)菌水沖洗5次，播種于MS基本培養(yǎng)基中，至5-6片真葉期，備用；
2)挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于含有50mg/L鏈霉素(Sm)、25mg/L利福平(Rif)、50mg/L卡那霉素(Km)的LB培養(yǎng)基中，28°C，200rpm，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，將菌液用1/2MS培養(yǎng)液稀釋至OD6tltl = O. 2，待用；
3)取煙草葉片，切成小塊(O. 5X0. 5cm2)。
4)將切好的煙草葉片，置于MS分化培養(yǎng)基中，28°C，光照時(shí)間16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2000LX，預(yù)培養(yǎng)兩天；
5)將預(yù)培養(yǎng)后的煙草葉片浸入菌液5-10分鐘；然后用滅菌的濾紙吸干多余菌液，接入MS分化培養(yǎng)基；暗培養(yǎng)，28 0C，共培養(yǎng)2天；
6)共培養(yǎng)后的外植體先用含頭孢霉素250mg/L的無(wú)菌水洗滌3次，再用含頭孢霉素300mg/L的MS培養(yǎng)液洗I次，然后用滅菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)入含頭孢霉素300mg/L的MS分化培養(yǎng),恒溫恢復(fù)培養(yǎng)(條件同預(yù)培養(yǎng))3天；
7)恢復(fù)培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)到MS篩選培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng),每15天更換一次培養(yǎng)基；
8)待芽長(zhǎng)至Icm左右時(shí)，切下，移入MS生根培養(yǎng)基中，促其生根；
9)待轉(zhuǎn)基因煙草長(zhǎng)至3-4片葉時(shí)，將其葉片切下，置于MS分化培養(yǎng)基中，擴(kuò)繁；待根系發(fā)育好后(5-6片真葉)，移入盛有無(wú)菌土的花盆中，用地膜保濕2天后，溫室常規(guī)管理。
對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的IAP基 因分別在RNA和DNA水平進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因煙草的DNA水平有IAP基因的表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草的IAP基因的表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入煙草中，葉盤(pán)法轉(zhuǎn)基因成功；轉(zhuǎn)基因煙草的RNA水平?jīng)]有IAP基因的表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草中無(wú)IAP RNA，不會(huì)影響煙草的性狀。
轉(zhuǎn)基因煙草防治煙粉虱的效果檢測(cè)參照Pascual和Callejas (2003)方法(Pascual S, Callejas C(2004) · Intra-and interspecific competition betweenbiotypes B and Q of Bemisia tabaci(Hemiptera Aleyrodidae)from Spain.BullEntomol Res 94 =369-375.)，以飼喂正常煙草葉片的煙粉虱為對(duì)照，觀察飼喂轉(zhuǎn)基因煙草葉片的煙粉虱情況(圖6、圖7和圖8)。
飼喂煙粉虱轉(zhuǎn)基因煙草后，煙粉虱的IAP基因的表達(dá)水平明顯降低，表明RNA干擾沉默了 IAP基因的表達(dá)；飼喂轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，表明轉(zhuǎn)基因煙草具有防治煙粉虱的作用。
本發(fā)明所保護(hù)的技術(shù)方案并不僅限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本實(shí)施例記載的內(nèi)容，不經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)對(duì)其進(jìn)行部分修改，也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。如可將實(shí)施例中的方法應(yīng)用于番茄、茄子、棉花等植物中，也能達(dá)到本發(fā)明所要求的技術(shù)效果。
權(quán)利要求
1.一種利用RNA干擾技術(shù)防治煙粉虱的方法，步驟如下 (1)根據(jù)煙粉虱的基因序列選取RNAi的靶序列基因，并設(shè)計(jì)靶序列的PCR擴(kuò)增引物，上游引物的5’端引入II酶切位點(diǎn)，下游引物的5’端引入通0 I酶切位點(diǎn)； (2)提取煙粉虱的RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后用步驟(I)制得的PCR擴(kuò)增引物對(duì)cDNA中含有的IAP基因的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化后制得目的基因； (3)將步驟(2)制得的目的基因插入到pMD18-T載體中，用汝·7II和通ο I酶切獲得酶切片段，將其反向連接至pUC-RNAi載體，再用B論I和Sal I酶切獲得酶切片段，將其正向連接至pUC-RNAi載體，用Pst I酶切pUC-RNAi載體，回收酶切片段，將其插入用Pst I酶切的表達(dá)載體PCAMBIA2300-35S中，制得含有目的基因的表達(dá)載體； (4)將步驟(3)制得的含有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化作物，獲得具有防治煙粉虱的轉(zhuǎn)基因作物，種植該作物即可； 所述步驟(I)中的引物，序列如下 上游引物GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGITTAG， 下游引物CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGAC。
2.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增體系為
2 μ I cDNA, 20 μ M引物O. 5 μ 1，5 U/μ I Taq酶O. 5 μ 1,10 X Taq Buffer 5 μ I,10 mM dNTP I μ 1，補(bǔ) ddH20 至總體積 50 μ I ; PCR擴(kuò)增擴(kuò)增條件為94°C變性I min，51°C退火I min，72°C延伸I min，共30個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 7 min，4°C 保溫。
3.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的轉(zhuǎn)化為葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化。
4.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述作物為煙草Nc89。
5.一種權(quán)利要求
I所述方法的專用引物，其特征在于，上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
專利摘要
本發(fā)明是一種利用RNA干擾技術(shù)防治煙粉虱的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法，步驟如下(1)根據(jù)煙粉虱的基因序列選取RNAi的靶序列IAP基因，并設(shè)計(jì)靶序列的PCR擴(kuò)增引物；(2)提取煙粉虱的RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后PCR擴(kuò)增cDNA，純化后制得目的基因；(3)將目的基因插入到表達(dá)載體，制得含有目的基因的表達(dá)載體；(4)將含有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化作物，獲得具有防治煙粉虱的轉(zhuǎn)基因作物，種植該作物即可。本發(fā)明對(duì)于利用RNAi技術(shù)研究煙粉虱的基因功能、利用RNAi技術(shù)防治煙粉虱和轉(zhuǎn)基因植物防治煙粉虱具有重要的指導(dǎo)價(jià)值和理論意義。
文檔編號(hào)C12N15/63GKCN102212522 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110110537
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年4月29日
發(fā)明者劉國(guó)霞, 夏晗, 安立國(guó), 畢玉平, 王興軍, 范仲學(xué), 褚棟, 郭強(qiáng), 陶云荔 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),