專利名稱:一種在聚電解質(zhì)離子的協(xié)同作用下對青霉素?；傅墓潭ǚ椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將青霉素?；?PGA)在聚電解質(zhì)離子的協(xié)同作用下固定在高聚物形成的固體網(wǎng)格之中的方法，并應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺類抗生素及其母核的工業(yè)制備和合成過程。
背景技術(shù)：
二十世紀60年代早期β-內(nèi)酰胺抗生素半合成工業(yè)漸漸興起，這使得β-內(nèi)酰胺的母核6-氨基青霉素烷酸(6-APA)成為重要的藥物合成中間體。因此，人們首先開始通過青霉素?；?PGA)裂解青霉素G來合成6-APA。隨后，由于PGA獨特的選擇性，人們又研究利用PGA的選擇催化作用，以6-APA或7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)為β-內(nèi)酰胺的母核，再加上適當?shù)膫?cè)鏈來半合成β-內(nèi)酰胺抗生素。
四十余年來，經(jīng)過不斷的篩選和基因重組的PGA變得越來越穩(wěn)定，酶的生產(chǎn)能力也不斷的得到提高，再加上有效的固定化方法使得酶的回收變成可能，該方法的成本也被大大的降低。
現(xiàn)在，通過酶的這一催化作用，全世界一年可以生產(chǎn)20000噸的6-APA，而相應(yīng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，如頭孢氨芐，阿莫西林和頭孢羥氨芐等，也已經(jīng)逐漸實現(xiàn)了工業(yè)化。
但值得注意的是，有效的PGA固定化方法是酶促裂解青霉素G和β-內(nèi)酰胺抗生素半合成的關(guān)鍵。所以現(xiàn)在對于這一領(lǐng)域的研究也相當重視。
總體說來，酶的固定化方法有三大類1、載體結(jié)合法將酶共價結(jié)合到一個預(yù)制載體上。載體通常使用合成樹脂，生物高聚體或無機材料等。
2、包埋法將酶物理包埋于聚合物的網(wǎng)格(如凝膠格子)或有孔纖維、微囊之類的膜中。這其中采用的物理作用力非常弱，但是卻可以阻止酶的活性構(gòu)象被破壞。但有時也會對酶再進行一次共價結(jié)合處理。
3、酶交聯(lián)晶體或聚沉體法主要是用雙官能團試劑對酶進行無載體交聯(lián)制備酶顆粒。
青霉素?；傅墓潭ɑ椒盎囊灿泻芏喾N。例如，以丙烯酸樹脂及其衍生物的多元共聚物為載體的共價結(jié)合固定化方法，這類載體常見的有Eupergit C和Amberlite系列等。荷蘭DSM公司發(fā)明的明膠-殼聚糖凝膠包埋青霉素?；傅姆椒ā４送膺€有許多以無機硅材料，分子篩，硅藻土等各種材料為載體通過物理吸附，共價交聯(lián)等各種方法來固定化青霉素?；傅耐緩?。酶交聯(lián)晶體或聚沉體法也有過報道，但由于自身條件限制，該種固定化的青霉素酰化酶不能用于β-內(nèi)酰胺抗生素的工業(yè)化大生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種更高效的青霉素酰化酶的固定化方法。以聚電解質(zhì)離子的協(xié)同作用，先將青霉素?；赴裼诰垭娊赓|(zhì)離子形成的固體網(wǎng)格之中，再通過交聯(lián)劑的作用進一步提高其機械強度和穩(wěn)定性。
這種在聚電解質(zhì)離子的協(xié)同作用下對青霉素酰化酶進行固定的方法，包括如下步驟(1)將濃度為100～3000U/ml的青霉素?；傅娜芤号c聚陰離子溶液進行預(yù)混合，得到預(yù)混合液，然后將預(yù)混合液與聚陽離子溶液混合，生成帶有絮狀沉淀的懸濁液；(2)將帶有絮狀沉淀的懸濁液進行攪拌，攪拌下加入硅烷類物質(zhì)并均勻混合，加入交聯(lián)劑，再經(jīng)過陳化，真空干燥，研磨，得到顆粒狀的青霉素?；腹潭ɑa(chǎn)物。
所述的聚陰離子溶液是將聚陰離子溶于pH值5.0～9.0的磷酸緩沖溶液或8.0～11.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，所述的聚陰離子為聚對苯乙烯磺酸鈉、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸或海藻酸鈉中的一種或幾種。
所述的聚陽離子溶液是將聚陽離子溶于pH值3.5～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液或5.0～9.0的磷酸緩沖溶液中，所述的聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚三甲基烯丙基氯化銨、聚二甲基二烯丙基氯化銨或聚烯丙基氯化銨中的一種或幾種。
所述的青霉素酰化酶與聚陰離子溶液進行預(yù)混合時pH值控制在5.0～11.5；所述的預(yù)混合液與聚陽離子溶液進行混合時pH值控制在3.5～9.0。聚陰離子溶液濃度為0.1mg/ml～0.2g/ml；聚陽離子溶液濃度為0.1mg/ml～0.2g/ml。
所述的硅烷類物質(zhì)為四甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷含氨基衍生物、四甲氧基硅烷含環(huán)氧基團衍生物、四甲氧基硅烷含羧基衍生物、四乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷含氨基衍生物、四乙氧基硅烷含環(huán)氧基團衍生物或四乙氧基硅烷含羧基衍生物。硅烷類物質(zhì)的用量為聚陽離子質(zhì)量的0.2～5.0倍。
所述的交聯(lián)劑為戊二醛、乙二醛、甲醛、N，N-二甲基甲酰胺或環(huán)氧氯丙烷。交聯(lián)劑的用量為硅烷類物質(zhì)質(zhì)量的0.1％～20％。
步驟(1)中，由于酶自身表面的電荷分布并不均勻，通過緩沖液的控制可以使酶的表面更多的富集正電荷或負電荷，本發(fā)明方法中是采用在酶表面富集陽離子的方法，與聚陰離子溶液進行混合，得到的溶液再與聚陽離子進行混合。由于聚電解質(zhì)自身正負離子的聚沉作用，這樣就可以得到通過靜電力作用的包覆有酶的聚電解質(zhì)絮狀沉淀體。
步驟(1)是整個青霉素酰化酶固定化最主要的部分，因為它不僅涉及到青霉素?；傅墓潭?，也對最后產(chǎn)物的活性，回收率等等主要參數(shù)有極大的影響，并且之后的處理過程也是以此步驟為基礎(chǔ)的。因此，必須選取合適的聚電解質(zhì)離子和優(yōu)化各物質(zhì)之間合適的比例，還要嚴格控制各種物質(zhì)溶液的pH值。
步驟(2)的主要出發(fā)點是考慮到絮狀沉淀并非是工業(yè)上所能直接采用的固定化產(chǎn)物，因為工業(yè)需要的固定化酶必須要易于分離，并且有一定的機械強度，這都是絮狀沉淀物所不能達到的。所以，在這一懸濁液中加入一定量的硅烷，并加入交聯(lián)劑，用一種類似于溶膠凝膠法的方法來制得顆粒狀的固定化酶，并達到一定的機械強度，以適于工業(yè)生產(chǎn)的要求。
因此，這一過程中的助劑硅烷和交聯(lián)劑的選擇及用量是很重要的，這影響到最后產(chǎn)物的顆粒大小和機械強度。
通過本發(fā)明方法固定的青霉素酰化酶，保留了酶自身較高的穩(wěn)定性和活性，又使得整個固定化產(chǎn)物本身能較好的適應(yīng)于β-內(nèi)酰胺抗生素工業(yè)化生產(chǎn)中惡劣的環(huán)境條件。
圖1為青霉素?；赴裼诰坳栯x子與聚陰離子形成的網(wǎng)格中的示意圖具體實施方式
實施例1取1.0g聚對苯乙烯磺酸鈉溶于20ml pH值7.4的磷酸緩沖溶液中，再加入5ml1000U/ml的青霉素?；杆芤?。另取1.0g聚二甲基二烯丙基氯化銨溶于30ml pH值7.4的磷酸緩沖溶液中。將兩份溶液在150ml圓底燒瓶中混合，立刻可得到白色極細的絮狀沉淀。機械攪拌，并加入5ml氨丙基三甲氧基硅烷，1小時之后，停止攪拌，并立刻加入5ml 25％的戊二醛水溶液，陳化24小時后，洗滌沉淀物至檢測不出戊二醛，室溫真空干燥，產(chǎn)品取出研磨，可得顆粒狀青霉素?；腹潭ɑa(chǎn)物，活力可達1000～1200U/g。
實施例2取1.0g羧甲基纖維素鈉溶于20ml pH值9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，再加入5ml 1000U/ml的青霉素酰化酶水溶液。另取1.0g聚乙烯亞胺溶于30ml pH值4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液中。將兩份溶液在150ml圓底燒瓶中混合，立刻可得到白色絮狀沉淀。機械攪拌，并加入5ml環(huán)氧丙基三乙氧基硅烷，1小時之后，停止攪拌，并立刻加入5ml環(huán)氧氯丙烷，機械攪拌2小時，靜置24小時后，洗滌沉淀物，室溫真空干燥，產(chǎn)品取出研磨，可得顆粒狀青霉素?；腹潭ɑa(chǎn)物，活力可達1200～1500U/g。
實施例3取1.0g海藻酸鈉溶于20ml pH值8.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，再加入5ml 1000U/ml的青霉素?；杆芤?。另取0.8g聚烯丙基氯化銨溶于40ml pH值6.8的磷酸緩沖溶液中。將兩份溶液在150ml圓底燒瓶中混合，立刻可得到乳白色細小顆粒沉淀。機械攪拌，并加入5ml氨丙基三乙氧基硅烷，1小時之后，停止攪拌，并立刻加入8ml甲醛水溶液，陳化24小時后，洗滌沉淀物，室溫真空干燥，產(chǎn)品取出研磨，可得顆粒狀青霉素?；腹潭ɑa(chǎn)物，活力可達1100～1400U/g。
權(quán)利要求
1.一種在聚電解質(zhì)離子的協(xié)同作用下對青霉素?；傅墓潭ǚ椒?，包括如下步驟(1)將濃度為100～3000U/ml的青霉素酰化酶的溶液與聚陰離子溶液進行預(yù)混合，得到預(yù)混合液，然后將預(yù)混合液與聚陽離子溶液混合，生成帶有絮狀沉淀的懸濁液；(2)將帶有絮狀沉淀的懸濁液進行攪拌，攪拌下加入硅烷類物質(zhì)并均勻混合，加入交聯(lián)劑，再經(jīng)過陳化，真空干燥，研磨，得到顆粒狀的青霉素酰化酶固定化產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的聚陰離子溶液是將聚陰離子溶于pH值5.0～9.0的磷酸緩沖溶液或8.0～11.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液中，所述的聚陰離子為聚對苯乙烯磺酸鈉、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸或海藻酸鈉中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的聚陽離子溶液是將聚陽離子溶于pH值3.5～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液或5.0～9.0的磷酸緩沖溶液中，所述的聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚三甲基烯丙基氯化銨、聚二甲基二烯丙基氯化銨或聚烯丙基氯化銨中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的聚陰離子溶液濃度為0.1mg/ml～0.2g/ml；聚陽離子溶液濃度為0.1mg/ml～0.2g/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的青霉素酰化酶與聚陰離子溶液進行預(yù)混合時pH值控制在5.0～11.5；所述的預(yù)混合液與聚陽離子溶液進行混合時pH值控制在3.5～9.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的硅烷類物質(zhì)為四甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷含氨基衍生物、四甲氧基硅烷含環(huán)氧基團衍生物、四甲氧基硅烷含羧基衍生物、四乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷含氨基衍生物、四乙氧基硅烷含環(huán)氧基團衍生物或四乙氧基硅烷含羧基衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的硅烷類物質(zhì)的用量為聚陽離子質(zhì)量的0.2～5.0倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑為戊二醛、乙二醛、甲醛、N，N-二甲基甲酰胺或環(huán)氧氯丙烷。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑的用量為硅烷類物質(zhì)質(zhì)量的0.1％～20％。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種在聚電解質(zhì)離子的協(xié)同作用下對青霉素?；高M行固定的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將濃度為100～3000U/ml的青霉素酰化酶的溶液與聚陰離子溶液進行預(yù)混合，然后將預(yù)混合液與聚陽離子溶液混合，生成帶有絮狀沉淀的懸濁液；(2)將帶有絮狀沉淀的懸濁液進行攪拌，攪拌下加入硅烷類物質(zhì)并均勻混合，加入交聯(lián)劑，再經(jīng)過陳化，真空干燥，研磨，得到顆粒狀的青霉素?；腹潭ɑa(chǎn)物。通過本發(fā)明方法固定的青霉素酰化酶，提高了的酶活性和使用穩(wěn)定性，可以改善β－內(nèi)酰胺抗生素工業(yè)化生產(chǎn)條件，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N9/78GK1995338SQ200610155522
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月28日
發(fā)明者林賢福, 吳起, 金鑫, 呂德水, 陳志春 申請人:浙江大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan