專利名稱:L-肉毒堿的微生物學(xué)制備方法
人們已知，用r-三甲銨丁內(nèi)酯(r-Butyrobotaine)作原料可以制造L-肉毒堿(L-Betain)。有一種工藝方法是，在有2-氧代戊二酸鈉(Natrium-2-oxoglutarat)、還原劑、鐵離子源及作為羥基供給體的空氣氧存在下，使r-三甲銨丁內(nèi)酯與由粗糙鏈孢霉孢子(Sporen von Neurospora crassa)釋放出來的羥化酶相接觸(美國書第43 71 618號)。這種工藝方法的缺點是需要很多輔助因素。于是乎在反應(yīng)中要使化學(xué)計算量的2-氧代戊酸鹽(2-Oxoglutarat)用氧化法脫去羧基、生成丁二酸鹽(Succinat)。作為O2的活化劑，需用Fe2+;為使鐵離子保持還原態(tài)，需用抗壞血酸;為分解有害的痕跡量H2O2，需用過氧化氫酶(Katalase)。
林特施泰特(Lindstedt)等(Biochemistry 6，1262-1270(1967)“The Formation and Degradation of Carnitine in Pseudomonas”)分離出一種以r-三甲銨丁內(nèi)酯為碳、氮來源而生長成的假單胞菌屬微生物。降解過程的第一步反應(yīng)是將r-三甲銨丁內(nèi)酯經(jīng)羥基化反應(yīng)生成L-肉毒堿，并將中間存在的L-肉毒堿進一步完全分解代謝成CO2、H2O及NH3。
即使利用這種由細(xì)菌制得的羥化酶(Hydroxylase)來制造L-肉毒堿，也仍存在上述需要輔助因素的缺點(Lindstedt et al，Biochemistry 16，2181-2188(1977)”Purificat-iom and Properties of r-Butyrobetaine Hydrox-ylase from Pseudomonas sp.AK 1”)。
本發(fā)明所賴以為基礎(chǔ)的任務(wù)是找出一種新的微生物，這種微生物不具有上述已知工藝方法的缺點，并使人們有可能使用簡單的方法以三甲銨丁烯內(nèi)酯(Crotonobetain)、三甲銨丁內(nèi)酯或其混合物為原料不制造外消旋鹽，而制造有拮抗選擇性的L-肉毒堿。
本發(fā)明的微生物不同于現(xiàn)有技術(shù)中已知系統(tǒng)的是，使用H2O作為羥基供給體，而不使用O2作為羥基供給體。這可以使用H182O及18O2進行仔細(xì)的試驗來證實。
本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的微生物有能力以三甲銨丁烯內(nèi)酯及/或r-三甲銨丁內(nèi)酯為原料來生產(chǎn)L-肉毒堿，而且不會將其分解代謝。
對取自四大洲的土壤樣品進行了對比試驗，正如試驗結(jié)果所表明的那樣，到處都存在將三甲銨丁內(nèi)酯和三甲銨丁烯內(nèi)酯經(jīng)由L-肉毒堿進行行分解代謝的微生物。從廢水處理設(shè)備的加菌淤渣中也可以成功分離出這類微生物。如果將這類微生物按照下面所述的本發(fā)明原理進行誘變，則有可能將所有這類菌種用來生產(chǎn)L-肉毒堿。
這種誘變種可以通過下列選擇方法而得到1)將以三甲銨乙內(nèi)酯(Betain)、r-三甲銨丁內(nèi)酯、三甲銨丁烯酯及L-肉毒堿為碳、氮來源生長的微生物用常規(guī)的方法進行誘變。2)從通過培養(yǎng)得到的已誘變的微生物培養(yǎng)物中選擇出那些不分解代謝L-肉毒堿而且不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內(nèi)酯、r-三甲銨丁內(nèi)酯而僅依靠三甲銨乙內(nèi)酯生長的穩(wěn)定微生物。
最好在接著的選擇步驟2)之后選擇出那些分泌L-肉毒堿又不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內(nèi)酯、r-三甲銨丁內(nèi)酯而僅依靠三甲銨乙內(nèi)酯生長的微生物。
相應(yīng)地將那些已誘變過的微生物在三甲銨乙內(nèi)酯培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)并在進行選擇步驟2)之前，將這些已繼續(xù)培養(yǎng)過的微生物最好在L-肉毒堿培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)以三甲銨乙內(nèi)酯、r-三甲銨丁內(nèi)酯、三甲銨丁烯內(nèi)酯及L-肉毒堿為碳、氮來源生長的菌種相宜地應(yīng)這樣進行，即通過三甲銨丁烯內(nèi)酯營養(yǎng)液接種使混合培養(yǎng)物由細(xì)菌混合物產(chǎn)生出來、然后藉助傳統(tǒng)的微生物學(xué)技術(shù)再用該混合培養(yǎng)物作原料對那些能降解三甲銨丁烯內(nèi)酯的微生物進行純培養(yǎng)。
這樣一種以三甲銨乙內(nèi)酯、r-三甲銨丁內(nèi)酯、三甲銨丁烯內(nèi)酯及L-肉毒堿作為碳、氮來源生長的培養(yǎng)物之誘變，可以按照已知的方法來進行〔J.H.Miller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1972〕。
制備穩(wěn)定誘變種的那些合宜方法為移碼法、缺失法或者轉(zhuǎn)座子嵌入法。
然后，將這些經(jīng)上述方法誘變過的微生物在三甲銨乙內(nèi)酯培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)并在轉(zhuǎn)移到L-肉毒堿培養(yǎng)基之后進行選擇步驟2)，在選擇步驟2)中，藉助已知的“反選擇劑”〔P.Gerhardtet al(ads.)，Manual af Methods for General Bacterio-logy，Am.SOc.for Microbiology，1981〕來選擇那些始終不分解代謝L-肉毒堿且不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內(nèi)酯、r-三甲銨丁內(nèi)酯而依靠三甲銨乙內(nèi)酯生長的微生物。
一種以三甲銨乙內(nèi)酯、r-三甲銨丁內(nèi)酯、三甲銨丁烯內(nèi)酯、L-肉毒堿為碳、氮來源生長的較佳微生物是HK4菌種(DSM Nr.2938)及其后代與誘變種。
這種菌種已於1984年3月3日以保藏號Nr.DSM 2938保藏在德意志聯(lián)邦共和國4300 Goettingen市Griesebach街8號生物技術(shù)研究有限公司德意志微生物保藏所。
HK4(DSM Nr.2938)菌種的科學(xué)描述細(xì)胞形態(tài) 芽胞桿菌，Z測驗多型長度μm 1-2寬度μm 0.5-0.8
成活力 +鞭毛 周生革蘭氏反應(yīng) -子 -聚β-羥基丁酸酯的形成 -氧化酶 +催化酶 +生長厭氧菌 -37℃ +41℃ -PH5.6 -Mac-Conkey氏膽鹽瓊脂 +SS-瓊脂 -Cetrimid氏瓊脂 -色素形成作用不擴散 -擴散 -發(fā)螢光 -成酸作用(OF測驗)由葡萄糖需氧菌 -厭氧菌 -果糖需氧菌 -ASS葡萄糖 +木糖 +海藻糖 +
乙醇 -自葡萄糖的成氣作用 -ONPG +精氨酸雙氫酶 -賴氨酸脫羧酶 -苯基丙氨酸脫氨酶 -鳥氨酸脫羧酶 -H2S -Voges-Proskauer氏反應(yīng) -吲哚 -硝酸鹽變成亞硝酸鹽 +脫氮 +左聚糖的形成 -卵磷酯酶 -脲酶 +降解淀粉 -明膠 -酪蛋白 -酪氨酸 -吐溫80 -脫氧核糖核酸(DNA) +七葉 +基質(zhì)的使用醋酸鹽 -
檸檬酸鹽 -丙酸鹽 -甘氨酸 -己氨酸 -木糖 +果糖 +葡萄糖 +以H2自養(yǎng)生物的生長 -3-內(nèi)縮糖(3-Ketolactose) -生長三甲銨乙內(nèi)酯 +L-肉毒堿 +r-三甲銨丁內(nèi)酯 +三甲銨丁烯內(nèi)酯 +由上述微生物經(jīng)誘變及選擇后得一種較佳的微生物，它具有穩(wěn)定性，不但不分解代謝L-肉毒堿反應(yīng)分泌L-肉毒堿，不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內(nèi)酯及r-三甲銨丁內(nèi)酯而依靠三甲銨乙內(nèi)酯生長，這就是HK 13。
這種菌種已於1984年1月23日以保藏號Nr。DMS 2903保藏在德意志聯(lián)邦共和國4300 Goettingen市Griesebach街8號生物技術(shù)研究有限公司德意志微生物保藏所。
HK 13(DSM Nr.2093)菌種的科學(xué)描述細(xì)胞形態(tài) 芽胞桿菌，Z測驗多型長度μm 1-2寬度μm 0.5-0.8成活力 +
鞭毛 周生革蘭氏反應(yīng) -孢子聚β-羥基丁酸酯的形成 -氧化酶 +催化酶 +生長厭氧菌 -37℃ +41℃ -PH 5.6 -Mac-Conkey氏瓊脂 +SS-瓊脂 -Cetrimid-瓊脂 -色素形成作用不擴散 -擴散 -發(fā)螢光 -成酸作用(OF測驗)由葡萄糖需氧菌 -厭氧菌 -果糖需氧菌 -ASS葡萄糖 +木糖 +海藻糖 +乙醇 -
自葡萄糖的成氣作用 -ONPG -精氨酸雙氫酶 -賴氨酸脫羧酶 -苯基丙氨酸脫氨酶 -鳥氨酸脫羧酶 -H2S -Voges-Proskauer氏反應(yīng) -吲哚 -硝酸鹽生成的亞硝酸鹽 +脫氮作用 +左聚糖的形成 -卵磷酯酶 -脲酶 +降解淀粉 -明膠 -酪蛋白 -酪氨酸 -吐溫80 -DNA +七葉苷 +基質(zhì)的使用醋酸鹽 -檸檬酸鹽 -
丙酸鹽 -甘氨酸 -己氨酸 -木糖 +果糖 +葡萄糖 +以H2自養(yǎng)生物生長 -3-內(nèi)縮糖 -生長三甲銨乙內(nèi)酯 +L-肉毒堿 -r-三甲銨丁內(nèi)酯 -三甲銨丁烯內(nèi)酯 -L-谷氨酸鹽與三甲銨丁烯內(nèi)酯 ±L-谷氨酸鹽與三甲銨丁內(nèi)酯 ±L-谷氨酸鹽與L-肉毒堿 ±作為HK 13微生物后代中的一個例子是HK 1331b菌種，該菌種具有穩(wěn)定性，它不但不分解代謝L-肉毒堿反而分泌L-肉毒堿，它不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內(nèi)酯及r-三甲銨丁內(nèi)酯而依靠三甲銨乙內(nèi)酯、L-谷氨酸鹽與三甲銨丁烯內(nèi)酯、L-谷氨酸鹽與三甲銨丁內(nèi)酯、L-谷氨酸鹽與L-肉毒堿生長。
它作為在含有L-谷氨酸鹽與r-三甲銨丁內(nèi)酯、用瓊脂凝固的一種營養(yǎng)基表面上自發(fā)的而且生長良好的誘變種菌落被分離出來的。
HK 1331(DSM Nr.)菌種的科學(xué)描述細(xì)胞形態(tài) 芽胞桿菌，Z測驗多型長度μm 1-2寬度μm 0.5-0.8成活力 +鞭毛 周生革蘭氏反應(yīng) -孢子 -聚β-羥基丁酸酯的形成 -氧化酶 +催化酶 +生長厭氧菌 -37℃ +41℃ -PH5.6 -MaO-Conkey氏瓊脂 +SS-瓊脂 -Cetrimid氏瓊脂 -色素形成作用不擴散 -擴散 -發(fā)螢光 -
成酸作用(OF測驗)由葡萄糖需氧菌 -厭氧菌 -果糖需氧菌 -ASS葡萄糖 +木糖 +海藻糖 +乙醇 -自葡萄糖形成氣體 -ONPG +精氨酸雙氫酶 -賴氨酸脫羧酶 -苯基丙氨酸脫氨酶 -鳥氨酸脫羧酶 -H2S -Voges-Proskauer氏反應(yīng) -吲哚 -硝酸鹽生成的亞硝酸鹽 +脫氮作用 +左聚糖的形成 -卵磷酯酶 -脲酶 +降解淀粉 -明膠 -酪蛋白 -
酪氨酸 -吐溫80 -DNA +七葉苷 +基質(zhì)的使用醋酸鹽 -檸檬酸鹽 -丙酸鹽 -甘氨酸 -木糖 +果糖 +葡萄糖 +H2的自養(yǎng)生物生長 -3-內(nèi)縮糖 -生長三甲銨乙內(nèi)酯 +L-肉毒堿 -r-三甲銨丁內(nèi)酯 -三甲銨丁烯內(nèi)酯 -L-谷氨酸鹽與三甲銨丁烯內(nèi)酯 +L-谷氨酸鹽與三甲銨丁酯 +L-谷氨酸鹽與L-肉毒堿 +制備L-肉毒堿的工藝以這樣進行為宜，即將一種微生物(以名稱為HK 13的微生物為佳)的預(yù)培養(yǎng)物在消毒過的最好含有維生素的礦物質(zhì)培養(yǎng)基中〔Kulla et al，Arch Microbiol 135，1(1983)〕於20°至40℃(30℃為佳)、合宜的PH6-8(7為佳)培養(yǎng)20-50小時(以30-40小時為好)。這種預(yù)培養(yǎng)物以含有0.1-10%(重量)(0.5-5%更好)的膽堿、谷氨酸鹽、醋酸鹽、二甲基甘氨酸或三甲銨乙內(nèi)酯作為生長質(zhì)為宜。使用0.5-5%(重量)三甲銨乙內(nèi)酯尤佳。
然后，向預(yù)培養(yǎng)物中添加所要進行反應(yīng)的原始化合物r-三甲銨丁內(nèi)酯、三甲銨丁烯內(nèi)酯或其混合物，添加量為反應(yīng)介質(zhì)的0.1-10%(重量比)，以0.5-5%(重量比)為佳，這些都是微生物學(xué)技術(shù)上通常的做法。r-三甲銨丁內(nèi)酯或三甲銨丁烯內(nèi)酯可以是它們的鹽酸鹽、游離內(nèi)鹽及其衍生物。
用按上述工藝方法所制得的預(yù)培養(yǎng)物可以進一步接種培養(yǎng)物。這些進一步的培養(yǎng)物以具有與預(yù)培養(yǎng)相同組成為宜。
所要進行轉(zhuǎn)化的三甲銨丁烯內(nèi)酯、r-三甲銨丁內(nèi)酯或其混合物之濃度為0.1-10%(重量比)，0.5-5%(重量比)更好。
生長基質(zhì)膽堿、谷氨酸鹽、醋酸鹽、三甲基甘氨酸及三甲銨乙內(nèi)酯乙內(nèi)酯的濃度也以預(yù)培養(yǎng)時所使用的濃度為宜。
進一步培養(yǎng)的培養(yǎng)條件與預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件相同是有好處的。
因此，溫度以在20℃及40℃之間變動為宜，最好在30℃，而且PH值一般保在6與8之間，最好為7。
用該方法進行的L-肉毒堿生產(chǎn)在20-30小時之后停止下來。L-肉毒堿的濃度則一般與所使用的r-三甲銨丁內(nèi)酯或三甲銨丁烯內(nèi)酯的量相當(dāng)。
可以將細(xì)胞離心分離出來或過濾分離出來，并可將其用作重新培養(yǎng)的接種材料。
用本身已知的方法〔J.P.Vandecasteele，Appl Envir-on Microbiol 39，327(1980)〕，可以藉助陽離子交換劑色層分離法從吸附物中獲得L-肉毒堿，并用重結(jié)晶方法將之提純。
該制備L-肉毒堿的工藝方法也可以用連續(xù)生產(chǎn)法來實施。此時，使用細(xì)胞在恒化器中以0.04-0.2h-1的適用稀釋比在與分批培養(yǎng)時相似的條件下生長，較佳稀釋比為0.06-0.08h-1。
實施例1分解代謝三甲銨丁烯內(nèi)酯的微生物之分離將微生物用中性磷酸鹽溶液經(jīng)攪拌從土壤中萃取出來，隨后將較大顆粒的成分用濾紙分離掉，并用所得到的細(xì)菌混合物給三甲銨丁烯內(nèi)酯進行接種，直到出現(xiàn)輕度混濁為止。九天以后，表示細(xì)菌濃度的混濁度增長九倍。溶液中的三甲銨丁烯內(nèi)酯完全消失，并且可以檢測出分解代謝的產(chǎn)物是氨。
由該混合培養(yǎng)物藉助傳統(tǒng)的微生物學(xué)技術(shù)(凝固的瓊脂培養(yǎng)基)繼而進行分解三甲銨丁烯內(nèi)酯之微生物的純培養(yǎng)。為進行進一步處理而選擇出來的一種培養(yǎng)物被命名為HK4。
這種菌種也是依靠r-三甲銨丁內(nèi)酯、L-肉毒堿及三甲銨乙內(nèi)酯來生長的。
實施例2對穩(wěn)定的肉毒堿脫氫酶呈陰性的誘變種之分離這樣的誘變種應(yīng)該不能進一步分解代謝由r-三甲銨丁內(nèi)酯或三甲銨丁烯內(nèi)酯所形成的L-肉毒堿，而在理想的情況下則能分泌出L-肉毒堿。
將HK4的一種培養(yǎng)物用“啶誘變劑ICR 191”(每毫升5微克)在丁二酸酯培養(yǎng)基中按照規(guī)定〔J.H.Miller，Experiments inMolecular Genetios，Cold Spring Harbor Laborat-ory，1972〕進行穩(wěn)定的誘變處理。然后，讓細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)在“營養(yǎng)肉汁”中生長到表現(xiàn)出誘變?yōu)橹?。接著，轉(zhuǎn)移到三甲銨乙內(nèi)酯培養(yǎng)劑中。將一種L-肉毒堿培養(yǎng)基用充分生長的培養(yǎng)物接種。
在數(shù)小時后，該培養(yǎng)物以對數(shù)速度生長。此時，添加青霉素G(15毫克/毫升)及D-環(huán)絲氨酸(0.5毫克/毫升)〔Ornston et nl，Biochim Biophys Res.Commun36，179(1969)〕。這些“反選擇”劑只殺死生長著的細(xì)菌。不能再依靠L-肉毒堿生長并令我們感興趣的那些誘變種就活了下來，并因此而相對地濃集起來。在30小時后，活細(xì)胞數(shù)降低到百分之一，洗滌除去抗生素并將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到三甲銨乙內(nèi)酯培養(yǎng)基中。在生長之后，將培養(yǎng)物的相應(yīng)稀釋物分散到凝固了的營養(yǎng)瓊脂上。這些如此零星分散的細(xì)胞生長起來成為菌落，并被逐一檢驗。將HK13誘變種選擇出來，它穩(wěn)定地不再有肉毒堿脫氫酶，并因此不再依靠L-肉毒堿、r-三甲銨丁內(nèi)酯或三甲銨丁烯內(nèi)酯而依靠三甲銨乙內(nèi)酯來生長。在依靠三甲銨乙內(nèi)酯、二甲基甘氨酸、膽堿、谷氨酸鹽或醋酸鹽生長時，該菌種將三甲銨丁烯內(nèi)酯或r-三甲銨丁內(nèi)酯轉(zhuǎn)變成L-肉毒堿并將分泌出來。
實施例3將5升HK13的預(yù)培養(yǎng)物在含有維生素及1%(重量)三甲銨乙內(nèi)酯與5%(重量)氯化三甲銨丁烯內(nèi)酯的礦物質(zhì)培養(yǎng)基中〔Kulla el al，Arch Microbiol 135，1(1983)〕，在溫度為30℃、PH為7.0的情況下進行培養(yǎng)，時間在32小時之內(nèi)。用此方法將15升相同組成的培養(yǎng)物接種，并與預(yù)培養(yǎng)(30℃、PH7.0、PO2＝3ppm)一樣培養(yǎng)24小時。當(dāng)生產(chǎn)停止下來時，用離心法分離出細(xì)胞，分離出來的細(xì)胞可用作后一批培養(yǎng)的接種材料。上清液(19.8升)中的L-肉毒堿濃度用酶僱分析法來測定。
上清液含有4.26毫克/毫升的L-肉毒堿。以所用的氯化三甲銨丁烯內(nèi)酯汁，這相當(dāng)于產(chǎn)率為95.0%。用核磁共振譜可以證明不存在離析物或其它雜質(zhì)。
如前所述〔J.P.Vandecasteele，Appl Environ Mic-robiol 39，327(1980)〕，可藉陽離子交換色層分離法從上清液中分離出L-肉毒堿并用重結(jié)晶法予以提純。
實施例4將5升HK13預(yù)培養(yǎng)物在含有1%膽堿及0.6%r-氯化三甲銨丁內(nèi)酯并會有維生素的礦物質(zhì)培養(yǎng)基(同實施例1)在PH 7.0及30℃時培養(yǎng)32小時。用該予培物對15升相同組成培養(yǎng)基的培養(yǎng)物接種并在與實施例相同的條件下進行培養(yǎng)。
當(dāng)在約30小時以后生產(chǎn)停止下來時，用微量過濾法(Amicon空心纖維濾芯)將細(xì)胞分離出來。這種細(xì)胞質(zhì)可以用于進一步生產(chǎn)L-肉毒堿。用酶僱法測定濾液(19.6升)中的L-肉毒堿濃度。該濾液含有L-肉毒堿5.3毫克/升。以所用的氯化r-三甲銨丁內(nèi)酯汁，這相當(dāng)于97.6%的產(chǎn)率。
根據(jù)核磁共振(NMR)分析，濾液中檢測不到任何離析物或其它異質(zhì)有機副產(chǎn)物。因此，可以用已知的方法，例如用共沸蒸餾法(第2300492號聯(lián)邦德國書)將L-肉毒堿從溶液中分離出來。
實施例5將連續(xù)培養(yǎng)所必需的發(fā)酵桶用150毫升相同培養(yǎng)基的HK 13預(yù)培養(yǎng)物接種，該發(fā)酵桶容有1.5升含維生素的礦物質(zhì)培養(yǎng)基(同實施例1)及1.5%三甲銨乙內(nèi)酯與1.0%氯化r-三甲銨丁內(nèi)酯。經(jīng)在30℃及PH 7.0時的20小時需氧培養(yǎng)后，培養(yǎng)物生長充分，然后可以0.1升/小時的流量開始連續(xù)運轉(zhuǎn)。將從發(fā)酵桶中流出的培養(yǎng)液接收在冷卻到4℃的容器中。用離心法分離出細(xì)胞。
根據(jù)酶僱法分析，每升培養(yǎng)物中，上清液含有8.8克L-肉毒堿。
以所用的氯化r-三甲銨丁內(nèi)酯濃度計，這相當(dāng)于分析檢測的產(chǎn)率為99.2%。
藉離子色層法及脫水法可以從溶液中分離出固態(tài)的L-肉毒堿氯化物。
權(quán)利要求
1.一種用誘變后再選擇技術(shù)制造生產(chǎn)L-肉毒堿的微生物的方法，其特征在于，這種微生物以三甲銨丁烯內(nèi)酯及/或γ-三甲銨丁內(nèi)酯為原料，而又不分解代謝產(chǎn)物L(fēng)-肉毒堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法，其特征在于(1)用以三甲銨乙內(nèi)酯，r-三甲銨丁內(nèi)酯、三甲銨丁烯內(nèi)酯及L-肉毒堿為碳、氮來源生長的微生物做誘變的材料。(2)從經(jīng)過培養(yǎng)所得到的誘變微生物的培養(yǎng)物中選擇那些具有穩(wěn)定性、不分解代謝L-肉毒堿又不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內(nèi)酯、r-三甲銨丁內(nèi)酯而依靠三甲銨乙內(nèi)酯生長的微生物的過程。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述方法，其特征在于，于步驟(2)之后接著選擇那些分泌L-肉毒堿又不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內(nèi)酯，r-三甲銨丁內(nèi)酯而依靠三甲銨乙內(nèi)酯生長的微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3所述方法，其特征在于將在步驟(2)中誘變了的微生物在三甲銨乙內(nèi)酯培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3或4所述方法，其特征在于，將在三甲銨乙內(nèi)酯中進一步培養(yǎng)過的微生物在L-肉毒堿培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)。
6.一種制造微生物HK13(DSM Nr 2903)及其后代與由它衍生的誘變種的方法。
7.一種制造微生物HK1331b(DSM Nr)及其后代與由它衍生的誘變種的方法。
8.一種制造微生物HK4(DSM Nr 2938)及其后代與它衍生的誘變種的方法。
9.一種制造L-肉毒堿的工藝方法，其特征在于用在權(quán)利要求
1-7項所述的方法制造的微生物在含有三甲銨丁烯內(nèi)酯及/或r-三甲銨丁內(nèi)酯的一種生長基質(zhì)上培養(yǎng)并將所濃集的L-肉毒堿分離出來。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的工藝方法，其特征在于，三甲銨丁烯內(nèi)酯，r-三甲銨丁內(nèi)酯或其混合物的用量為培養(yǎng)基的0.1-10%(重量比)。
11.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的工藝方法，其特征在于，作為生長基質(zhì)所用的是二甲基甘氨酸、膽堿、谷氨酸鹽、醋酸鹽及/或三甲銨乙內(nèi)酯。
12.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的工藝方法，其特征在于，生長基質(zhì)的用量為培養(yǎng)基的0.1-10%(重量比)。
13.用1-7所述方法制造的微生物發(fā)酵所得到的L-肉毒堿。
專利摘要
以三甲銨丁烯內(nèi)酯及/或γ-三甲銨丁內(nèi)酯為原料，用微生物學(xué)方法制造L-肉毒堿。
文檔編號C12P13/00GK85101191SQ85101191
公開日1987年6月10日 申請日期1985年4月1日
發(fā)明者漢斯·庫拉帕維·萊何凱 申請人:隆扎股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan