專利名稱：生產(chǎn)l-賴氨酸的方法
專利說明 本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸地方法。
L-賴氨酸在動物飼料、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有著多方面的用途。
在此之前，已知可使用桿狀谷氨酸生產(chǎn)微生物的各種營養(yǎng)需要性菌株、各種抗藥菌株、各種藥物敏感性菌株生產(chǎn)L-賴氨酸。另外，使用抗生素抗性菌株的方法(美國專利3，687，810號)，及使用對芽孢桿菌屬微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有抗性之菌株的方法〔日本專利公開號169497/84〕也是已知的。
迄今尚未報(bào)導(dǎo)過對伊枯草菌素(iturin)相關(guān)物質(zhì)有抗性的菌株。日本專利公開號169497/84中公開了使用對芽孢桿菌微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有抗性的菌株的方法，但發(fā)明的目的不是提高賴氨酸生產(chǎn)微生物的生產(chǎn)能力，而是防止因芽孢桿菌微生物污染造成的對賴氨酸生產(chǎn)微生物的生長抑制作用。
本發(fā)明的目的旨在建立一種工業(yè)上以較低成本生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
本發(fā)明人對發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法進(jìn)行了廣泛的研究，以期以工業(yè)上的低成本制得L-賴氨酸，結(jié)束發(fā)現(xiàn)通過賦予桿狀谷氨酸生產(chǎn)微生物以抗伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)的抗性，可提高L-賴氨酸生產(chǎn)微生物的生產(chǎn)能力。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)對伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)有抗性并能產(chǎn)生L-賴氨酸的桿狀谷氨酸生產(chǎn)微生物、在培養(yǎng)物中積聚L-賴氨酸以及從中回收L-賴氨酸。
本文中所說的桿狀谷氨酸生產(chǎn)微生物是指屬于棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬或節(jié)細(xì)菌屬的微生物。
本文所說的伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)是指由芽孢桿菌屬微生物產(chǎn)生的抗生素，并包括如伊枯草菌素A、伊枯草菌素C、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、桿菌抗霉素(bacillomycin)〔Biochim，Biophys，Acta552，558-562(1979)，Biochim，Biophys。Acta684，207-211(1982)〕及其混合物。
作為各突變菌株的親本菌株，可使用任何具有產(chǎn)生賴氨酸能力的、屬于桿狀谷氨酸生產(chǎn)微生物的菌株。特別是谷氨酸棒桿菌H-3149(FERMBP-158)和谷氨酸棒桿菌H-4412(FERMBP-1069)。
可于30℃用于250μg/mlN-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理上述親本菌株30分鐘，然后分離生長于含伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)的基本培養(yǎng)基瓊脂平皿上的菌株即得到對伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)有抗性的突變菌株，其中培養(yǎng)基中所含伊枯草菌素的濃度應(yīng)使親本菌株不能生長。此外，可培養(yǎng)如此得到的對伊枯草菌素有抗性的突變菌株、比較根據(jù)提高了L-賴氨酸生產(chǎn)能力而篩選的各菌株之間產(chǎn)生賴氨酸的能力，從而得到本發(fā)明的突變菌株。
上述方法得到的對伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)(伊枯草菌素A和伊枯草菌素C的1∶1混合物)有抗性的親本菌株和突變菌株具有下列性質(zhì) 親本菌株谷氨酸棒桿菌H-3149(FERMBP-158)具有S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性、利福平抗性、鏈霉素抗性和6-氮尿嘧啶抗性。
突變菌株谷氨酸棒狀桿菌H-4933具有S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性、利福平抗性、鏈霉素抗性、6-氮尿嘧啶抗性和伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)抗性。
親代菌株谷氨酸棒桿菌H-4412(FERMBP-1069)具有S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性、利福平抗性、鏈霉素抗性、6-氮尿嘧啶抗生和β-萘喹啉抗性。
突變菌株谷氨酸棒桿菌H-4934具有S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性、利福平抗性、鏈霉素抗性、6-氮尿嘧啶抗性、β-萘喹啉抗性和伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)抗性。
如此得到的伊草菌素相關(guān)物質(zhì)抗性突變菌株谷氨酸棒桿菌H-4934已于1988年1月14日寄存在Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology Japan(FRI)，保藏號為FERM BP-1655。表1顯示了上述菌株在含有200μg/ml伊枯草菌素(伊枯草菌素A和伊枯草菌素C的1∶1混合物)的基本瓊脂培養(yǎng)皿〔葡萄糖10g/l、氯化銨1g/l，尿素2g/l、KH2PO41g/l、K2HPO43g/l、MgCl2·2H2O0.4g/l、FeSO4·7H2O10mg/l、MnSO4·4H2O10mg/l、ZnSO4·7H2O1mg/l、CuSO4·5H2O1mg/l、(NH4)6MO7O24·4H2O1mg/l、d-生物素50μg/l、瓊脂20g/l、pH7.2)上培養(yǎng)24小時后的生長情況。
表1
++充分生長-不生長 為了培養(yǎng)適用于本發(fā)明的微生物，可任用通常用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的培養(yǎng)基。只要其含有能被微生物同化的適當(dāng)碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子等，任何合成的或天然的培養(yǎng)基均可使用。
作為碳源，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、廢糖蜜、淀粉水解物等糖類物質(zhì)，乙酸、富馬酸、檸檬酸等有機(jī)酸，以及乙醇、甘油、甘露糖等醇類物質(zhì)。
作為氮源，可使用氨、銨鹽如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機(jī)或有機(jī)酸的銨鹽、胺、其他含氮化合物、胨、肉汁、玉米漿、酪蛋水解物、大豆餅水解物、各種發(fā)酵細(xì)胞及其他消化的產(chǎn)物。
作為無機(jī)化合物，可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
另外，必要時還可加入生物素、硫胺素、煙酸、β-丙氨酸、泛酸等維生物，亮氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸，以及鏈霉素等各種抗生素。
可在通氣條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌深層培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度在20至40℃，最好為25至38℃。培養(yǎng)基的pH為5至9，最好接近于中性?？捎锰妓徕}、無機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液、氨或pH緩沖溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH。
通常在培養(yǎng)1至7天后，即可產(chǎn)生并在培養(yǎng)物中積聚L-賴氨酸。
培養(yǎng)完成后，由培養(yǎng)物中除去細(xì)胞等沉淀物，并可用離子交換、濃縮、鹽析、等電點(diǎn)沉淀等方法從中回收L-賴氨酸。
下面是本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1 將谷氨酸棒桿菌H-3149、H-4412、H-4933或H-4934接種于含20ml下述種子培養(yǎng)基的300ml錐形瓶內(nèi)并于30℃振蕩培養(yǎng)(220rpm)24小時。然后向含有20ml下述生產(chǎn)培養(yǎng)基的300ml錐形瓶內(nèi)接種2ml種子培養(yǎng)物并于30℃振蕩培養(yǎng)(220rpm)72小時。培養(yǎng)完成后，使用酸性茚三酮以比色法測定產(chǎn)生的L-賴氨酸量。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物中產(chǎn)生的L-賴氨酸(鹽酸鹽)分別為44mg/ml、52mg/ml、53mg/ml和54mg/ml。離心用菌株H-4933制得的1000ml培養(yǎng)物并用硫酸將pH調(diào)到1.5，然后通過高酸性離子交換樹脂Diaion SK-1B(H+型，Mitsubishi Kasei公司生產(chǎn))以吸附L-賴氨酸。用水洗柱并用2N氨水洗脫以收集L-賴氨酸部分。濃縮收集到的洗脫物并用鹽酸將濃縮的溶液調(diào)至pH2.0，然后冷卻并向其中加入乙醇，從而得到結(jié)晶的L-賴氨酸鹽酸鹽。結(jié)晶的量為42g。
種子培養(yǎng)基(pH7.2)生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH7.2) 葡萄糖40g/l赤糖糊糖蜜100g/l 胨20g/l(按葡萄糖量) 酵母浸膏 5g/l KH2PO40.5g/l 尿素3g/l硫酸銨40g/l KH2PO41.5g/l MgSO4.2H2O 0.5g/l K2HPO4 0.5g/l 尿素 3g/l MgSO4.2H2O 0.5g/l 碳酸鈣 30g/l 生物素50μg/l
權(quán)利要求
1、一種生產(chǎn)L一賴-氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)對伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)有抗性并具有產(chǎn)生L-賴氨酸能力的桿狀谷氨酸生產(chǎn)微生物、然后在培養(yǎng)物中積聚并從中回收L-賴氨酸。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中伊枯草菌素選自伊枯草菌素A、伊枯草菌素C、抗霉枯草菌素、桿菌抗霉素L及其混合物。
3、一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌H-4933或谷氨酸棒狀桿菌H-4934、然后在培養(yǎng)物中積聚并從中回收L-賴氨酸。
4、一種生物學(xué)純的谷氨酸棒桿菌H-4933的培養(yǎng)物。
5、一種生物學(xué)純的谷氨酸棒桿菌H-4934的培養(yǎng)物。
全文摘要
公開了一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)對伊枯草菌素相關(guān)物質(zhì)有抗性并具有產(chǎn)生L-賴氨酸能力的桿狀谷氨酸生產(chǎn)微生物，在培養(yǎng)物中積聚L-賴氨酸，以及從其中回收L-賴氨酸。
文檔編號C08J5/10GK1038117SQ8810326
公開日1989年12月20日 申請日期1988年5月27日 優(yōu)先權(quán)日1988年5月27日
發(fā)明者平尾俊彥, 中野哲郎, 東朋樹, 中西俊秀 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社