專利名稱：:新的脂解酶及其在除垢組合物中的應(yīng)用的制作方法本發(fā)明是關(guān)于對(duì)脂肪物質(zhì)可以酶促降解的酶，特別是涉及新的脂解酶。在洗滌的條件下，這類酶具有增強(qiáng)的脂解活性，特別適于作除垢添加劑。本發(fā)明還涉及制備這類新脂解酶的方法，作為洗滌組合物添加劑的應(yīng)用，以及用這些洗滌組合物進(jìn)行洗滌的方法。此外，本發(fā)明還涉及含有這類新脂除酶的除垢組合物。本發(fā)明的酶至少包含多種脂解酶中的一種，它們是由某些微生物，特別是某些細(xì)菌產(chǎn)生的，并發(fā)現(xiàn)這些脂解酶的理化性質(zhì)和酶學(xué)性質(zhì)彼此是不相同的。清洗衣物時(shí)的一個(gè)特殊問題，是除去油脂性的污斑。若要求低溫洗滌，這個(gè)問題會(huì)更加嚴(yán)重?，F(xiàn)今除去油污的方法是在洗滌過程中提高溫度和堿性，使其乳化并除去。現(xiàn)今為了節(jié)省能量，越加趨于用較低的洗滌溫度，即大約40℃或以下。因此，需要這樣的脂酶，這種脂酶在較低的洗滌溫度下是有效的，在堿性較高的洗滌溶液中是穩(wěn)定的，在固體和液體除垢組合物中在貯存狀態(tài)下是穩(wěn)定的。除垢組合物中應(yīng)用脂解酶雖然已經(jīng)知道了許多年(例如英國書No1，442，418第1頁第36-38行所提及的)，但在實(shí)踐中看來是相當(dāng)不令人滿意的，因?yàn)樵谙礈鞐l件下，它們只有很低的清洗效力，并且不能滿足現(xiàn)今對(duì)穩(wěn)定性的要求。綜述性的文章可參考H.Andree等應(yīng)用生物化學(xué)雜志(J.Appl.Biochem)，2卷，(1980)218-229頁，“作為除垢成分的脂酶”脂解性除垢添加劑也可見于，例如英國專利No.1，293，613及加拿大專利No.835，343.美國專利No.3，950，277和英國專利No.1，442，418分別公布了與活化劑及鈣離子和/或鎂離子結(jié)合的脂酶，分別用來對(duì)臟污的紡織物預(yù)浸，并且除掉聚酯紡織物或聚酯-棉混紡物上的甘油三脂污斑和污垢。適用于此處的微生物來源的脂酶(除了動(dòng)物和植物來源的脂酶)是由假單胞菌屬、麥霉菌屬、肺炎球菌、葡萄球菌和葡萄球菌毒素，結(jié)核桿菌，溶脂酵母和核盤菌屬衍生物而來。英國專利1，372，034公布了一種除垢組合物，該組合物中含有施氏假單胞菌株ATCC1954產(chǎn)生的細(xì)菌性脂酶。而且建議最好的脂解酶的較適宜的PH應(yīng)在6與10之間，在這個(gè)范圍內(nèi)應(yīng)是有活性的，最好PH是在7到9之間。約于1970年，所推定的施氏假單胞菌株重新分類為綠膿桿菌，如同出現(xiàn)在ATCC目錄中的那樣。歐洲專利申請(qǐng)EP-A-0130064公布了一種酶促除垢添加劑，其中含有從鐮刀菌子孢子體中分離的脂酶，并宣稱其溶脂清洗效力比常規(guī)的脂酶為高。由于進(jìn)行了廣泛的研究和實(shí)驗(yàn)，驚奇地發(fā)現(xiàn)脂酶制劑可由培養(yǎng)適當(dāng)選擇的微生物中獲取，在現(xiàn)代洗滌的條件下，這些脂酶能顯示有脂酶的活性，亦即在高濃度的除垢劑、高PH值和低洗滌溫度的情況下，是穩(wěn)定和有效的。因此，本發(fā)明提供了新的脂酶制劑，這些脂酶是由屬于類產(chǎn)堿假單胞菌，施氏假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌的一些菌株的培養(yǎng)而獲得的。這些脂酶的最適PH大約在8到10.5之間。在洗滌的條件下，在含有除垢劑濃度高達(dá)約10g/l的水溶液中，溫度在60℃或以下(最好在30-40℃)和PH大約在7到11之間(最好是在大約9到10.5之間)，這些脂酶顯示有效的脂酶活性。在測(cè)定真脂酶單位(TLU)的條件下，最適PH值是在PH恒定儀上測(cè)定的，這在本說明書第17頁闡述。按照本發(fā)明的最佳實(shí)施例，脂酶制劑是在通常的培養(yǎng)條件下，對(duì)新分離出的類產(chǎn)堿假單胞菌培養(yǎng)而獲得，該菌是從一組內(nèi)部編號(hào)為Sp9，INⅡ-5，GrⅥ-15和M-1的菌珠群中選擇來的。這些株是1985年8月8日貯存在荷蘭巴恩的氟爾-希麥爾培養(yǎng)中心(CBS)，編號(hào)分別為CBS467.85(7181)，CBS468.85(7182)，CBS471.85(7185)和CBS473.85(7187)。這些分離菌是用表1所列的表型特征鑒定的。根據(jù)本發(fā)明的另一最佳實(shí)施例，是在通常的培養(yǎng)條件下，對(duì)類產(chǎn)堿假單胞菌亞種Citrulli菌株培養(yǎng)而獲得，該菌種儲(chǔ)存在ATCC(AmericanTypecuturecollection)，儲(chǔ)存號(hào)為ATCC29625。熟悉這方面技術(shù)的人皆知，以DSM50188菌株(即ATCC17440株)和DSM50189菌株作為范例的類產(chǎn)堿假單胞菌種，并不產(chǎn)生脂酶。然而也已知道該菌種相當(dāng)不純，這已通過對(duì)新的植物病原菌的鑒定而得到證明。該植物病原菌是由N.W.Schaad等人發(fā)現(xiàn)的[國際系統(tǒng)微生物學(xué)雜志(Lnt.J.Syst.Microbiol)，28卷，(1978)，117-125頁]，命名為類產(chǎn)堿假單胞菌Citrulli亞種，和由M.Goto發(fā)現(xiàn)[國際系統(tǒng)生物學(xué)雜志，33卷(1983)，539-545頁)，命名為類產(chǎn)堿假單胞菌Konjaci亞種。雖然Citrulli和Konjaci兩個(gè)亞種的表型特征彼此有些差別，也與上述菌種的典型株有區(qū)別，但熟悉本領(lǐng)域的人認(rèn)為，這些亞種都屬于類產(chǎn)堿假單胞菌株(見N.J.Palleroni，《伯蓋氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(Bergey′sManualofSystematieBacterioloyy)第1卷，N.R.Krieg，Williams和Wilkimore/倫敦，1984年，第173-174頁)。它們的存在表明了類產(chǎn)堿假單胞菌種的表型特征的自然變化。在其它的特征中間，表型特征的變異表現(xiàn)在類產(chǎn)堿假單胞菌種的新的亞種Citulli和Konjaci可產(chǎn)生脂酶。熟悉這領(lǐng)域的人們也會(huì)意識(shí)到，這些新分出的菌種與迄今新發(fā)現(xiàn)的類產(chǎn)堿假單胞菌亞種所描述的特征各有不同，但仍然屬于這一種。由上述類產(chǎn)堿假單胞菌選育的四種菌株的每一種產(chǎn)生的脂酶，在洗滌的條件下都有令人驚奇好的穩(wěn)定性和有效性。由上面指出的類產(chǎn)堿假單胞菌的亞種Citulli典型株新產(chǎn)生的脂酶也有同樣效力，夏德等人的文獻(xiàn)中決不會(huì)產(chǎn)生出脂酶的這種有用的性質(zhì)。按照本發(fā)明的另一個(gè)最好實(shí)施例，脂酶制劑可以在通常的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)施氏假單胞菌株來制取，該菌株的內(nèi)部編號(hào)為ThaiⅣ17-1，它是于1985年8月8日貯存于CBS，編號(hào)為CBS461.85(7175)。該菌株的表型特征列于表2。該施氏假單胞菌株能夠產(chǎn)生脂酶，該脂酶在每升洗滌溶液中含有高達(dá)10克除垢劑、于35℃、PH9.0時(shí)是穩(wěn)定的。如前提及，施氏假單胞菌ATCC19154已知能夠產(chǎn)生可用作除垢劑的穩(wěn)定的脂酶(亦見美國專利No.3，511，753)。然而該菌株又重新歸類為綠膿桿菌株，例如見ATCC《細(xì)菌，噬菌體和rDNA載體目錄》，第16版，1985年，第134頁，No.19154。熟悉這一領(lǐng)域的人肯定不會(huì)予期或指望真實(shí)的施氏假單胞菌株會(huì)產(chǎn)生如本發(fā)明已提及的穩(wěn)定的脂酶，很久以來，已知施氏假單胞菌是相當(dāng)不均一的菌株，它包括了數(shù)種菌株，它們產(chǎn)生脂酶的能力是不相同的。沒有跡象表明在現(xiàn)代洗滌組合物中可能用這類脂酶，尤其是在上述的洗滌條件下，其穩(wěn)定性未必有那樣的好。按照本發(fā)明的另一最好的實(shí)施例，由新分離出的乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetofactercalcoaceticus)菌株用通常的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，可產(chǎn)生脂酶制劑。該菌株的內(nèi)部編號(hào)為GrV-39，于1985年8月8日貯存于CBS，編號(hào)為CBS460.85(7174)。該菌株的表型特征列于表2。由該菌株獲得的脂酶制劑在洗滌溶液中含除垢劑濃度高達(dá)10克/升，于40-50℃和PH高達(dá)10.3的條件下，仍是穩(wěn)定和有效的。本發(fā)明的最佳脂酶制劑可以使大約至少10%的復(fù)蓋的脂肪或最好是20%的脂肪水解，條件是在下文所述的實(shí)例9，粉狀除垢劑的最低濃度是2克表1(續(xù))表2.施施假單胞菌ThaiⅣ17-1菌株及乙酸鈣不動(dòng)桿菌Grv-39菌株的特征表2(續(xù))本發(fā)明的另一點(diǎn)是提供了洗滌組合物，在組合物中含有本發(fā)明的脂酶和一種除垢劑，以及通常用于除垢組合物的其它任選的成分。本發(fā)明中除垢組合物中的成分，除了必不可少的脂酶外，還可包括如下的一個(gè)或多個(gè)成分1.通常用于酶促除垢組合物的表面活性劑。一般可以用天然的或合成的表面活性物質(zhì)，例如水溶性肥皂，陽離子型、陰離子型、非離子型、兩性電介質(zhì)或兩性離子的表面活性劑。常用的這一類表面活性劑的一個(gè)實(shí)例是苯磺酰十二碳醇酯。表面活性劑可單獨(dú)應(yīng)用或混合使用，通常在洗滌組合物中的含量大約是4-50%(重量/重量)。2.水軟化劑如復(fù)合磷酸鹽，例如三聚磷酸堿金屬鹽，或焦磷酸堿金屬鹽，或沸石，含量最好是高達(dá)洗滌組合物重量的40%。還可以包括或選用化合物如氰基三醋酸堿金屬鹽或檸檬酸堿金屬鹽，使得洗滌組合物有復(fù)合的作用。3.堿金屬的硅酸鹽或弱堿性化合物如堿金屬的碳酸氫鹽，通?？烧嫉街亓康?0%。4.填充劑，如堿金屬的硫酸鹽。5.化合物如羧甲基纖維素，香料，光學(xué)增白劑，緩沖劑，聚烷撐二醇或乙醇。6.其它類的酶，如蛋白酶和淀粉酶。按照本發(fā)明所述的酶促洗滌組合物，其脂酶的活性范圍最好是在組合物的1-20，000TLU/克，而蛋白水解酶的活性范圍最好是在洗滌組合物中50-10，000德福特單位/克，一個(gè)TLU(真脂酶單位)規(guī)定為每分鐘滴定的相當(dāng)于1微摩爾NaOH量的脂肪酸量(見下文的第16頁)。德福特單位的定義刊于美國油脂化學(xué)會(huì)雜志60卷，(1983)，1672頁。參照組成本發(fā)明的洗滌組合物的另一組化合物是漂白劑如堿金屬的過硼酸鹽，特別是過硼酸鈉，堿金屬的過碳酸鹽如過碳酸鈉，過酸或其鹽，以及這些漂白劑的活化劑如TAED當(dāng)洗滌組合物中一方面含有過硼酸鹽、過碳酸鹽，活化劑和光學(xué)增白劑，另一方面又含有蛋白酶時(shí)，本發(fā)明的脂酶制劑在這些成分的存在下，出乎意料地仍有很高的穩(wěn)定性。制備本發(fā)明的洗滌組合物可以用通常的方法，例如將諸成分混合在一起，或者制成預(yù)初混合，最后再與其它成分混合而成。按照一種可以制備的途徑，即一種或多種脂酶制劑與一種或多種其它的化合物混合，做成予先已測(cè)定過的酶活性的濃縮物，該濃縮物然后與其它所需要的成分混合。按照特別優(yōu)選的實(shí)施案，本發(fā)明的脂解酶是以酶促除垢添加劑的形式存在。該添加劑也可以含有一個(gè)或多個(gè)其它的酶，例如可用于新式洗滌組合物的蛋白酶和/或淀粉酶，也可以含有通常用于本技藝的一個(gè)或多個(gè)成分，例如非離子型穩(wěn)定劑，鹽類穩(wěn)定劑和/或涂布劑。該酶促除垢添加劑中除含有本發(fā)明的脂，酶外最好還含有蛋白酶或任選的一種α-淀粉酶。已發(fā)現(xiàn)蛋白水解酶并不能破壞本發(fā)明的脂解酶。本發(fā)明的酶促除垢添加劑通常與一個(gè)或多個(gè)垢劑以及本技藝中已知的其它成分相混合，形成洗滌組合物。按照一個(gè)特定的實(shí)施案，所用的酶促除垢添加劑是使脂酶的活性范圍在添加劑中為102-106TLU/克。而任選的水解蛋白活性范圍是在5×104-106德福特單位/克。本發(fā)明的酶促除垢添加劑可以呈例如顆粒劑型或球粒劑型，是按照該特定領(lǐng)域中通常已知的方法制造的，例如見英國專利1，324，116和1，362，365及美國專利3，519，570，4106，991和4，242，219。在本發(fā)明的特定實(shí)施案中，還提供具有酶穩(wěn)定劑的液體劑型的酶促除垢添加劑。該酶的穩(wěn)定劑例是丙二醇。這樣的液體添加劑利用液體除垢組合物最好。本發(fā)明的穩(wěn)定和有效的脂酶制劑可以在適當(dāng)?shù)臈l件下，培養(yǎng)下文所述的微生物而方便地制備。為了獲得高產(chǎn)量的酶，在培養(yǎng)基中必須含有容易吸收的碳源和能源，如同有機(jī)氮源酪蛋白那樣。最好在培養(yǎng)基中加入脂肪或油，以及鈣鹽、鎂鹽和微量元素。按照本發(fā)明的最好的實(shí)施案，培養(yǎng)過程在脫脂牛乳中進(jìn)行，牛乳預(yù)先用水稀釋，比例由1∶1到1∶25重量/體積。在發(fā)酵時(shí)必須有良好的通氣。培養(yǎng)基的PH要適當(dāng)?shù)乜刂圃?-10之間，最好是在6.5-9之間。本發(fā)明還提供了一種用本發(fā)明的除垢組合物的洗滌過程。這一過程可以在約為60℃或以下的溫度滿意地進(jìn)行，最好的溫度是30-40℃，PH通常在7-11之間。洗滌時(shí)間一般是10-60分鐘。洗滌過程中所用的洗滌溶液，最好含本發(fā)明的去垢組合物，其量的范圍為每升0.5-15克，最好是1-10克/升。洗滌過程中的脂酶性能新式洗滌組合物含有的成分，要從在洗滌過程中具有最佳效力的成分中選擇。顯然，在新式洗滌過程中若使用脂酶，其作用應(yīng)與現(xiàn)代除垢劑處方中的活性和有效的成分相一致。為此，選定了若干個(gè)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，以便在洗滌的條件下，證明本發(fā)明的脂酶的活性和有效性。這些標(biāo)準(zhǔn)是1.在廣泛應(yīng)用的除垢成分如三聚磷酸鈉(TPP)的存在下脂酶的活性。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之所以重要，是因?yàn)榇蠹叶颊J(rèn)為脂酶的活性和穩(wěn)定性取決于堿金屬離子如鈣離子。因此，這種依賴于鈣的脂酶不適宜用于新式洗滌過程。2.在新式除垢溶液中脂酶的活性。有許多新式除垢組合物可用來試驗(yàn)堿性脂酶的活性和有效性。其中我們選用了一種粉狀除垢組合物和一種液體配方，作為廣泛應(yīng)用的新式除垢配方的典型范例。這些有代表性的新式除垢組合物是-ALL(粉劑)，是荷蘭Unilever的產(chǎn)品，在試驗(yàn)中，我們用了ALL-堿(得自荷蘭弗拉定根的Unilever研究所)，它與ALL的配方相同，只是沒有過氯酸鹽，漂白活化劑(TAED)，及酶。ALL是注冊(cè)商標(biāo)。-TIDE(液體)，是Procter及Gamble的產(chǎn)品，在美國有售。我們?cè)囼?yàn)時(shí)，該配方中的酶因熱處理而失活。TIDE是個(gè)注冊(cè)商標(biāo)。3.含有蛋白酶的ALL中脂酶的活性。由于蛋白酶是新式除垢組合物的重要成分，應(yīng)當(dāng)證明在該除垢成分(以及表面活性劑基質(zhì))的存在下脂酶的活性與有效性。4.在典型的漂白劑(如過硼酸鹽)和漂白活化劑(如TAED)存在下的脂酶活性。漂白劑(以及在較低洗滌溫度時(shí)的漂白活化劑)是一些新式除垢組合物的重要成分。在它們的存在下，脂酶的活性和有效性被認(rèn)為是重要的標(biāo)準(zhǔn)。為了評(píng)價(jià)本發(fā)明的脂酶對(duì)除去紡織物上油脂的能力，必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)系統(tǒng)，以便準(zhǔn)確無誤地測(cè)定洗滌溶液中本發(fā)明的脂酶的活性。通常用的試驗(yàn)紡織物，如EMPA101和EMPA102(可在瑞士圣加倫的材料試驗(yàn)聯(lián)合研究所買到)的缺點(diǎn)是用除去色素來測(cè)量去垢能力。除掉EMPA101及102紡織物上的色素，是否與除掉脂肪酸直接相關(guān)連，這是個(gè)悠關(guān)重要的問題，因此，只用這些紡織物評(píng)價(jià)脂酶的性質(zhì)是不恰當(dāng)?shù)摹Ａ硪粋€(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)，例如在EPA-0130064所闡述的系統(tǒng)，也是基于清除掉人為弄臟的脂肪物上的染料。用于EMPA101和EMPA102試驗(yàn)紡織物的同樣缺點(diǎn)確實(shí)也在此適用。而且在上述專利申請(qǐng)的試驗(yàn)系統(tǒng)中，用乳化的脂肪作為堿性脂酶的底物。這種脂肪并不相當(dāng)于新式洗滌溶液所要處理的大多數(shù)脂肪斑跡，這樣的斑跡不呈乳化形式，并且非乳化脂肪與該紡織物相接觸。安得烈等人在應(yīng)用生化雜志2卷，(1980)218-229頁所敘述的試驗(yàn)系統(tǒng)是用沉積在紡織物上放射性標(biāo)記的脂肪。洗滌后，測(cè)定小塊紡織物上的放射性，該放射性與溶脂性相關(guān)。然而，這個(gè)系統(tǒng)不可能區(qū)分是脂肪的放射性還是脂肪酸的放射性。因此，這個(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)于測(cè)定洗滌過程中堿性脂酶的性能并不可靠。為了本發(fā)明的目的，開發(fā)了一種新的試驗(yàn)方法，在下文中稱為SLM-試驗(yàn)法，用來評(píng)價(jià)在洗滌過程中的堿性脂酶及其活性和有效性。SLM-試驗(yàn)法用的原理與T.Hashimoto等在油脂化學(xué)(YuKagaku)34卷，(1985)，606-612頁發(fā)明的方法相同，但分析用的時(shí)間大大縮短了。該方法包括用紡織物上固著的非乳化的脂肪或油作為試驗(yàn)污斑，洗滌后從小塊紡織物上提取，分析提取液中的脂肪和脂肪酸。由于脂酶的活性而生成的脂肪酸，以及殘留的甘油三酯，在洗滌過程中可能留在紡織物上，這取決于所用的條件。因此，留在小塊紡織物上這些油脂產(chǎn)物的量，是洗滌過程中脂酶性能的很好的量度。在下文的一般分析方法項(xiàng)下，將詳細(xì)公布該SLM試驗(yàn)法。本發(fā)明用下面的實(shí)例作進(jìn)一步說明。在實(shí)例中所用的一般分析法如下。脂酶活性的測(cè)定法A.橄欖油水解作用(TLU法)本發(fā)明的脂酶制劑的活性測(cè)定，或基于橄欖油的水解，或基于月桂酸對(duì)-硝基苯酯的水解。前一方法主要根據(jù)耐爾(G.耐爾1974年于“酶分析方法”，第Ⅱ卷814-818頁，H.U.伯格邁爾編，科學(xué)出版社，紐約，倫敦)的方法，只是游離出的脂肪酸是在25℃，PH8.0于PH-恒定儀上測(cè)定。一個(gè)真脂酶單位(TLU)規(guī)定為每分鐘滴定的相當(dāng)于1微摩爾NaOH的脂肪酸。B.月桂酸對(duì)-硝基苯酯的水解(NPL法)本法基于月桂酸對(duì)-硝基苯酯水解成對(duì)-硝基酚和月桂酸，主要方法如下適當(dāng)量的脂酶于PH8在0.05MMOPS(3-N-嗎啉丙烷磺酸)-NaOH中稀釋成大約0.003-0.008NPL單位/毫升。一個(gè)NPL單位規(guī)定為釋放出1微摩爾的對(duì)-硝基酚所需的脂酶量。4毫升脂酶溶液與1毫升月桂酸對(duì)-硝基苯酯溶液(25mg月桂酸對(duì)-硝基苯酯溶于25ml乙醇，加兩滴1N鹽酸)混合，在30℃溫育10分鐘。加入5ml醇性Tris溶液(2.5克三-(羥甲基-氨基甲烷)溶于1升乙醇中)以中止該反應(yīng)，并冷卻至室溫。測(cè)定400nm的吸光度并用無脂酶的保溫液的吸光度校正。釋放出的對(duì)硝基酚的微摩爾量在校準(zhǔn)曲線上計(jì)算出，該曲線的繪制是對(duì)-硝基酚于乙醇中的適當(dāng)?shù)娜芤涸?00nm下的吸光值。該溶液1毫升加到4ml0.05MMOPS-NaOH緩沖液中，PH8，和5ml醇性Tris溶液。脂酶的穩(wěn)定性測(cè)定是用上述方法之一，于0分鐘、15分鐘、30分鐘(有時(shí)到90分鐘)測(cè)定酶的活性。洗滌溶液中脂酶穩(wěn)定性的測(cè)定為了估價(jià)本發(fā)明的若干個(gè)脂酶在洗滌溶液中的穩(wěn)定性，建立了如下的實(shí)驗(yàn)按實(shí)例1所述得到的脂酶制劑適量，制成如下的溶液a)合成自來水(STW)每升蒸餾水中含有0.433gCaCl·6HO，0.140gMgCl·6HO，和0.210gNaHCO.b)所用的除垢劑選自-ALL-堿(＝?jīng)]有過硼酸鹽，TAED和酶的ALL)-TIDE加(＝含有三聚磷酸鈉的TIDE)-TIDE減(＝無磷酸鹽，含有其它成分)ALL-堿得自荷蘭的Unilever研究所。TIDE加和TIDE減在美國的波洛克脫和蓋伯爾公司有出售。ALL和TIDE是注冊(cè)商標(biāo)。試驗(yàn)是在PH9.0或10.3，于35，40或50℃下進(jìn)行。自混合物中取樣的時(shí)間是在0，15及30分鐘(有時(shí)到90分鐘)，殘留的脂酶活性用所述的兩種方法中的一種進(jìn)行測(cè)定。所用的脂酶是類產(chǎn)堿假單胞菌菌株Sp9(CBS467.85)，INⅡ-5(CBS468.85)，GrⅥ-15(CBS471.85)及M-1(CBS473.85)，施氏假單胞菌菌株ThaiⅣ17-1(CBS461.85)及乙酸鈣不動(dòng)桿菌菌株CrⅤ-39(CBS460.85)。結(jié)果列于實(shí)例4-8中。在洗滌條件下脂酶性能的測(cè)定方法(SLM試驗(yàn))下面是如何更好地進(jìn)行SLM試驗(yàn)的典型實(shí)例。EMPA211棉布片作為纖維材料，三油酸甘油酯或精制的橄欖油(兩者均是美國西格瑪公司產(chǎn)品)作為底物。在抽提紡織物后，可以用層析法對(duì)其進(jìn)行水解。用于SLM試驗(yàn)最好的洗滌方法如下5毫克橄欖油溶于20微升丙酮(25%)中，涂在棉布片(3×3厘米)上。棉布片在室溫下空氣中晾干。將含有10mlSTW(標(biāo)準(zhǔn)自來水每升滯留水含0.433gCaCl2，0.140gMgCl2·6H2O和0.210gNaHCO3)或溶于STW中的去垢劑的洗液放到一有磨口玻璃塞的錐形瓶(25ml)中，瓶放入振蕩的40℃水浴中。洗滌步驟從向瓶?jī)?nèi)加入脂酶(20TLU見下文)開始隨之即加入臟污布片，并于40℃下振搖40分鐘，空白實(shí)驗(yàn)不加脂酶。洗滌完畢，用STW沖洗布片，然后于室溫下干燥。干布片放入含有5毫升溶劑的玻璃管中旋轉(zhuǎn)進(jìn)行提取，該溶劑與用于層析分離底物和產(chǎn)物的洗脫液的成分相同。提取液中殘留的甘油三酯及所形成的游離脂肪酸用高效液相層析測(cè)定(HPLC)。設(shè)備與條件泵2150型(LKB)。檢測(cè)器析光率監(jiān)測(cè)器(JobinJvon)。注入系統(tǒng)Wisp(微孔)10微升。積分儀SP4270(光譜物理學(xué))柱CP微球體-硅(CHROMPACK)，100×4.6毫米洗脫液正己烷/異丙醇/甲酸975∶25∶25(體積/體積)，1毫升/分鐘溫度環(huán)境溫度在這些條件下，三油酸甘油酯和油酸的保留時(shí)間分別是1.2和1.6分鐘。測(cè)量峰面積或峰高度。它們是從布片上提取后，甘油三酯和脂肪酸回收率的一種測(cè)定。以從未經(jīng)洗滌的布片上提取后甘油三酯的回收率作為100%。在上述條件下，橄欖油和油酸之間的折光率之比若按峰面積計(jì)算為0.85，按峰高計(jì)算為1.1。實(shí)例1菌株Sp9酯酶發(fā)酵的冷凍干燥上清液的制備將類產(chǎn)堿假單胞菌Sp9菌株(CBS467.85)接種入含有30毫升滅菌的腦-心臟浸出液(BHⅠ)培養(yǎng)基(Difco)的100毫升錐形瓶中，于30℃在轉(zhuǎn)速為300rpm的軌道振蕩器上振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。將在腦一心浸出液中已生長(zhǎng)的細(xì)胞接種到2升錐形瓶中培養(yǎng)，此瓶含有500毫升滅菌的脫脂牛乳培養(yǎng)基。脫脂牛乳培養(yǎng)基的制備如下-100克脫脂牛乳(Difco);-去離子水加到1升，-滅菌前調(diào)整PH到7.0-滅菌條件110℃，30分鐘。該含有脫脂牛乳培養(yǎng)基的搖瓶在250-300rpm的軌道振蕩器上振搖48小時(shí)。為產(chǎn)生脂所用的生長(zhǎng)溫度為20℃。培養(yǎng)基于8-10℃下用轉(zhuǎn)速10，000g離心(型號(hào)為SorvallRGSA)。離心后的上清液冷凍干燥即得到脂酶制劑。其它產(chǎn)生脂酶菌株的發(fā)酵，如CBS460.85，461.85，468.85，471.85和473.85，ATCC29625和DSM2672(EP-A-130064)菌株用類似的方法進(jìn)行，只是CBS468.85菌株的生長(zhǎng)溫度為30℃。按照本實(shí)例所獲得的脂酶制劑已用于實(shí)例4-8中所述的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。實(shí)例2菌株ThaiⅣ17-1脂酶發(fā)酵冷凍干燥上清液的制備將施氏假單胞Thai菌株17-1(CBS461.85)接種入含有30ml滅菌腦一心浸出液培養(yǎng)基的100ml錐形瓶中，轉(zhuǎn)速為300rpm的軌道振蕩器上30℃振菌培養(yǎng)16小時(shí)。將腦一心浸出液中生長(zhǎng)的細(xì)胞接種入含有500ml滅菌的GSM培養(yǎng)基的2升錐形瓶中培養(yǎng)。GSM培養(yǎng)基的制備如下-100g脫脂牛乳(Difco或Oxoid);-去離子水加到1升;-加入4NNaOH以調(diào)節(jié)PH到7.8;-攪拌下將溫度調(diào)到40℃;-然后加入MAXATASE(Gist-brocades)溶液;-控制該溫度和PH1小時(shí)，然后將PH調(diào)節(jié)到7。在110℃滅菌30分鐘。MAXATASE溶液的制備如下25ml去離子水中加入1gMAXATASE粉末(2.372×106德福特單位/克)，充分振搖5-10分鐘。不溶物在索瓦爾離心機(jī)SS34型轉(zhuǎn)速為10，000轉(zhuǎn)/分離心除去。上清液經(jīng)MILLIPORE公司生產(chǎn)的0.22微粒的濾器過濾。濾液中加入每升中含有10%脫脂牛乳，在搖瓶中于轉(zhuǎn)速為250-300轉(zhuǎn)/分的軌道振搖器上，于20℃振搖48小時(shí)。然后將培養(yǎng)基于8-10℃下用索瓦爾GSA離心機(jī)上以10，000g速度離心。所得上清液在乙二胺四乙酸處理過的滲析管中用50體積的10毫摩爾Tris-Hcl(PH8)緩沖液進(jìn)行滲析，溫度為4℃，在24小時(shí)內(nèi)，更換兩次緩沖液。滲析，將滲析袋中的內(nèi)容物混合并冷凍干燥。除CBS.473.85菌株外，在實(shí)例1中提及的所有其它的菌株的發(fā)酵方法都以相似的方式進(jìn)行。根據(jù)本實(shí)例所得到的含脂酶的上清液(除由菌株M-1得到的脂酶外)，均用于進(jìn)行實(shí)例9和10所描述的實(shí)驗(yàn)。實(shí)例3菌株M-1脂酶發(fā)酵的冷凍干燥上清液的制備將類產(chǎn)堿假單胞菌M-1菌株(CBS.473.85)接種入含有500毫升滅菌腦一心浸出液(BHⅠ)培養(yǎng)基(Difco)的500毫升錐形瓶中，于30℃在280轉(zhuǎn)/分的軌道振搖器上振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。在BHⅠ中生長(zhǎng)的細(xì)胞接種入含有10升滅菌的培養(yǎng)基1或培養(yǎng)基2的20升發(fā)酵罐中培養(yǎng)。-培養(yǎng)基1的制法如下1000克脫脂牛乳懸浮于去離子水中，使體積達(dá)9.5升;調(diào)節(jié)溫度到30℃和加入氫氧化鈉溶液使PH達(dá)7.8;在1小時(shí)中，加入33×106ADU(＝26×106DU)的MAXACAL(吉斯特-花錦)以進(jìn)行蛋白酶處理(30℃，PH7.0-7.8)。加入0.5-10毫升防沫劑后，于110℃高壓滅菌30分鐘。-培養(yǎng)基2的制法如下400克酪蛋白懸浮于5升去離子水中;用氫氧化鈉溶液調(diào)PH到9.0，溫度為50℃。加入5×107ADU(＝4×107DU)MAXACAL，以進(jìn)行蛋白酶處理;溫孵過程(90分鐘，50℃PH9.0)可通過迅速加熱(于90℃保溫5分鐘)而終止。冷卻至25℃后，加入硫酸溶液，調(diào)PH到7.0。加入其它成分(奶油50g;MgSO4·7H2O5g;MnSO4·4H2O0.1g及防沫劑SAG4710.5-10毫升)，再加去離子水使最后體積到10升，于120℃高壓滅菌65分鐘。培養(yǎng)基冷至發(fā)酵溫度(30℃)，發(fā)酵條件為氣流0.167vvm攪拌1000轉(zhuǎn)/分PH6.5-10.0(最好是6.8-8.0)發(fā)酵時(shí)間在35-72小時(shí)之間。發(fā)酵后，肉湯培養(yǎng)基用海蒂希(Hettich)離心機(jī)(4000g，8-10℃)離心30分鐘。上清液冷卻至0℃，在攪拌下加入固體(NH4)2SO4使?jié)舛冗_(dá)70%(重量/重量)。生成的沉淀用索瓦爾離心機(jī)(10，000g，4-5℃)離心20-25分鐘，以與上清液分開。沉淀于0℃用10毫摩爾Tris-Hcl緩沖液(PH8)處理，并于20分鐘內(nèi)加入冷卻的丙酮(＜-7℃)，使沉淀濃度為65%(重量/重量)。離心后，沉淀用10毫摩爾Tris-Hcl緩沖液(PH8)處理，并于4℃下用50體積的相同緩沖液滲析，24小時(shí)內(nèi)換透析液2次。滲析后，進(jìn)行冷凍干燥，得到產(chǎn)物的活性為6000TLU/g。實(shí)例1中提及的所有其它的菌株，可用類似的方法制備，但是需略作下述改動(dòng)對(duì)菌株Sp9只能用培養(yǎng)基1;除了菌株INⅡ-5的發(fā)酵溫度為20或30℃外，所有其它菌株的發(fā)酵溫度均勻20℃。實(shí)例4于35、40和50℃、8克ALL-堿/升條件下類產(chǎn)堿假單胞菌的脂酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)來源冷凍干燥的上清液除垢溶液ALL-堿，8克/升pH如表中所示a.溫度35℃b.溫度40℃實(shí)例5于40和50℃、4克ALL-堿/升條件下類產(chǎn)堿假單胞菌的脂酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)a.來源冷凍干燥的上清液除垢溶液ALL-堿，4克/升pH如表中所示溫度40℃b.溫度冷凍干燥上清液除垢溶液ALL-堿，4克/升pH如表中所示溫度50℃實(shí)例6于40和50℃、6克ALL-堿/升條件下類產(chǎn)堿假單胞菌Sp9菌株脂酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)來源Sp9菌株冷凍干燥的上清液除垢溶液ALL-堿，6克/升pH如表中所示a.溫度40℃實(shí)例7于40℃、5克ALL-堿/升條件下施氏假單胞菌ThaiⅣ17-1脂酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)來源ThaiⅣ17-1菌株的冷凍干燥的上清液除垢溶液ALL-堿，5克/升pH9.0溫度實(shí)例8于40和50℃、8克ALL-堿/升條件下乙酸鈣不動(dòng)桿菌菌株脂酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)來源GrⅤ-39菌株(CBS460.85)的冷凍干燥的上清液除垢溶液ALL-堿，8克/升pH10.3a.溫度40℃TLU/1x10-3時(shí)間(分鐘)殘留活性(％)4.90153010010080</table>b.溫度50℃TLU/1x10-3時(shí)間(分鐘)殘留活性(％)23.601530100275</table>實(shí)例9本實(shí)例論述了按SLM-試驗(yàn)在洗滌過程中由類產(chǎn)堿假單胞菌Sp9，INⅡ-5，GrⅥ-15，M-7，ATCC29625，施氏假單胞菌ThaiⅡ-5和乙酸鈣不動(dòng)桿菌GrⅤ-39產(chǎn)生的脂酶的性能，該試驗(yàn)對(duì)組成酶與新式洗滌組合物(TPP)、粉狀去垢組合物(ALL-堿)和液體配方(TIDE液)的成分的一致性進(jìn)行了核對(duì)。SLM-試驗(yàn)按本發(fā)明的第18-19頁所述的方法進(jìn)行、初步實(shí)驗(yàn)表明，在所用的條件下，在洗滌過程中紡織物上存留著相當(dāng)數(shù)量的由于脂酶的作用所生成的脂肪酸和殘留的甘油三酯。上述脂酶的性能和空白試驗(yàn)，用SLM法進(jìn)行了測(cè)定，條件如下-標(biāo)準(zhǔn)自來水(STW)用堿調(diào)pH到9.1。-三聚磷酸鈉(TPP)2和10克/升(pH9.1)。-液體TIDE2和4克/升(pH7.5)。-ALL-堿2，4和8克/升(pH9.2-9.6)。所加入的脂酶活性單位(20TLU)是從按實(shí)例2和菌株為M-1時(shí)按實(shí)例3而產(chǎn)生的冷凍干燥樣品獲得的?；钚匀缦陆Y(jié)果列于下述表中。這些表清楚地表明本發(fā)明的脂酶對(duì)紡織物上的油脂有溶脂性質(zhì)，尤其是在洗滌條件下，它們?cè)谝后w和粉狀除垢劑中有優(yōu)良的性能。實(shí)例10本實(shí)例說明了在洗滌條件下，本發(fā)明的某些脂酶與漂白劑或蛋白裂解酶作用的一致性。脂酶的性能是用SLM-法測(cè)定的，如于本說明書第18-19頁中所闡述的，測(cè)定的條件如下-ALL-堿+漂白活化劑(TADE30%)4克/升(pH9.1)。-ALL-堿+TADE+漂白劑(NaBO3·4H2O，13%)，4克/升(pH9.1)。-ALL-堿+TADE+蛋白酶(2000DU/克去垢劑)4克/升(pH9.1)。被加入的脂酶活性單位(TLU)是由按實(shí)例2和菌株為M-1時(shí)按實(shí)例3(見實(shí)例9)產(chǎn)生的冷凍干燥樣品得到的。脂酶菌株INⅡ-5，M-1，GrⅥ-15及ATCC29625。蛋白酶MAXATASE，MAXATASE(DU/升)的蛋白水解活性是按德福特(Delft)方法測(cè)定的，載于美國油脂化學(xué)會(huì)志60卷(1983)1672頁。結(jié)果列于下述表中。結(jié)果的表達(dá)方式與實(shí)例9相同。A.從菌株INⅡ-5得到的堿性脂酶條件回收率(%)甘油三脂游離脂肪酸總量ALL-堿+TADE4.462.466.8ALL-堿+TADE+5.764.570.2漂白劑ALL-堿+TADE+2.261.163.3MAXATASEB.由菌株M-1得到的堿性脂酶D.由菌株ATCC29625得到的堿性脂酶這些表也清楚地表明本發(fā)明的脂酶對(duì)紡織物上的油脂有溶脂性質(zhì)，尤其是在洗滌條件下，它們?cè)谝后w和粉狀除垢劑中有優(yōu)良的性能。權(quán)利要求1.一種溶脂酶，它是從類產(chǎn)堿假單胞菌(ATCC29625除外)、施氏假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌所選擇的細(xì)菌株中獲得，這種酶進(jìn)一步的特征為a)最適pH范圍為8-10.5pH是在測(cè)定真脂酶單位的條件下在pH恒定儀上測(cè)定的；b)在溫度為60℃或60℃以下、pH為7-11之間的洗滌條件下，在含去垢劑溫度為10克/升的水溶液中顯示出有效的脂酶活性；2.按照權(quán)利要求1所述的溶脂酶，它是從CBS467.85，CBS468.85，CBS471.85和CBS473.85或其變種或其突變型菌株選擇出的類產(chǎn)堿假單胞菌中得到的;3.按照權(quán)利要求1所述的溶脂酶，它是從施氏假單胞菌CBS461.85和乙酸鈣不動(dòng)桿菌CBS460.85或其變種或其突變株所選擇出的菌株得到的;4.按照權(quán)利要求1所述的溶脂酶，它是自亞種Citrulli和Konjaci或其變種或其突變型菌株所選擇出的類產(chǎn)堿假單胞菌變異株中得到的;5.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1中規(guī)定的溶脂酶的方法，包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)選自除ATCC29625外的類產(chǎn)堿假單胞菌，施氏假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌的細(xì)菌株，以形成富含脂酶的培養(yǎng)液，并從培養(yǎng)液分離出脂酶;6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其中產(chǎn)堿假單胞菌株選自CBS46785，CBS468.85，CBS471.85和CBS473.85。7.按照權(quán)利要求5所述的方法，其菌株選自施氏假單胞菌CBS461.85和乙酸鈣不動(dòng)桿菌CBS460.85;8.一種洗滌組合物，它包含一種溶脂酶，該酶是由類產(chǎn)堿假單胞菌、施氏假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌選出的菌種產(chǎn)生的，該酶進(jìn)而鑒定為a)最適pH范圍為8-10.5，pH是在如所述的測(cè)定真脂酶單位的條件下，在pH恒定儀上測(cè)定的;b)在溫度為60℃或60℃以下、pH為7-11之間的洗滌條件下，在除垢劑溫度為10克/升的水溶液中顯示出有效的脂酶活性;該溶脂酶還可與一種除垢劑或在該混合物中常用的任何其它成份合用。9.按照權(quán)利要求8所述的組合物，其中菌株選自產(chǎn)堿假單胞菌CBS467.85，CBS468.85，CBS471.85，CBS473.85和ATCC29625，施氏假單胞菌CBS461.85以及乙酸鈣不動(dòng)桿菌CBS460.85;10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中脂酶活性范圍為每克組合物有1-20，000真脂酶單位(TLU);11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中的任何一項(xiàng)所述的組合物，它除含有溶脂酶外，還含有蛋白溶解酶;12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中蛋白水解活性的范圍為50-10，000德福特單位/克;13.一種酶促除垢添加劑，其中含有在權(quán)利要求8或9中所規(guī)定的溶脂酶，蛋白酶和任選的淀粉酶;14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種酶促除垢添加劑，其脂酶活性為每克添加劑102-106真脂酶單位(TLU);15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的一種酶促除垢添加劑，其中蛋白酶水解蛋白的活性為每克添加劑5×104-106德爾特單位(Du);16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中的任何一項(xiàng)所述的酶促除垢添加劑，它為顆粒形或球粒形;17.根據(jù)權(quán)利要求13-15中的任何一項(xiàng)所述的酶促除垢添加劑，它是以含有一種酶穩(wěn)定劑的液體形式存在。18.一種洗滌方法，包括使用如權(quán)利要求8-12中的任何一項(xiàng)所述的洗滌組合物，洗滌過程中pH在7-11的范圍內(nèi)，溫度為60℃或低于60℃。19.根據(jù)權(quán)利要求8或9所規(guī)定的溶脂酶在洗滌組合物或酶促除垢添加劑中的用途。專利摘要本發(fā)明提供了具有最適pH范圍為8—10.5的新溶脂酶。在洗滌條件下，除垢劑在水溶液濃度為10克/升，溫度為60℃或60℃以下，pH為7—11時(shí)該酶顯示出有效的脂酶活性。這些脂酶在洗滌組合物、預(yù)混劑和酶促除垢添加劑中是有用的。它們可從類產(chǎn)堿假單胞菌、施氏假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌選出的菌株獲得。最好的菌株是類產(chǎn)堿假單胞菌CBS467.85，CBS468.85，CBS473.85，和ATCC29625、施氏假單胞菌CBS461.85和乙酸鈣不動(dòng)桿菌CBS460.85，及其變種或突變型菌株。文檔編號(hào)C11D3/386GK86106566SQ86106566公開日1988年4月20日申請(qǐng)日期1986年10月7日發(fā)明者法倫·法羅克,拉伯特·約翰尼斯·扎科布斯·馬里拉,沃施奧爾·格里特·約翰尼斯申請(qǐng)人:吉斯特-布羅卡迪斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan