本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工業(yè)過程的優(yōu)化調(diào)控方法，具體涉及一種降低美拉德反應對微生物生長及發(fā)酵抑制作用的方法，屬于微生物發(fā)酵技術領域。
背景技術：
1912年法國化學家路易斯﹒卡米拉﹒美拉德在實驗中偶然發(fā)現(xiàn)：羰基化合物（還原糖）的羰基可以與氨基化合物（氨基酸/多肽/蛋白質(zhì)）中的氨基發(fā)生反應，該反應經(jīng)過一系列復雜歷程最終生成棕黑色的大分子物質(zhì)類黑素或稱擬黑素，該羰氨反應又稱美拉德反應。
經(jīng)過各國學者多年研究，目前公認的美拉德反應機理可分以下三個階段：
起始階段
還原糖與氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生縮合反應，生成具有亞胺或甲亞胺特性基團的有機化合物，即席夫堿；席夫堿環(huán)化生成氨基糖；氨基糖經(jīng)Amadori重排生成1-氨基-1-脫氧-2-酮糖。
中間階段
在酸性條件下，1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)1,2-烯醇化反應，生成5-羥甲基糠醛；堿性條件下，1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)2,3-烯醇化反應，生成還原酮類和脫氫還原酮類；1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)Strecker降解反應生成Strecker醛類和吡嗪類等化合物。
最終階段
該階段反應較為復雜，歷程尚未完全明確，大致是中間階段的產(chǎn)物與氨基化合物聚合反應生成高分子結構不明的類黑素，此外還有一系列中間體還原酮及揮發(fā)性雜環(huán)化合物生成。
有研究表明，美拉德反應的反應速率隨溫度的增長呈現(xiàn)急劇升高的趨勢，且美拉德反應部分中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物具有抑制微生物生長的作用，因此在微生物發(fā)酵工業(yè)中為避免還原糖類碳源與氨基化合物類氮源在高溫下發(fā)生美拉德反應，通常將碳源和氮源分開滅菌，待冷卻后再將其混合進行微生物發(fā)酵，而該工藝手段通常存在滅菌能耗較高、設備投入成本較大的問題。同時，美拉德反應產(chǎn)物還具有人們不需要的色澤和一定的致癌性，因此目前關于降低或抑制美拉德反應的文獻報道主要集中在食品、醫(yī)藥等領域，而在微生物發(fā)酵領域的相關報道較少。
CN1256032C公開了一種能減輕色變的大豆蛋白酶解方法，該方法要求在酶解罐中添加微量的氧化劑（H2O2）和還原劑（Na2SO3、Na2S2O5和NaHSO3）將大豆酶解生成的少量低聚糖的羰基轉(zhuǎn)化為羥基，以此抑制美拉德反應。首先該方法不回收循環(huán)使用添加到體系的可溶性鹽，增加了生產(chǎn)成本；其次微生物發(fā)酵領域通常涉及高濃度還原糖-氨基化合物混合體系，因此該方法不適用于微生物發(fā)酵領域。
CN102888325A公開了一種發(fā)酵型棗酒的加工工藝，該方法在整個工藝流程中控制加工溫度最高不超過55℃，以達到抑制美拉德反應并減少褐變發(fā)生。該方法無法應用于微生物發(fā)酵領域常用的121℃高溫濕熱滅菌操作，并且為避免后期發(fā)酵染菌而向體系中通入SO2的方法不適用于細菌發(fā)酵培養(yǎng)，同時因SO2具有腐蝕性也相應地增加了設備要求及成本。
CN104188006A公開了一種蕎麥提取物、抑制果汁褐變的方法、制備蘋果汁的方法，該方法先提取蕎麥中具有抗氧化作用的黃酮類化合物，再將該蕎麥提取物添加到混濁蘋果汁中進行壓榨、濃縮處理，以此實現(xiàn)抑制果汁褐變的目的。該方法主要針對食品加工過程中的酶促褐變，且操作步驟多，設備成本高，添加的蕎麥提取物不與產(chǎn)品分離且不能循環(huán)使用，增加了產(chǎn)品成本。
綜上，在微生物發(fā)酵領域中，亟需尋找一種優(yōu)化調(diào)控方法，能夠在不改動現(xiàn)有設備和高溫濕熱滅菌工藝的基礎上，經(jīng)濟、有效的降低美拉德反應對微生物生長及發(fā)酵抑制作用。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術中在微生物發(fā)酵領域缺乏切實有效的降低美拉德反應對微生物生長及發(fā)酵抑制的問題，本發(fā)明為解決以還原糖為碳源、以氨基化合物為氮源的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基在高溫濕熱滅菌過程中普遍發(fā)生的美拉德反應抑制微生物生長及發(fā)酵的問題，提供一種利用二元酸和一元醇作為美拉德反應抑制劑的方法，可以維持現(xiàn)有高溫濕熱滅菌工藝和設備并省去培養(yǎng)基分消環(huán)節(jié)，從而滿足微生物發(fā)酵領域?qū)?jīng)濟、有效降低抑制微生物生長及發(fā)酵的美拉德反應的需求。
本發(fā)明的技術目的通過以下技術方案實現(xiàn)：
一種降低培養(yǎng)基滅菌過程中的美拉德反應的方法，向配制好的培養(yǎng)基中加入二元酸和一元醇，二元酸按10~200g/L培養(yǎng)基加入，二元酸和一元醇的混合摩爾比為1:0.5~2，攪拌，滅菌，冷卻至50~100℃后通入無菌氣體使其通過培養(yǎng)基，停止攪拌，繼續(xù)冷卻，待體系分層，分出有機相和固相，培養(yǎng)基用于發(fā)酵；所述二元酸選自壬二酸、癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸和十五碳二元酸中的至少一種，所述一元醇選自甲醇、乙醇和正丙醇中的至少一種。
進一步的，所述二元酸的加入量優(yōu)選為50~100g/L培養(yǎng)基，可以保證降低美拉德反應的效果，又能節(jié)省原料。
進一步的，所述二元酸和一元醇的混合摩爾比優(yōu)選為1:1~2。
進一步的，所述二元酸和一元醇選自二者發(fā)生酯化反應后可生成密度大于水、沸點高于水的酯類的二元酸和一元醇。本發(fā)明所選用的二元酸微溶或難溶于水，常溫下為固態(tài)晶體或粉末，密度大于水，熔點范圍為80~135℃。
進一步的，本發(fā)明所述的方法更適用于大型發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基滅菌，可以在很大程度上節(jié)省工藝，在滅菌條件下，達到二元酸的熔點，形成有機相，在滅菌過程中保持攪拌，攪拌可以加強發(fā)酵罐內(nèi)混合體系的動量傳遞、質(zhì)量傳遞和熱量傳遞，同時也能使水-有機兩相充分混合達到或接近乳化狀態(tài)，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為10～800rpm，優(yōu)選為80~150rpm。此時，二元酸和一元醇部分反應生成二酸二酯類化合物。另外，在滅菌結束后，待體系冷卻后再停止攪拌，防止冷卻前高溫下發(fā)生美拉德反應。
進一步的，待體系冷卻至50~100℃時，將無菌氣體通過培養(yǎng)基，可以將反應體系中殘留的一元醇帶出體系，所述無菌氣體為無菌空氣或無菌氮氣，當培養(yǎng)基用于有氧發(fā)酵時采用無菌空氣，當培養(yǎng)基用于無氧發(fā)酵時采用無菌氮氣。
進一步的，繼續(xù)冷卻待體系分層后，優(yōu)于在本發(fā)明所選擇的二元酸和一元醇范圍內(nèi)，生成的二酸二酯類化合物不溶或微溶于水，且密度大于水，分于下層，未反應完全的二元酸析出晶體沉于底部，通過發(fā)酵罐的出料口即可將反應產(chǎn)物和二元酸分離出來，而培養(yǎng)基可直接用于發(fā)酵。大大節(jié)省了滅菌工藝，降低染菌的風險。
進一步的，所述滅菌為高溫濕熱滅菌，它更容易造成美拉德反應，高溫濕熱滅菌是指用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進行滅菌的方法，在50～135℃高溫濕熱滅菌1～1000min。例如現(xiàn)有技術中最常用的121℃、30min滅菌條件下更適合采用本發(fā)明的方法降低美拉德反應。
進一步的，本發(fā)明的培養(yǎng)基尤指糖濃度和氮濃度較高的培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基中的碳源為還原糖，具有游離醛基、半縮醛羥基或游離羰基等基團，選自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、木糖或核糖中的至少一種；所述氮源為具有氨基的有機化合物，選自牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、豆粕和玉米漿中的至少一種。
在本發(fā)明的方法中，當向培養(yǎng)基中添加二元酸和一元醇后，二者部分發(fā)生反應生成二酸二酯類化合物，再將培養(yǎng)基混合進行高溫濕熱滅菌處理，該培養(yǎng)基顏色明顯比不添加二元酸和一元醇而直接混合滅菌的培養(yǎng)基顏色淺。將滅菌培養(yǎng)基中的二酸二酯類化合物及未反應完全的二元酸和一元醇分離除去后進行發(fā)酵對比實驗，實驗比較結果表明微生物在二元酸和一元醇處理過的培養(yǎng)基上的生長指標和發(fā)酵指標都明顯優(yōu)于未經(jīng)處理的培養(yǎng)基對照組。有研究表明美拉德反應的中間產(chǎn)物席夫堿、氨基糖、5-羥甲基糠醛以及最終產(chǎn)物類黑素具有抑制微生物生長和發(fā)酵的作用，根據(jù)實驗現(xiàn)象和結果推斷本發(fā)明的作用機理如下：1、二元酸和一元醇部分反應生成二酸二酯類化合物，其中的羰基與培養(yǎng)基中的氨基化合物反應，通過阻止還原糖與氨基化合物反應來抑制美拉德反應的發(fā)生；2、生成的二酸二酯類化合物與美拉德反應的中間產(chǎn)物發(fā)生反應，通過減少美拉德反應體系通量降低了美拉德最終產(chǎn)物的生成量；3、生成的二酸二酯類化合物與培養(yǎng)基混合會形成水-有機兩相體系，美拉德反應的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物素因萃取作用而主要集中在二酸二酯類化合物的有機相中，隨長二酸二酯類化合物的分離而被分離出培養(yǎng)基。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：
1、二元酸和一元醇的加入能夠有效的降低體系中的美拉德反應通量，并能通過萃取原理將美拉德反應中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物從體系中分離出去，處理后的培養(yǎng)基更適于微生物生長與發(fā)酵，顯著地提高了培養(yǎng)基的每批次利用率，也提高了發(fā)酵經(jīng)濟性。
2、在還原糖類碳源與氨基化合物類氮源同時存在于培養(yǎng)基中時，相比于分消滅菌工藝，本發(fā)明的一次滅菌工藝使發(fā)酵設備建設成本降低了一半、滅菌能耗降低了一半，顯著地節(jié)省了設備建設和運行成本。
3、靜置分層即可分離出體系的特點使生成的二酸二酯類化合物及及未反應完全的二元酸的分離成本可以忽略不計。
綜上，本發(fā)明能夠提高培養(yǎng)基的每批次利用率，節(jié)省設備建設、運行及應用成本，滿足了微生物發(fā)酵領域?qū)?jīng)濟、有效的降低美拉德反應對微生物生長及發(fā)酵抑制作用的需求，具有良好的應用前景。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例與比較例中使用的干酪乳桿菌為撫順石油化工研究院篩選培養(yǎng)的Lactobacillus casei FY-04菌株，現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；保藏編號：CGMCC No.3269。
實施例與比較例中使用的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖150g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸氫二氨2g/L、磷酸氫二鉀2g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L、吐溫80 1g/L。
實施例1
在發(fā)酵罐中配制好培養(yǎng)基后，按100g/L培養(yǎng)基加入壬二酸，按壬二酸：甲醇摩爾比為1:2加入甲醇，設定發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，通入蒸汽將發(fā)酵罐溫度維持在121℃下30min以達到滅菌效果。滅菌結束后，將發(fā)酵罐溫度冷卻至60℃后通入無菌氮氣15min，然后停止攪拌，繼續(xù)冷卻，靜置20min后從發(fā)酵罐下出料口將有機相和固相排出。恢復攪拌轉(zhuǎn)速100prm，按培養(yǎng)基體積10%接入干酪乳桿菌種子液，42℃度下發(fā)酵48h后取樣，用鉑-鈷比色法測定發(fā)酵液顏色，鉑-鈷比色法數(shù)值越小說明發(fā)酵液顏色越淺；用600nm處吸光度測定菌體濃度，OD600越大說明菌體濃度越高；用液相色譜法測L-乳酸濃度。
實施例2
與實施例1相比，實施例2按50g/L培養(yǎng)基加入癸二酸，按癸二酸：乙醇摩爾比為1:1.5加入乙醇，其他與實施例1相同。
實施例3
與實施例1相比，實施例3按150g/L培養(yǎng)基十一碳二元酸，按十一碳二元酸：正丙醇摩爾比為1:1加入正丙醇，其他與實施例1相同。
比較例1
與實施例1相比，比較例不加入二元酸和一元醇，其他與實施例1相同。
實施例與比較例的結果如表1所示。
表1. 實施例與比較例的發(fā)酵液色度及發(fā)酵結果