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      檢測人vegf的組合試劑、試劑盒及其使用方法

      文檔序號(hào):8217111閱讀:1693來源:國知局
      檢測人vegf的組合試劑、試劑盒及其使用方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域,特別是一種抗人VEGF的鼠單克隆抗體及由其組成的檢 測生物樣品中人VEGF水平的組合試劑、試劑盒及其使用方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 在迄今發(fā)現(xiàn)的20多種多肽類血管生長因子中,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF,也可寫作VEGF-A)是針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異性最高,促 血管生長作用最強(qiáng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在多種原發(fā)性惡性腫瘤組織中均呈高表達(dá)。此外,眼睛 水狀液和玻璃狀液中VEGF的增加證實(shí)與各種視網(wǎng)膜病緊密關(guān)聯(lián)(Aiello LP等,#份取// 1994,331:1480-1487)。
      [0003] VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白,由兩條分子量為24 kDa的單鏈以二硫鍵 組成二聚體。人VEGF基因由8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子組成,由于mRNA剪切方式的不同,分別 生成VEGF 121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF 2(I6等至少5種蛋白異構(gòu)體,其中VEGF165是體內(nèi)表 達(dá)最多且生物活性最強(qiáng)的亞型。上述VEGF異構(gòu)體NH 2末端115個(gè)氨基酸相同但COOH末端 長度不同。VEGF165分子量45 kDa,分泌型蛋白,可分泌進(jìn)入血液循環(huán),但也有相當(dāng)一部分通 過肝素結(jié)合部位結(jié)合于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)。VEGF165和VEGF 189在纖溶酶作用下,裂解并 釋放出N-末端110氨基酸,這是其與受體結(jié)合的部位。VEGF通過與其3個(gè)高親合力酪氨酸 激酶受體(RTKs),分別為 VEGFRl (又稱 FLTl)、VEGFR2 (又稱 KDR 或 Flk-I)和 VEGFR3 (又 稱FLT4)結(jié)合而發(fā)揮作用。
      [0004] 1994年,Kondo等人首次報(bào)道了癌癥病人血清中VEGF水平高于健康人群。后續(xù)的 大量研究進(jìn)一步表明VEGF可能是腫瘤廣譜標(biāo)志物(Tumor Marker)。因?yàn)樵趲缀跛袑?shí)體 腫瘤和部分非實(shí)體腫瘤病人中,其血液中VEGF濃度都有一定程度的增加 (Kessler T等, Targets,2007,8:257-268)。這種趨勢常見于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結(jié) 直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、尿道上皮癌癥、鼻咽癌、頭頸部癌、膀胱癌、胰腺癌、骨肉瘤、Ewing 氏瘤、軟骨肉瘤、巨細(xì)胞瘤、黑色素瘤、白血病包括T-細(xì)胞白血病和B-細(xì)胞白血病、腎細(xì) 胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、非何杰金氏瘤、Wilm氏瘤、血管肉瘤、前列腺癌、軟組織肉瘤、卵巢癌、 陰唇癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、艾滋病并發(fā)的卡波氏肉瘤等(Berkman RA等,1993,/CZi/? Invest, 91:153-159) 〇
      [0005] VEGF分泌進(jìn)入血液循環(huán),因此其血液濃度檢測可以作為腫瘤的廣譜篩查、輔助診 斷、預(yù)后、治療療效是否復(fù)發(fā)等情況的監(jiān)測指標(biāo)。VEGF在幾乎所有實(shí)體腫瘤的血液中增加, 符合廣譜篩查的"廣譜"。雖然臨床應(yīng)用C-12、C-5等作為腫瘤篩查,目前我國尚沒有篩查譜 比較廣的單一血液腫瘤標(biāo)志物。而在體檢臨床實(shí)踐中,C-12和C-5包括瘤種還是有限的。 VEGF今后可作為我國癌癥預(yù)防的初篩,從普通人群發(fā)現(xiàn)可疑腫瘤患者。為精查和進(jìn)一步確 診提供較為可靠的依據(jù)、這樣可以節(jié)省成本、增加篩查效率。另一方面,在我國癌癥預(yù)防實(shí) 踐中,用于篩查常用方法有子宮頸癌巴士涂片、結(jié)直腸癌隱血試驗(yàn)、前列腺癌肛門指診、食 管癌拉網(wǎng)等。組織特異性腫瘤標(biāo)志物有AFP (肝癌)、PSA (前列腺癌)、CA125 (卵巢癌)等。 VEGF不僅可作為這些腫瘤普查、而且還可作為上述方法不能普查到其它大部分腫瘤的普查 方法,如腦部腫瘤、骨科腫瘤、間皮瘤等。
      [0006] 另一方面,VEGF還符合作為癌癥早期標(biāo)志物的一般標(biāo)準(zhǔn)。Findeisen等用ELISA 方法檢測了 314份乳腺癌血清和58份正常女性血清的VEGF、TPA、CA15-3和CEA含量,結(jié) 果發(fā)現(xiàn):VEGF血液濃度不僅在乳腺癌各期均增加,而且在其早期0-1期即增加。而CA15-3 和CEA只有4期癌癥和正常對(duì)照才有顯著性差異,由此推斷VEGF在乳腺癌的早期檢測優(yōu)于 CEA和CA15-3。另外,有人在研究VEGF和CEA的血液濃度與肺癌病人臨床病例特征的關(guān)系 時(shí)發(fā)現(xiàn),VEGF在I期(早期)腺癌的早期診斷價(jià)值優(yōu)于CEA。VEGF與CEA聯(lián)合檢測其靈敏度可 達(dá) 75%、特異度可達(dá) 60% (el-Houseini ME 等,Gflcer 2005,12 (4): 248-253)。
      [0007] VEGF血液濃度研究的另一項(xiàng)主要應(yīng)用可能是腫瘤疾病預(yù)后。一是血液VEGF濃度 與疾病生存時(shí)間長短、生存質(zhì)量有關(guān);二是血液VEGF濃度與疾病分期和嚴(yán)重程度有關(guān)。據(jù) 報(bào)道,除極少數(shù)外,絕大多數(shù)研究均表明血液VEGF濃度與腫瘤的大小、進(jìn)展程度或/和預(yù) 后不良密切相關(guān),即VEGF濃度越高,腫瘤瘤體越大或預(yù)后越差(Brattstr0m D等, 2002,37(1) :57-63)。綜上可知,血液VEGF是一個(gè)可靠血管生成異常和癌癥病程 的標(biāo)志物,檢測和評(píng)價(jià)血液VEGF是一種癌癥病人預(yù)后等極具前景的新方法。
      [0008] 目前,VEGF在腫瘤診斷中的應(yīng)用主要有兩方面,一是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 方法檢測血液VEGF濃度作為腫瘤篩查和輔助診斷;二是免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織 VEGF表達(dá)量的多寡,作為回顧性診斷。ELISA方法在目前VEGF血液檢測試驗(yàn)中應(yīng)用較多, 主要有以下幾種原因:一是方法靈敏度好;二是快速、方便、易于操作;三是與免疫熒光標(biāo) 記比,操作可控性更好;與同位素標(biāo)記比,沒有污染,費(fèi)用低。有文獻(xiàn)報(bào)道正常人群和腫瘤患 者中血液VEGF濃度差別極大。測量血液VEGF濃度能力依賴于建立靈敏且特異性高的檢測 方法。目前基于比色法、化學(xué)發(fā)光及熒光測定的酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血液VEGF已有報(bào) 道。例如,Houck等1992,340:1120-1124)描述了具有ng/ml 靈敏度的比色ELISA, 但其靈敏度不足以檢測血液VEGF水平。Keyt等(/沿W泛挪,1996, 271:7788-7795)及 ShifrenC/ i&?£/ocri/?o/,1996,Metab,81:3112)開發(fā)了基于雙單克隆抗體夾心的比 色ELISA。雖然該ELISA能夠在癌癥患者中檢出升高的VEGF濃度,但其缺乏在正常個(gè)體中 測定內(nèi)源水平的VEGF所需的靈敏度。
      [0009] VEGF檢測試劑來源比較多,但都未能標(biāo)準(zhǔn)化,也沒有經(jīng)CFDA注冊(cè)核準(zhǔn)上市的VEGF 診斷試劑,各個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到的數(shù)據(jù)差異很大,如正常值范圍相差近10倍左右,且抗體特異 性不高,靈敏度較低,穩(wěn)定性和重復(fù)性差等,盡管其中一些ELISA試劑盒能檢測癌癥患者升 高的VEGF濃度,但是它缺乏測定正常個(gè)體中VEGF血液水平所需的敏感性,因而無法達(dá)到臨 床檢驗(yàn)或診斷的需求。因而,本領(lǐng)域急需研制一種高特異性、高靈敏度的VEGF臨床檢驗(yàn)或 診斷試劑,用于腫瘤的廣譜篩查、輔助診斷、預(yù)后等情況的監(jiān)測,其在癌癥患者的生物樣品 中比試劑盒能檢測到更高的VEGF可測定水平,并且能夠測定循環(huán)中的VEGF多數(shù)亞型。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0010] 本發(fā)明提供了一種檢測生物樣本中VEGF所有同工型的組合試劑、試劑盒及其使 用方法,具體地,本發(fā)明提供檢測生物樣品中的VEGF的方法,優(yōu)選來自癌癥、糖尿病或其它 與血管生成異常相關(guān)疾病病人的樣品。
      [0011] 本發(fā)明人鑒定了 一株高親和力鼠單克隆抗體,命名為:TM12-15-1,與抗原VEGF的 結(jié)合平衡解離常數(shù)Kd值達(dá)到0.01 nM,具有極高的特異性和靈敏度。一方面,所述鼠單克隆 抗體TM12-15-1或其抗體片段高特異性地結(jié)合于VEGF生物活性區(qū),當(dāng)其作為捕獲或包被抗 體時(shí),可以結(jié)合含N-末端前110個(gè)氨基酸的所有VEGF同工型。另一方面,當(dāng)鼠單克隆抗體 TM12-15-1作為檢測抗體時(shí),可結(jié)合VEGF生物活性區(qū),即VEGF KDR或FLTl受體結(jié)合結(jié)構(gòu) 域,這確保檢測到的VEGF分子是不被例如循環(huán)中可溶性VEGF受體封閉的。本發(fā)明還提供 了一種組合試劑,包含所述鼠單克隆抗體TM12-15-1。再一方面,本發(fā)明提供了一種試劑盒, 包含上述組合試劑。因而,本發(fā)明提供了一種檢測循環(huán)型VEGF分子更準(zhǔn)確、更簡易的測定 方法。
      [0012] 更詳細(xì)地,本發(fā)明提供下列技術(shù)方案: 1、本發(fā)明提供一種鼠抗人VEGF單克隆抗體,其特征在于,所述鼠單克隆抗體可結(jié)合 VEGF生物活性區(qū),即VEGF KDR或FLTl受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
      [0013] 較佳地,所述鼠單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的⑶R-Hl、⑶R-H2和⑶R-H3氨基酸序 列分別如SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示;所述鼠單克隆抗體的輕鏈可變 區(qū)的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 氨基酸序
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