鹽地堿蓬耐鹽堿基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學和生物技術領域，更加具體地說，涉及選自鹽地堿蓬的耐 鹽堿基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 土壤鹽漬化是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的嚴重問題之一，鹽脅迫是限制植物生長發(fā)育的 重要因子。隨著近年來國家對鹽堿地的開發(fā)和利用日益重視，對抗鹽基因的分離與功能研 究成為生物學的熱門研究方向。創(chuàng)制耐鹽作物品種是在環(huán)球工業(yè)化大背景下取得糧食產(chǎn)量 穩(wěn)定持續(xù)增長的重要手段之一，但是由于缺乏對作物耐鹽的分子機理以及與耐鹽有關基因 的了解，阻礙了耐鹽作物的培育。隨著對植物鹽脅迫應答的分子機理研究不斷深入，特別是 以擬南芥為研究對象，植物在鹽脅迫條件下的離子平衡和耐鹽反應調(diào)節(jié)途徑的研究取得了 突破性的進展。目前，對抗鹽基因的分離是當前利用基因工程方法進行抗鹽作物培育的首 要任務。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種從鹽地堿蓬中獲取的耐鹽堿基 因及其應用。
[0004] 本發(fā)明的技術目的通過下述技術方案予以實現(xiàn)：
[0005] 鹽地堿蓬耐鹽堿基因如序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，或者與SEQID No. 1所示的核苷酸序列相比具有添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的，且與SEQID No. 1所示的核苷酸序列相比具有90- 95%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸 序列。
[0006] 重組載體，包含上述鹽地堿蓬耐鹽堿基因，例如pJETl. 2、pD0NR201、pK2GW7。
[0007] 農(nóng)桿菌細胞，轉染上述鹽地堿蓬耐鹽堿基因。
[0008] 本發(fā)明的鹽地堿蓬耐鹽堿基因在改良植物耐鹽堿性中的應用，所述植物可選擇擬 南芥或者楊樹。
[0009] 本發(fā)明公開鹽地堿蓬耐鹽堿基因及其應用，從鹽地堿蓬中獲取并具有序列表中 SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，并能夠獲得含有該基因的重組載體和宿主細胞，采用該基 因轉染的擬南芥和楊樹表現(xiàn)出對鹽堿的耐受力，說明本發(fā)明提供的耐鹽堿基因在改良作物 耐鹽堿能力中的應用。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明的鹽地堿蓬耐鹽堿的基因克隆電泳示意圖。
[0011] 圖2是轉染之后pJETl. 2_SgSAT的測序表達電泳圖。
[0012] 圖3是含有本發(fā)明的鹽地堿蓬耐鹽堿的基因SgSAT的表達載體示意圖。
[0013] 圖4是pK2GW7(I)_SgSAT32轉化擬南芥后，T3純合體PCR測定表達水平結果示意 圖。
[0014] 圖5是SgSAT32轉基因擬南芥T3純合體抗鹽實驗效果圖。
[0015] 圖6是SgSAT32轉基因楊樹抗鹽實驗效果圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案。
[0017] 使用的植物堿蓬（鹽地堿蓬）來源為天津市濱海新區(qū)北塘口東海路。
[0018] 首先以此為原料獲取本發(fā)明的耐鹽堿基因（即鹽地堿蓬SAT基因的克?。?br>[0019] 取五周新鮮鹽地堿蓬植株，使用植物EasyPurePCRPurificationKit(Trans geneCode#EP101_0150rxns)提取totalRNA，并且利用EasyScriptFrist-StrandcDNA SynSgesisSuperMix(TransgeneCode#AE301_03100rxns)去除基因組DNA干擾，反轉錄出 cDNA。
[0020] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的ArabidopsisthalianaSAT32s基因的序列保守區(qū)設計簡 并引物SAT-5 和SAT-3,然后利用RACE-PCR技術（Introgen，F(xiàn)irstChoice?RLM-RACEKit withManual)獲得鹽地堿蓬SAT基因全長cDNA序列，將擴增得到的SAT基因進行測序分 析，得到完整SgSAT基因全長為1029bp，如序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，即本 發(fā)明的耐鹽堿基因。
[0021] 在上述方案中，引物SAT-5如序列表中SEQIDN0. 2所示， 5' -TGGAGGAGGGITCATAAGCA-3' ；引物SAT-3 如序列表中SEQIDN0.3 所示， 5, -ATGCTGTGAGGAAGGAGAATGA-3，。
[0022] 根據(jù)SgSAT基因核苷酸序列設計上下游引物SAT-F和SAT-R，利用EasyScript Frist-StrandcDNASynSgesisSuperMix(TransgeneCode#AE301-03100rxns)去 除基因組DNA干擾，反轉錄出鹽地堿蓬cDNA，引物SAT-F如序列表中SEQIDN0.4所 示，5' -CTTGAGITCTGAITTCACTGATGG-3' ；引物SAT-R如序列表中SEQIDNO. 5 所示， 5' -TCAITCTCCTTCCTCACAGCAT-3'。反應PCR程序：42°C30min，85°C5min，4°C，進行保存。
[0023] 利用RACE-PCR技術的具體步驟，如下：
[0024] (l)cDNA第一鏈的合成，用反轉錄試劑盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0,以興 安落葉松總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，在AMV逆轉錄酶的作用下合成第一鏈cDNA，反 轉錄體系如下表所示。反應條件：42°C60min，99°C5min。
[0025]
【主權項】
1. 鹽地堿蓬耐鹽堿基因如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列相比具有添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的，且與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列相比具有90- 95%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸 序列。
2. 重組載體，包含如權利要求1所述的鹽地堿蓬耐鹽堿基因。
3. 根據(jù)權利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pJETl. 2、pD0NR201、 pK2GW7〇
4. 農(nóng)桿菌細胞，轉染如權利要求1所述的鹽地堿蓬耐鹽堿基因。
5. 如權利要求1所述的鹽地堿蓬耐鹽堿基因在改良植物耐鹽堿性中的應用。
6. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述植物可選擇擬南芥或者楊樹。
【專利摘要】本發(fā)明公開鹽地堿蓬耐鹽堿基因及其應用，從鹽地堿蓬中獲取并具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列，并能夠獲得含有該基因的重組載體和宿主細胞，采用該基因轉染的擬南芥和楊樹表現(xiàn)出對鹽堿的耐受力，說明本發(fā)明提供的耐鹽堿基因在改良作物耐鹽堿能力中的應用。
【IPC分類】C12N15-82, C12N1-21, C12N15-29, A01H5-00
【公開號】CN104531721
【申請?zhí)枴緾N201410839705
【發(fā)明人】王潔華, 羅翠, 楊少輝
【申請人】天津大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月30日