一種宇佐美曲霉環(huán)氧化物水解酶基因的克隆及異源表達方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及來源于宇佐美曲霉（Aspergillususamii)E001的一種環(huán)氧化物水解 酶基因cDNA序列的克隆及異源表達，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性環(huán)氧化物是有機合成中的重要中間體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料等方面有著重要的 應(yīng)用價值。如（S)-苯基環(huán)氧乙燒是重要的手性藥物中間體，在抗癌藥與驅(qū)蟲藥levamisole 等的合成上具有重要的應(yīng)用價值；手性苯基-2, 3-環(huán)氧酸乙酯可用于合成紫杉醇；（S)-芳 基縮水甘油醚可用于合成阿替洛爾。手性環(huán)氧化物的合成方法主要有化學(xué)法與生物催化 法。用傳統(tǒng)的化學(xué)法合成具有光學(xué)活性的環(huán)氧化合物和鄰位二醇的反應(yīng)條件較為苛刻，難 以得到高對映體純度的目的產(chǎn)物；而生物合成法是利用來源于動物、植物及微生物的環(huán)氧 化物水解酶（EpoxideHydrotase，EH)催化外消旋環(huán)氧化物立體選擇性水解來制備。與化 學(xué)法相比，生物法具有眾多的優(yōu)點：高效性、高對映選擇性、高區(qū)域選擇性、反應(yīng)條件溫和、 適用范圍廣及環(huán)境友好等。因此，生物法制備手性環(huán)氧化物及其二醇產(chǎn)物成為近年來研宄 的熱點。
[0003] -些具有環(huán)氧化物水解酶活性的菌種，如鞘氨醇單胞菌（Sphingomonassp.)、紅 球菌（Rhodococcussp.)、黑曲霉（Aspergillusniger)等先后被分離。Liu等將黑曲霉的 環(huán)氧化物水解酶基因?qū)氪竽c桿菌中表達并獲得成功，該酶以對硝基氧化苯乙烯為底物， 酶活力達到 104. 5U/mg。Furstoss等發(fā)現(xiàn)A.niger(LCP521)和Beauveriabassiana(ATCC 7159)產(chǎn)生的酶有很高的立體選擇性，并且酶的區(qū)域選擇性相反。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展、 基因序列信息的積累以及基因工程技術(shù)的進步，快速獲得新的EH基因已成為可能，且來源 于真菌A.niger和細菌AgrobacteriumradiobacterADI的E1H分子的微觀結(jié)構(gòu)已通過 x-射線分析，為EH的基因工程研宄提供了條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種宇佐美曲霉（Aspergillususamii)E001新型環(huán)氧化物 水解酶基因序列克隆，環(huán)氧化物水解酶工程菌的構(gòu)建以及重組環(huán)氧化物水解酶的異源表達 和活性測定的方法。來源于A.usamiiE001的一種新型環(huán)氧化物水解酶，命名為AuE：Hl，其 相應(yīng)的基因命名為Auehl。AuEHl具有較高的催化活性和手性選擇性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn) 和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟價值。
[0005] A.usamiiE001菌株的新型Auehl基因的核苷酸序列為SEQIDNO: 1。由cDNA序 列推導(dǎo)的AuEHl氨基酸序列為SEQIDNO: 2。
[0006] 重組AuHll的活性測定方法：在1. 5mL的EP管中加入100yL酶液和800yL 磷酸鹽緩沖液（pH= 6. 8)，35°C預(yù)熱2min;加入100yL200mM的環(huán)氧苯乙燒（styrene oxide,SO)并立即計時，準確反應(yīng)30min后，取200yL反應(yīng)液加入800yL乙酸乙酯中混勻， lOOOOr/min離心5min后，取上層于新的EP管中，加入適量無水MgS04，進行手性氣相色譜 分析。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘消耗1Umol外消旋環(huán)氧苯乙烷所需的 酶量定義為1個環(huán)氧化物水解酶活性單位（U)。
[0007] AuEHl成熟肽cDNA序列的克隆和表達方法：
[0008] (1)根據(jù)菌株同源性高的黑曲霉（Aspergillusniger)M200的環(huán)氧化物水解酶基 因序列，設(shè)計一對特異性引物，引物序列如下：
[0009]AuEHl-F：5, -CATATGTCTGCTCCGTTCGGCAAG-3'，含NdeI酶切位點。
[0010]AuEHl-R：5, -GCGGCCGCCTACTTCTGCCACACCTGCTC-3'，含NotI酶切位點。
[0011] 按照TaKaRaRNAPCRKit(Ver. 3. 0)使用說明書進行RT-PCR。以O(shè)ligo dT-AdaptorPrimer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以AuE；Hl-F和M13PrimerM4 為引物進行第一輪PCR擴增；以AuHll-F和AuHll-R為引物進行第二輪PCR擴增。將PCR產(chǎn) 物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連接（pUCm-T-Auehl)， 轉(zhuǎn)化入E.coliJM109中，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后送上海生工測序。
[0012] (2)將測序結(jié)果正確的pUCm-T-Auehl與pET-28a(+)質(zhì)粒均用NdeI和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒 pET-28a(+)_Auehl(圖1)，并對重組質(zhì)粒進行序列測定。
[0013] (3)E.coliBL21 (DE3)/Auehl的構(gòu)建、表達及活性測定：將pET-28a(+)-Auehl轉(zhuǎn) 化入E.coliBL21 (DE3)中，經(jīng)含有Kan的抗性平板篩選后，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于2mL含Kan 的抗性LB液體培養(yǎng)基中，37°C220r/min搖床振蕩培養(yǎng)14?16h。按1 %的接種量轉(zhuǎn)接于 30mL相同培養(yǎng)基中，37°C220r/min搖床振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（0D6QQ= 0. 6?0. 8)，加 入IPTG至終濃度為150yM，16°C220r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)10h。對照組分別用僅含空pET-28a(+) 和無IPTG的工程菌在相同條件下培養(yǎng)。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體并用磷酸鹽緩沖液（pH =6. 8)洗滌數(shù)次，利用手性氣相色譜測定AuEHl活性。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種A.usamiiE001菌株新型環(huán)氧化物水解酶 基因序列克隆，環(huán)氧化物水解酶工程菌的構(gòu)建以及重組環(huán)氧化物水解酶的異源表達和活性 測定的方法，并對序列進行生物信息學(xué)分析。來源于A.usamiiE001的一種新型環(huán)氧化物 水解酶，命名為AuHll，其相應(yīng)的基因命名為Auehl。AuHll具有較高的催化活性和手性選擇 性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟價值。
【附圖說明】
[0015] 圖1 :重組質(zhì)粒pET-28a(+)_Auehl的構(gòu)建示意圖
【具體實施方式】
[0016] 以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0017] 實施例lAuffil成熟肽cDNA序列的克隆
[0018] 提取A.usamiiE001 的總RNA，按照TaKaRaRNAPCRKit(Ver. 3.0)使用說明 書進行RT-PCR。以O(shè)ligodT-AdaptorPrimer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條 鏈。以AuHll-F和M13PrimerM4為引物進行第一輪PCR擴增，PCR條件為：94°C5min; 94°C30s，51°C30s，72°C2min，30 個循環(huán)；72°ClOmin。以AuHll-F和AuHll-R為引物進行 第二輪PCR擴增，PCR條件為：94°C4min;94°C30s，56°C30s，72°Clmin30s，30 個循環(huán)； 72°ClOmin。將PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體 連接（pUCm-T-Auehl)，轉(zhuǎn)化入E.coliJM109中，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后送上海生工測序，得 到AuEHl成熟肽cDNA序列。
[0019] 實施例2AuHll成熟肽基因在E.coliBL21 (DE3)中的表達
[0020] 將測序結(jié)果正確的pUCm-T-Auehl與pET-28a(+)質(zhì)粒均用NdeI和NotI 進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒 pET_28a(+)-Aueh1，并對重組質(zhì)粒進行序列測定。將pET_28a(+)-Aueh1轉(zhuǎn)化入E.coli BL21 (DE3)中，經(jīng)含有Kan的抗性平板篩選后，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于2mL含Kan的抗性LB液 體培養(yǎng)基中，37°C215r/min搖床振蕩培養(yǎng)14?16h。按1%的接種量轉(zhuǎn)接于30mL相同培 養(yǎng)基中，37°C215r/min搖床振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（0D6QQ= 0. 6?0. 8)，加入IPTG至終 濃度為150yM，16°C215r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)10h。對照組分別用僅含空pET-28a(+)和無IPTG 的工程菌在相同條件下培養(yǎng)。以20mM消旋體環(huán)氧苯乙烷為底物催化，重組AuEHl全細胞催 化，獲得（S) -SO的對映體過量率ee>94% 〇
【主權(quán)項】
1. 一種源自宇佐美曲霉（Aspergillus usamii)E001菌株的新型環(huán)氧化物水解酶基因 (Auehl)，其核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
2. 由權(quán)利要求1所述的環(huán)氧化物水解酶基因（Auehl)編碼的新型環(huán)氧化物水解酶 (AuEHl)，其完整的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。 3. AuEHl成熟肽cDNA序列的克隆： 根據(jù)同源性高的黑曲霉（Aspergillus niger)M200環(huán)氧化物水解酶基因序列，設(shè) 對特異性引物，引物序列如下： AuEHA-F:5'-CATATGTCTGCTCCGITCGGCAAG-3'，含 Nde I 酶切位點 AuEHA-R:5'-GCGGCCGCCTACTTCTGCCACACCTGCTC-3'，含 Not I 酶切位點 提取 A. usamii E001 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)使用說明書進行 RT-PCR ;以O(shè)ligo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以AuEHl-F 和M13Primer M4為引物進行第一輪PCR擴增；以AuHll-F和AuHll-R為引物進行第二輪 PCR擴增；將PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連 接（pUCm-T-AuehA)，轉(zhuǎn)化入E. coli JM109中，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后送上海生工測序，得到 AuEHl成熟肽cDNA序列。 4. AuEHl成熟肽基因在E. coli BL21 (DE3)中的表達： 將測序結(jié)果正確的pUCm-T-Auehl與pET-28a(+)質(zhì)粒均用Nde I和Not I進 行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒 pET_28a (+) -Aueh 1，并對重組質(zhì)粒進行序列測定；將pET_28a (+) -Aueh 1轉(zhuǎn)化入E.coli BL21 (DE3)中，經(jīng)含有Kan的抗性平板篩選后，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于2mL含Kan的抗性LB液 體培養(yǎng)基中，37°C 220r/min搖床振蕩培養(yǎng)14?16h ;按1 %的接種量轉(zhuǎn)接于30mL相同培養(yǎng) 基中，37 °C 220r/min搖床振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（0D6QQ = 0. 6?0. 8)，加入IPTG至終濃 度為150 yM，16°C 215r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)10h，對照組分別用僅含空pET-28a(+)和無IPTG的 工程菌在相同條件下培養(yǎng)；以20mM消旋體環(huán)氧苯乙烷為底物，重組AuEHl工程菌全細胞催 化，獲得（S) -SO的對映體過量率ee>94% 〇
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一種環(huán)氧化物水解酶cDNA基因序列的克隆方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1，命名為Aueh1，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2，該酶命名為AuEH1。本發(fā)明還公開了AuEH1工程菌的構(gòu)建以及重組AuEH1的異源表達和活性測定的方法。以20mM消旋體環(huán)氧苯乙烷為底物，重組AuEH1工程菌全細胞催化，獲得(S)-SO的對映體過量率ee>94％。AuEH1具有較高的催化活性和手性選擇性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟價值。
【IPC分類】C12N15-55, C12P17-02, C12N9-14, C12N15-10, C12N15-70
【公開號】CN104531728
【申請?zhí)枴緾N201410755394
【發(fā)明人】鄔敏辰, 李興倩, 胡蝶, 李劍芳, 余濤, 朱利娟
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月10日