從組分Ⅲ沉淀純化人免疫球蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備人免疫球蛋白的方法，更具體的說(shuō)涉及一種從組分III沉淀純化人免疫球蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]低溫乙醇法是人血漿蛋白的制備方法之一，該方法是1940年由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Edwin J.Cohn教授發(fā)明的，因此又稱為“孔氏法”?？资戏ㄗ畛跤脕?lái)分離牛血清白蛋白，隨后應(yīng)用于人血漿分離。低溫乙醇法是以混合血漿為原料，逐級(jí)降低酸度(從PH7.0降到PH4.0)。提高乙醇濃度(從O升到40% )，同時(shí)降低溫度(從2V降到-2V )，各種蛋白在不同的條件下以組分(粗制品)的形式分步從溶液中析出，并通過(guò)離心或者過(guò)濾分離出來(lái)。現(xiàn)有的制備方法是提取組分II來(lái)獲得人免疫球蛋白，組分III卻按照廢料進(jìn)行處理，從而浪費(fèi)了組分III中含有的人免疫球蛋白。找到一種從組分III沉淀純化人免疫球蛋白的方法對(duì)提高血漿綜合利用率，提高人免疫球蛋白的收率具有積極意義，能夠一定程度地緩解國(guó)內(nèi)血漿供應(yīng)緊張的局面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種從組分III沉淀純化人免疫球蛋白的方法，以實(shí)現(xiàn)從組分III沉淀中提取人免疫球蛋白，從而提高人免疫球蛋白的收率。
[0004]本發(fā)明所述從組分III沉淀純化人免疫球蛋白的方法，主要包括以下步驟:
[0005]步驟一、取組分III沉淀，溶解組分III沉淀，得組分III溶液；
[0006]步驟二、取組分III溶液，過(guò)濾組分III溶液，得組分III上清液；
[0007]步驟三、取組分III上清液，進(jìn)行一次乙醇沉淀，得一次乙醇沉淀上清液；
[0008]步驟四、取一次乙醇沉淀上清液，進(jìn)行二次乙醇沉淀，得二次乙醇沉淀；
[0009]步驟五、二次乙醇沉淀超濾脫醇；
[0010]步驟六、巴氏滅活；
[0011]步驟七、三次乙醇沉淀分離，得三次乙醇沉淀上清液；
[0012]步驟八、四次乙醇沉淀分離:將三次乙醇沉淀上清液溫度控制至-1?-3°c，調(diào)節(jié)pH值至7.10?7.40，乙醇濃度至體積百分比為25?27%，控制溶液溫度至-6?-12°C，調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為1.60?1.80ms/cm，攪拌反應(yīng)I?3小時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.9 μπι的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至_3°C以下，過(guò)濾分離出四次乙醇沉淀；
[0013]步驟九、四次乙醇沉淀超濾脫醇:取重量為上述四次乙醇沉淀5?10倍、溫度為2?8°C的注射用水將四次乙醇沉淀完全溶解，采用二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，同時(shí)調(diào)節(jié)pH值至3.40?3.80，超濾脫醇后再調(diào)節(jié)pH值至3.8?4.4 ;
[0014]步驟十、將步驟九所得四次乙醇沉淀溶液按成品規(guī)格配制，使蛋白質(zhì)含量不低于50g/L，加入麥芽糖，使麥芽糖含量為90?110g/L，加入聚山梨酯-80，使聚山梨酯-80含量不大于80 μ g/ml，調(diào)節(jié)pH調(diào)至3.8?4.4，配制完成后，進(jìn)行除菌過(guò)濾分裝。
[0015]所述步驟一是，將組分III沉淀室溫下放置12?24小時(shí)，放入到重量為3?5倍、溫度為10?15°C、濃度為0.85%的氯化鈉溶液中，溶解6?8小時(shí)。
[0016]所述步驟二是，選用孔徑不超過(guò)0.6 μπι的深層濾板，2?8°C注射用水循環(huán)平衡壓濾機(jī)，進(jìn)行組分III溶液過(guò)濾，收集過(guò)濾上清液。
[0017]所述步驟三是，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.1?5.3，控制溫度至1.0?3.0°C，攪拌反應(yīng)I?4小時(shí)，噴霧式滴加-15°C以下95%乙醇，使制品中乙醇含量為12?14%，同步降溫至-2.0?-4.00C，攪拌反應(yīng)I?4小時(shí)，按照每16Kg蛋白添加I?3Kg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，攪拌反應(yīng)I?4小時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.6 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至_1°C以下，進(jìn)行一次乙醇沉淀過(guò)濾，得一次乙醇沉淀上清液。
[0018]所述步驟四是，調(diào)節(jié)一次乙醇沉淀上清液的電導(dǎo)率5.0?7.0ms/cm, pH至7.0?
7.3，乙醇濃度至體積百分比為25?27%，控制溶液溫度至-8.0?-10.0°C，攪拌反應(yīng)I?4小時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-3V以下，過(guò)濾分離出二次乙醇沉淀。
[0019]所述步驟五是，取重量為二次乙醇沉淀8?10倍、溫度為2?8°C的注射用水將使二次乙醇沉淀完全溶解，采用二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，同時(shí)調(diào)節(jié)pH值至4.4?4.6，進(jìn)行超濾脫醇。
[0020]所述步驟六是，將超濾脫醇后的溶液用注射用水調(diào)節(jié)蛋白含量至17?23g/L，按60?120g/L加入甘氨酸，調(diào)節(jié)pH值至7.1?7.4，在60.0 ±0.5°C的溫度下加溫9?11小時(shí)巴氏滅活后，降溫至8?15°C。
[0021]所述步驟七是，用注射用水調(diào)節(jié)巴氏滅活后的溶液，使溶液中蛋白質(zhì)含量為5.0?15.0g/L，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5?7.0，控制溫度至O?2°C，調(diào)節(jié)乙醇濃度至體積百分比18?20%，控制溫度至2?6°C，調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為1.20?1.50ms/cm，攪拌反應(yīng)I?3小時(shí)，按每千克蛋白質(zhì)0.08?0.12kg比例分別添加等量的珍珠巖和娃藻土，繼續(xù)反應(yīng)0.5?1.5小時(shí)后，選用孔徑不超過(guò)0.9 μπι的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至5°C以下，過(guò)濾分離出三次乙醇沉淀，得三次乙醇沉淀上清液。
[0022]本發(fā)明所述從組分III沉淀純化人免疫球蛋白的方法，組分III沉淀溶解后采用預(yù)過(guò)濾，可將該組分沉淀中的大量的助濾物質(zhì)去除，避免在一次乙醇制作共沉。此外，通過(guò)控制壓濾機(jī)的溫度避免了制品壓濾過(guò)程升溫而導(dǎo)致蛋白變性，在沉淀分離工藝采用了適當(dāng)?shù)碾妼?dǎo)率，提高了免疫球蛋白的收率，使人免疫球蛋白收率7 %以上，生產(chǎn)的人免疫球蛋白分子大小分布多99.5%以上。在對(duì)免疫球蛋白純化精制時(shí)，進(jìn)行了四次乙醇沉淀分離，分離采用了二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，去除了制品中的不溶性顆粒，提高了制品的澄清度。在人免疫球蛋白超濾前后分別進(jìn)行溶液的PH控制，減少和去除人免疫球蛋白中的抗補(bǔ)體活性，提高了人免疫球蛋白的有效性。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為了進(jìn)一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面通過(guò)結(jié)合附圖來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。
[0025]實(shí)施例一、
[0026]參見(jiàn)圖1，本發(fā)明所述從組分III沉淀純化人免疫球蛋白的方法，主要包括以下步驟:
[0027]步驟一、取組分III沉淀，將組分III沉淀室溫下放置12小時(shí)，放入到重量為3倍、溫度為10°C、濃度為0.85%的氯化鈉溶液中，溶解6小時(shí)，溶解組分III沉淀，得組分III溶液。
[0028]步驟二、取組分III溶液，選用孔徑不超過(guò)0.6 μπι的深層濾板，2°C注射用水循環(huán)平衡壓濾機(jī)，進(jìn)行組分III溶液過(guò)濾，收集過(guò)濾上清液。
[0029]步驟三、取組分III上清液，進(jìn)行一次乙醇沉淀:
[0030]用0.5mol/L醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.1，控制溫度至1.0°C，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，噴霧式滴加_15°C以下95%乙醇，使制品中乙醇含量為12%，同步降溫至-2.00C，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，按照每16Kg蛋白添加IKg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.6 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-10C以下，進(jìn)行一次乙醇沉淀過(guò)濾，得一次乙醇沉淀上清液。
[0031]步驟四、取一次乙醇沉淀上清液，進(jìn)行二次乙醇沉淀:
[0032]用3g/L的氯化鈉調(diào)節(jié)一次乙醇沉淀上清液的電導(dǎo)率5.0ms/cm,用0.5mol/L氫氧化鈉溶液PH至7.0，乙醇濃度至體積百分比為25%，控制溶液溫度至-8.(TC，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.9 μπι的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-3°C以下，過(guò)濾分離出二次乙醇沉淀。
[0033]步驟五、二次乙醇沉淀超濾脫醇:取重量為二次乙醇沉淀8倍、溫度為2°C的注射用水將使二次乙醇沉淀完全溶解，采用二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，同時(shí)調(diào)節(jié)PH值至4.4，進(jìn)行超濾脫醇。
[0034]步驟六、巴氏滅活:將超濾脫醇后的溶液用注射用水調(diào)節(jié)蛋白含量至17g/L，按60g/L加入甘氨酸，調(diào)節(jié)pH值至7.1，在59.5°C的溫度下加溫9小時(shí)巴氏滅活后，降溫至8V。
[0035]步驟七、三次乙醇沉淀分離:用注射用水調(diào)節(jié)巴氏滅活后的溶液，使溶液中蛋白質(zhì)含量為5.0g/L，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5，控制溫度至0°C，調(diào)節(jié)乙醇濃度至體積百分比18%，控制溫度至2°C，用氯化鈉或注射用水調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為1.20mS/cm，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，按每千克蛋白質(zhì)0.08kg比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，繼續(xù)反應(yīng)0.5小時(shí)后，選用孔徑不超過(guò)0.9 μπι的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至5°C以下，過(guò)濾分離出三次乙醇沉淀，得三次乙醇沉淀上清液。
[0036]步驟八、四次乙醇沉淀分離:將三次乙醇沉淀上清液溫度控制至-1°C，調(diào)節(jié)pH值至7.10，乙醇濃度至體積百分比為25%，控制溶液溫度至-6°C，用氯化鈉或注射用水調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為1.60mS/Cm，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.9 μπι的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至_3°C以下，過(guò)濾分離出四次乙醇沉淀；
[0037]步驟九、四次乙醇沉淀超濾脫醇:取重量為上述四次乙醇沉淀5倍、溫度為2°C的注射用水將四次乙醇沉淀完全溶解，采用二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，同時(shí)調(diào)節(jié)PH值至3.40，超濾脫醇后再調(diào)節(jié)pH值至3.8。
[0038]步驟十、將步驟九所得四次乙醇沉淀溶液按成品規(guī)格配制，使蛋白質(zhì)含量不低于50g/L，加入麥芽糖，使麥芽糖含量為90g/L，加入聚山梨酯-80，使聚山梨酯-80含量不大于80 μ g/ml，調(diào)節(jié)pH調(diào)至3.8，配制完成后，進(jìn)行除菌過(guò)濾分裝。
[0039]分裝后的制品送檢、燈檢，分裝后的制品放置在孵放室，制品在pH3.8、溫度為23°C下孵放至少24天，放孵后制品逐瓶進(jìn)行外觀及可見(jiàn)異物檢查，燈檢合格后包裝、入庫(kù)。
[0040]實(shí)施例二、
[0041]參見(jiàn)圖1，本發(fā)明所述從組分III沉淀純化人免疫球蛋白的方法，主要包括以下步驟:
[0042]步驟一、取組分III沉淀，將組分III沉淀室溫下放置18小時(shí)，放入到重量為4倍、溫度為12.5°C、濃度為0.85%的氯化鈉溶液中，溶解7小時(shí)，溶解組分III沉淀，得組分III溶液。
[0043]步驟二、取組分III溶液，選用孔徑不超過(guò)0.6 μπι的深層濾板，5°C注射用水循環(huán)平衡壓濾機(jī)，進(jìn)行組分III溶液過(guò)濾，收集過(guò)濾上清液。
[0044]步驟三、取組分III上清液，進(jìn)行一次乙醇沉淀:
[0045]用0.5mol/L醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至5.2，控制溫度至2.0°C，攪拌反應(yīng)2.5小時(shí)，噴霧式滴加_15°C以下95%乙醇，使制品中乙醇含量為13%，同步降溫至-3.0°C，攪拌反應(yīng)2.5小時(shí)，按照每16Kg蛋白添加2Kg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，攪拌反應(yīng)2.5小時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.6 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-10C以下，進(jìn)行一次乙醇沉淀過(guò)濾，得一次乙醇沉淀上清液。
[0046]步驟四、取一次乙醇沉淀上清液，進(jìn)行二次乙醇沉淀:
[0047]用4g/L的氯化鈉調(diào)節(jié)一次乙醇沉淀上清液的電導(dǎo)率6.0ms/cm,用0.5mol/L氫氧化鈉溶液