一種產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL活菌制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域的乳酸菌活菌制劑的制備方法，屬于微生物應(yīng)用領(lǐng) 域，可用于家禽畜牧業(yè)中飼用活菌制劑等微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌。乳酸菌能夠?qū)⑻妓衔锇l(fā)酵成乳酸， 因而得名。將益生乳酸菌添加到食品中不僅可以提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，而且具有保健作用， 如促進(jìn)蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，產(chǎn)生維生素 B族等大量有益物質(zhì)，改善人體腸道功能，恢 復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡，增強(qiáng)人體免疫力，抗腫瘤、抗衰老，還具有降膽固醇、降血脂、降血 壓等作用。目前市場(chǎng)上的乳酸菌制品主要包括酸乳，酸乳飲料，活菌制劑等。
[0003] 本專利涉及的一株產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL菌株，經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí) 其不僅對(duì)單增李斯特氏菌有很好的抑菌效果，而且耐受胃腸逆環(huán)境（耐受膽汁和胃酸），因 此可以順利通過胃腸定殖于腸道中產(chǎn)生細(xì)菌素和乳酸，具有抑制某些腐敗菌和致病菌的作 用。本專利將該菌株制備成活菌制劑作為生物添加劑應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖業(yè)，可以達(dá)到預(yù)防家 禽腸道疾病的目的。
[0004] 目前，國內(nèi)專利有關(guān)各種活菌制劑的制備方法較多，例如北京市農(nóng)林科學(xué)院 季海峰和蘇布敦格日樂申請(qǐng)的"一種豬源植物乳桿菌植物亞種凍干制劑及其制備方 法"（CN200910082441.X)是植物乳桿菌植物亞種經(jīng)擴(kuò)培、離心、加入保護(hù)劑、真空干燥， 獲得高存活率的植物乳桿菌植物亞種菌粉；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)于長(zhǎng)青、錢麗麗和姚笛 申請(qǐng)的"含有活性物質(zhì)的植物乳桿菌活菌制劑及其制備方法"（CN201010283999. 7)是 在植物乳桿菌活菌粉中加入低聚糖，制備一種可在溫室穩(wěn)定存放的活菌制劑；上海環(huán)偉 生物科技有限公司張琴和陳建呂申請(qǐng)的"一種復(fù)合微生物活菌制劑及其制備方法和應(yīng) 用"（ZL200810034746)是一種片球菌、酵母菌和芽孢桿菌復(fù)合微生物活菌制劑。但關(guān)于利 用產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL制備活菌制劑，并利用油菜籽蛋白胨作為替代 氮源，馬鈴薯漿作為基質(zhì)保存生物制劑中活菌的方法國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL活菌制劑的 制備方法。
[0006] 所述方法中，植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)Zhang-LL，已于2012年12月04日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研宄所）， 其保藏號(hào)為：CGMCC No. 6936。在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，菌株Zhang-LL菌體呈短桿狀， 0. 5X1. 33?2. 0 μ m，單個(gè)，成對(duì)或呈短鏈狀排列，不生芽孢，革蘭氏陽性。
[0007] 所述方法中，植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL活化2?3代后，將活化好的菌液以 2% (V/V，體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至改良MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h，獲得的培養(yǎng)液 備用。
[0008] 上述方法中，改良MRS液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母浸粉 5. 〇g，檸檬酸三銨2. 0g，葡萄糖20. 0g，吐溫801. OmL，乙酸鈉 5. 0g，磷酸氫二鉀2. 0g，硫酸鎂 〇.58，硫酸錳0.258，水比，？?jī)?cè).5，121°〇滅菌151^11
[0009] 所述方法中，植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL發(fā)酵培養(yǎng)基是在改良MRS培養(yǎng)基的基 礎(chǔ)上進(jìn)行氮源的替代及優(yōu)化的。培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化采用單因素多水平和四因素三水平 [L 9(34)]正交試驗(yàn)，以測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)為指標(biāo)，分析并確定了高活菌數(shù)發(fā)酵液的優(yōu)化的培 養(yǎng)基和發(fā)酵條件。最終確定氮源（501油菜籽蛋白胨）含量3.0%、發(fā)酵溫度34°C、發(fā)酵液 pH 6. 5、發(fā)酵接種量7%為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件。優(yōu)化的植物乳桿菌植物亞種的發(fā)酵培養(yǎng)基 501油菜籽蛋白胨改良MRS培養(yǎng)基由以下成分組成：501油菜籽蛋白胨30. 0g/L，朽1檬 酸三銨2. 0g/L，葡萄糖20. 0g/L，吐溫801. 0mL/L，乙酸鈉 5. 0g/L，磷酸氫二鉀2. 0g/L，硫酸 鎂 0· 5g/L，硫酸錳 0· 25g/L，ρΗ6· 5,121°C 滅菌 15min。
[0010] 所述方法中，應(yīng)用上述優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)條件，利用5L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行高密度 發(fā)酵，將Zhang-LL菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)液按7% (V/V，體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至發(fā)酵罐中，利 用發(fā)酵罐自動(dòng)控溫系統(tǒng)保證發(fā)酵溫度為34°C，發(fā)酵過程中以流加15% (V/V，質(zhì)量體積比濃 度）的滅菌似20)3溶液控制發(fā)酵液pH為6. 5,轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下發(fā)酵16h，獲得發(fā) 酵液。
[0011] 上述方法中，5L全自動(dòng)發(fā)酵罐由上海高機(jī)生物工程有限公司生產(chǎn)，其型號(hào)為 BI0F6005GBN。
[0012] 所述方法中，將5L發(fā)酵罐中的發(fā)酵液在4°C條件下，8000r/min離心10min，收集菌 泥。
[0013] 所述方法中，將收集得到的植物乳桿菌植物亞種菌泥與1/10原發(fā)酵液體積的馬 鈴薯漿混合，采用單因素多水平試驗(yàn)，確定植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL的凍干保護(hù)劑組 合配方為（V/V，質(zhì)量體積比濃度）：3%脫脂乳+2%谷氨酸鈉，混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵 劑。
[0014] 上述方法中，馬鈴薯漿是由新鮮的馬鈴薯去皮、切塊、經(jīng)九陽牌食物料理機(jī)打漿制 成的。
[0015] 所述方法中將濃縮發(fā)酵劑在-35°c冰箱中預(yù)凍13h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍發(fā) 酵劑，利用真空冷凍干燥機(jī)將預(yù)凍發(fā)酵劑于凍干溫度_55°C、真空度0. OSmBar的條件下，凍 干48h至完全干燥狀態(tài)，得到凍干發(fā)酵劑。
[0016] 所述方法中，經(jīng)過菌落計(jì)數(shù)，所得到的植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL發(fā)酵液活菌 數(shù)可達(dá)10 1(lCFU/mL以上，凍干活菌制劑的活菌數(shù)可達(dá)10nCFU/g以上，菌株的存活率達(dá)到 60%以上。此種活菌制劑利用油菜籽蛋白胨全部替代改良MRS培養(yǎng)基配方中的氮源，即替 代了改良MRS培養(yǎng)基中的胰蛋白胨、牛肉膏及酵母浸粉，不僅降低了培養(yǎng)基的成本，而且還 明顯增加了發(fā)酵液乳酸菌的活菌數(shù)量。因此，利用馬鈴薯漿作為保護(hù)基質(zhì)可以進(jìn)一步降低 活菌制劑的成本，為家禽生物飼料添加劑的生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化提供新思路。
[0017] 上述方法得到的產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL活菌制劑的制備方法及 其活菌制劑產(chǎn)品，以及專利菌種屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0019] 下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為重量對(duì)體積的百分含量。
[0020] 實(shí)施例1、植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL活菌制劑及其制備方法
[0021 ] 1、確定植物乳桿菌植物亞種低成本發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源
[0022] 在發(fā)酵溫度37°C、發(fā)酵液接種量2 %、發(fā)酵時(shí)間16h、發(fā)酵液pH 6. 5的條件下，選取 發(fā)酵培養(yǎng)基為改良MRS培養(yǎng)基，分別用501油菜籽蛋白胨、502油菜籽蛋白胨、503油菜籽蛋 白胨替代改良MRS中的氮源，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定不同發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液中Zhang-LL菌株 的活菌數(shù)量，以確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源種類，試驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0023] 表1氮源種類對(duì)發(fā)酵液Zhang-LL菌株活菌數(shù)的影響
[0024]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang_LL CGMCC No. 6936〇
2. -種利用產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL制備活菌制劑的方法，其特征 在于：植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL 油 菜籽蛋白胨改良MRS發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成：501油菜籽蛋白胨30. Og/L，檸檬酸三 銨2. Og/L，葡萄糖20. Og/L，吐溫801. OmL/L，乙酸鈉5. Og/L，磷酸氫二鉀2. Og/L，硫酸鎂 〇. 5g/L，硫酸錳0. 25g/L ;將植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL擴(kuò)大培養(yǎng)液按7 %接種量移種 至油菜籽蛋白胨改良MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用5L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，控制發(fā) 酵溫度34°C，發(fā)酵液pH 6. 5,攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵16h，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液于4°C、 8000r/min離心10min，收集得到菌泥；將菌泥與1/10原發(fā)酵液體積的馬鈴薯漿混合，再 加入3%脫脂乳和2%谷氨酸鈉作為凍干保護(hù)劑，混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵劑；將濃縮發(fā) 酵劑于-35°C冰箱中預(yù)凍13h后，利用真空冷凍干燥機(jī)將預(yù)凍活菌制劑于-55°C、真空度 0. 08mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，獲得植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL活菌制 劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL活菌制劑的制備方法，屬于微生物應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明利用植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillus？plantarum？subsp.plantarum)Zhang-LL？CGMCC？No.6936菌株，經(jīng)過活化、擴(kuò)大培養(yǎng)、高密度發(fā)酵、離心、凍干保護(hù)劑的添加、預(yù)凍及冷凍干燥等工序制備活菌制劑。本發(fā)明首先選取油菜籽蛋白胨作為替代氮源，降低培養(yǎng)基成本的同時(shí)，優(yōu)化了植物乳桿菌的培養(yǎng)條件，并利用5L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，在優(yōu)化后的低成本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)1010CFU/mL以上。本發(fā)明利用馬鈴薯漿作為凍干保護(hù)劑基質(zhì)，確定凍干保護(hù)劑較優(yōu)組合配方，使植物乳桿菌植物亞種Zhang-LL存活率達(dá)到60％以上，活菌量可達(dá)1011CFU/g以上。本發(fā)明制備的活菌制劑原料價(jià)格低廉，活菌含量較高，可為家禽新型飼料添加劑的開發(fā)提供良好的基礎(chǔ)，提供重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。CGMCC No.693620121204
【IPC分類】C12R1-25, C12N1-20, A23K1-17, A23K1-18
【公開號(hào)】CN104560799
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410816266
【發(fā)明人】張紅星, 劉慧 , 謝遠(yuǎn)紅, 于立娟, 金君華, 段慧霞, 熊利霞, 高秀芝
【申請(qǐng)人】北京北農(nóng)紅澤生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月25日