0101)保藏，分類命名 為 Bacillus licheniformis，保藏號(hào)為 CGMCC No. 9679。
[0038] 實(shí)施例2菌株UTM108木聚糖脫乙?；富钚詸z測(cè)及其基因序列
[0039] 取UTM108菌液100ml(牛肉膏5g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、半纖維 素5g、可溶性淀粉15g、蒸餾水1000ml，pH7. 2,40°C培養(yǎng)2天）離心（6000轉(zhuǎn)/分鐘10分 鐘）收集菌體。菌體置于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4)中，用超聲波破碎儀（600W)，工作時(shí)間5 秒，間隔時(shí)間5秒，連續(xù)20次進(jìn)行細(xì)胞破碎。離心（7500轉(zhuǎn)/分鐘、10分鐘）獲得上清液， 即獲得粗酶液。
[0040] 木聚糖脫乙?；富钚詼y(cè)定以對(duì)硝基苯酚醋酸酯為底物，反應(yīng)混合物含500 μ 1 對(duì)硝基苯酷醋酸醋（5%懸浮于50mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7. 0)，450 μ1 50mmol/L磷酸鈉 緩沖液（pH 7. 0)以及50 μ 1的從UTM108的粗酶液。上述混合物置于恒溫?fù)u床，150轉(zhuǎn)/分 鐘，37°C反應(yīng)1小時(shí)后，在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定對(duì)硝基苯酚的含量，以確定木聚糖脫乙?；?活性的大小。反應(yīng)重復(fù)3次，取平均值。測(cè)得UTM108菌株的木聚糖脫乙?；富钚詾?2. 3 個(gè)活力單位。
[0041] 根據(jù)木聚糖脫乙?；富蛟O(shè)計(jì)的引物axe-f:5'-GTG GCA TAT CAA ACG G-3' 和axe-r:5'-TTC GCT GAC TGT TAC G-3'，并以本發(fā)明菌株UTM108DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，53°C退火45秒，72°C延伸60 秒，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，通過電泳檢測(cè)得到約0. 7kb大小的核苷酸片段，測(cè)序并將 在NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，獲得該序列片段編碼木聚糖脫乙 ?；富颍浠蛐蛄幸娦蛄斜鞸EQ ID No. 3。
[0042] 實(shí)施例3菌株UTM108 a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性檢測(cè)及其相關(guān)基因序列
[0043] 將LB斜面（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g、蒸餾水1000ml， pH7. 2)上的活化的UTM108菌株接種在含木聚糖的培養(yǎng)基（蛋白胨4g、燕麥木聚糖5g、葡 萄糖4g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，pH7. 2)中，40°C振蕩（160轉(zhuǎn)/分鐘）培養(yǎng)兩天，離心 (6000轉(zhuǎn)/分鐘、10分鐘）收集菌體。菌體置于磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)中，用超聲波破碎儀 (功率600W)工作時(shí)間5秒、間隔時(shí)間5秒，連續(xù)20次進(jìn)行細(xì)胞破碎。離心（7500轉(zhuǎn)/分鐘、 10分鐘）得上清液即獲得粗酶液。阿拉伯糖苷酶活性是以底物對(duì)硝基苯-阿拉伯呋喃糖苷 (pNPAF)中釋放對(duì)硝基苯酚（pNP)的量確定的。取待測(cè)酶液10 μ 1加入0. 18ml 0. lmmol/L pH 5. 8的緩沖液中，再加10 μ 1底物，反應(yīng)10分鐘后加入NaCO3O. 6ml (lmol/L)終止反應(yīng)。 用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)405nm測(cè)定其吸光值，測(cè)得UTM108菌株具有a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶 活性。
[0044] 根據(jù)a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因設(shè)計(jì)的引物ara-f:5' -GCG AAG ATG ACG ATT G-3'和 ara-r:5'-AGC TTC GGA AGG TGA G-3'，并以本發(fā)明菌株 UTM108DNA 為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，54°C退火45秒，72°C延 伸90秒，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，通過電泳檢測(cè)得到約I. 5kb大小的核苷酸片段，測(cè)序 并將在NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，獲得該序列片段編碼a-L-阿 拉伯呋喃糖苷酶基因，其基因序列見序列表SEQ ID No. 4。
[0045] 實(shí)施例4菌株UTM108 β -木糖苷酶活性檢測(cè)及其基因序列
[0046] β-木糖苷酶活性測(cè)定反應(yīng)體系為200 μ1，內(nèi)含10μ1 20mmol/L底物對(duì)硝基苯 酚-β -D-木糖苷（pNPX，Sigma)、185 μ I lOOmmol/L pH6. 0的鄰苯二甲酸氫鉀-咪哇緩沖 液、5 μ 1適量濃度的實(shí)施例3中所提取粗酶液。于65°C反應(yīng)5分鐘，然后加入600 μ L Imol/ L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)并顯色，用分光光度計(jì)測(cè)定其在410nm波長(zhǎng)下的吸收值，重復(fù)3 次，取平均值計(jì)算β -木糖苷酶的活性為最終測(cè)定UTM108菌株具有β -木糖苷酶的活性， 其活力約為13. 6個(gè)活力單位。
[0047] 根據(jù)β-木糖苷酶基因保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物xylo-Fl: 5' -ACC GGG ATA TCT CAG G-3'和 xyl〇-Rl:5'-GCA ATA TAG CGG AAC C-3'，并以本發(fā)明菌株 UTM108DNA 為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，53°C退火45秒， 72°C延伸60秒，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，通過電泳檢測(cè)得到約0. 5kb大小的核苷酸片 段，測(cè)序并將在NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，獲得該序列片段編碼 β-木糖苷酶基因，其基因序列見序列表SEQ ID No. 5。
[0048] 實(shí)施例5菌株UTM108液體菌劑及菌粉劑的制備
[0049] 從4°C保存的本發(fā)明菌株UTM108斜面括菌苔接種于含葡萄糖蛋白胨的液體培養(yǎng) 基（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母膏5g、Nacl5g、水1000ml)30ml的250ml三角瓶中，溫度 35-45 °C、轉(zhuǎn)速100?250轉(zhuǎn)/分鐘、培養(yǎng)1?2天為搖瓶種子液。
[0050] 將搖瓶種子液接種至含上述培養(yǎng)基的種子罐中。培養(yǎng)溫度35?45°C、攪拌速度 100?400、通氣量1 :0. 2?0. 5 (v/v)、培養(yǎng)1-2天為種子罐種子液。
[0051] 將種子罐種子液接種至同樣培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量0. 1?1%、培養(yǎng)溫度35? 45°C、攪拌速度60?200、通氣量1 :0. 3?0. 6 (v/v)、培養(yǎng)20?40小時(shí)，當(dāng)OD6tltl彡2,停止 培養(yǎng)，此為發(fā)酵液。
[0052] 發(fā)酵液直接分裝成為液體菌劑，發(fā)酵液脫水干燥得到菌粉劑。
[0053] 實(shí)施例6利用菌株UTM108的菌劑堆肥發(fā)酵處理生活污泥
[0054] 按脫水生活污泥40噸（含水量80. 1 % )、水分調(diào)理劑30噸（含水量32. 4% )混 合，混合物含水量約60%。此物料中添加 UTM108菌劑70升，充分混合拌均后用裝載車移入 發(fā)酵槽中，堆體高度不低于2. 3m。發(fā)酵槽7mX5mX8m，底部設(shè)有通氣管，用400KW鼓風(fēng)機(jī) 不斷供氣并根據(jù)堆體溫度調(diào)節(jié)通氣量。第2天后堆體溫度上升至70?85°C，第5天用裝載 車倒槽一次，此時(shí)溫度會(huì)下降至60?65°C，隨后又上升到90?100°C，最高103?105°C。 當(dāng)溫度上升速度減慢，用裝載車再倒槽一次。一個(gè)發(fā)酵周期倒槽3?4次。當(dāng)?shù)共酆蠖洋w 溫度不再維持高溫，停止供氣，發(fā)酵結(jié)束。此時(shí)物料水分下降至30%左右。表1為經(jīng)上述技 術(shù)處理后的物料檢測(cè)結(jié)果。
[0055] 表1污泥經(jīng)堆肥發(fā)酵后樣品的檢測(cè)結(jié)果（干基）
[0056]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有生物質(zhì)水解酶活性的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)菌株 UTM108，其特征在于，所述菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏日期為2014年9月18日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9679。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于，所述生物質(zhì)水解酶活性為木聚糖脫乙酰 基酶、β -木糖苷酶和a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
3. 用于克隆權(quán)利要求1或2所述菌株16S rRNA的引物，其特征在于，所述引物為： F :5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'; R :5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。
4. 含有權(quán)利要求1或2所述菌株的菌劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑的制備方法為： 1) 將權(quán)利要求1或2所述菌株接種于培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液； 2) 將發(fā)酵液直接分裝成為液體菌劑，或?qū)l(fā)酵液經(jīng)脫水干燥得到菌粉劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于，所述步驟1)具體為： 將權(quán)利要求1或2所述菌株接種于培養(yǎng)基中，35-45°C溫度下，100?250轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶 培養(yǎng)1?2天得到搖瓶種子液； 將搖瓶種子液接種至含上述培養(yǎng)基的種子罐中，接種量〇. 1?1%，35?45°C溫度下， 100?400轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量1 2?0. 5 (v/v)，培養(yǎng)1-2天得到種子罐種子液； 將種子罐種子液接種至含上述培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量〇. 1?1%、35?45°C溫度下， 60?200轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量1 :0· 3?0· 6 (v/v)，培養(yǎng)20?40小時(shí)，當(dāng)0D600彡2時(shí)，停止 培養(yǎng)，即得發(fā)酵液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含葡萄糖蛋白胨的液體培 養(yǎng)基，包括：葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母膏5g、NaCl 5g、水1000ml。
8. 權(quán)利要求1或2所述菌株或權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述菌劑在城鄉(xiāng)有機(jī)固體廢棄物堆 肥發(fā)酵和生產(chǎn)環(huán)保型生物肥料中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)固體廢棄物包括城市生活污水 廠的下水污泥、生活垃圾、餐廚垃圾、動(dòng)物尸體或畜禽糞便，碳氮比為10?50:1、含水量為 45%?65%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用具體為： 1) 將相當(dāng)于總物料濕重〇. 1%?1%的菌劑接種于有機(jī)固體廢棄物中，同時(shí)加入水分 調(diào)理劑；混合拌勻后移入發(fā)酵槽中進(jìn)行通氣好氧發(fā)酵，保持氧氣含量為8%?15%，間隔 3?5天翻堆1次； 2) 堆體好氧發(fā)酵15?30天后，大部分有機(jī)物被降解，水分降低，剩余物料或填埋或焚 燒或過篩得到生物肥料。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有生物質(zhì)水解酶活性的地衣芽孢桿菌菌株UTM108，所述菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2014年9月18日，保藏編號(hào)為CGMCC？No.9679。本發(fā)明菌株UTM108可以利用城市污水廠的下水污泥、生活垃圾、餐廚垃圾、動(dòng)物尸體、畜禽糞便、農(nóng)作物秸桿和某些行業(yè)產(chǎn)生的有機(jī)固體廢棄物如中藥藥渣、非危廢菌渣、食品工業(yè)廢棄物等進(jìn)行高溫發(fā)酵降解，以治理有機(jī)固廢物料的污染，并且通過UTM108菌株堆肥發(fā)酵還可以制備環(huán)保型生物肥料，性能優(yōu)良，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。CGMCC No. 967920140918
【IPC分類】C12R1-10, C05F15-00, C05F7-00, C12N15-11, C12N1-20, C05F17-00
【公開號(hào)】CN104560816
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410842649
【發(fā)明人】劉永躍, 何璧梅, 許宜北, 汪涌
【申請(qǐng)人】大地綠源環(huán)?？萍?北京)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日