G6PD缺陷型Caki-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，尤其是采用SiRNA干擾技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞研宄 模型。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖 _6_ 憐酸脫氛酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)是憐 酸戊糖途徑（pentose-phosphate pathway, PPP)的關(guān)鍵限速酶，定位于基因高密度區(qū) Xq2. 8(NM_000402)，全長18kb，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成。G6H)是看家基因，在所 有組織細(xì)胞均有表達(dá)，其mRNA全長為2395bp，cDNA為1548bp，編碼515個氨基酸。磷酸 戊糖途徑可產(chǎn)生五磷酸核糖和還原型煙酰胺腺嗓呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)，是細(xì)胞生長生存的重要核酸合成原料，及還原劑。腫瘤 細(xì)胞是增殖和分化失控的細(xì)胞，并且存在氧化還原應(yīng)激的失衡。近年來，越來越多的研宄表 明G6H)及磷酸戊糖通路的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。
[0003] 在正常細(xì)胞中，G6ro的表達(dá)及活性是受到嚴(yán)格調(diào)控的。然而，在腫瘤細(xì)胞中G6ro 卻表現(xiàn)出異常激活。有文獻(xiàn)報道，在NIH 3T3細(xì)胞中過表達(dá)人G6H)基因，可使細(xì)胞生長迅 速，形態(tài)發(fā)生改變，接觸抑制和貼壁依賴性消失。進(jìn)一步將上述細(xì)胞注射到裸鼠皮下，可快 速誘導(dǎo)裸鼠產(chǎn)生腫瘤，并且腫瘤的大小與G6ro活性呈正相關(guān)。這一結(jié)果表明，G6ro表達(dá)增 加可發(fā)揮類似癌基因促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。另有研宄指出，Gero在膀胱癌、胃腸癌、結(jié) 腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中出現(xiàn)了高表達(dá)，并具有高活性。Ohl等在檢測人膀 胱癌和前列腺癌細(xì)胞內(nèi)看家基因時發(fā)現(xiàn)，Gero表達(dá)出現(xiàn)異常并與腫瘤的惡性程度相關(guān)。另 夕卜，應(yīng)用的非競爭性抑制劑脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA)可抑制細(xì)胞 內(nèi)G6ro酶活性，并減慢伯基特淋巴瘤的生長速度。G6ro可通過磷酸戊糖途徑產(chǎn)生重要的還 原劑NADPH，從而保護(hù)細(xì)胞免受超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等產(chǎn)生氧化應(yīng)激而引起細(xì) 胞的凋亡。我們先前的研宄表明，在人黑色素瘤A375細(xì)胞中敲低G6H)，氧化應(yīng)激所引起的 細(xì)胞凋亡明顯增加，由此提示Gero的高表達(dá)可能是人惡性黑色素瘤臨床耐藥性產(chǎn)生的原 因之一。綜上可見，Gero與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療預(yù)后存在相關(guān)性。然而，Gero與腫 瘤關(guān)系的研宄并不充分，甚至有不一致的觀點和結(jié)論，其具體作用機制更加不明確。因此， G6ro在腫瘤領(lǐng)域的角色如何，仍需要大量工作去研宄、探討。
[0004] 腎細(xì)胞癌（簡稱腎癌）是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又稱腎腺 癌，占腎惡性腫瘤的80%?90%，是泌尿系統(tǒng)中惡性度較高的腫瘤。據(jù)調(diào)查，腎癌在我國泌 尿生殖系統(tǒng)腫瘤中占第二位，僅次于膀胱腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%?3%、小兒惡性腫 瘤的20%左右。流行病學(xué)統(tǒng)計資料顯示，腎癌可見于各年齡階段，并且腎癌在我國的發(fā)病率 正呈現(xiàn)出逐年上升趨勢。腎細(xì)胞癌具有初診轉(zhuǎn)移率高、病程進(jìn)展快、對常規(guī)放化療十分不敏 感、術(shù)后易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點，成為長期困擾醫(yī)生和患者的難題。雖然目前腎癌的治療取 得了一定進(jìn)展，但其詳細(xì)發(fā)病機制仍不清楚。因此，相關(guān)分子靶標(biāo)的鑒定，以及更為有效的 靶向治療策略仍有待進(jìn)一步探索。
[0005] 在本發(fā)明人的前期研宄中，我們采用免疫組化方法證實，與癌旁組織對比，Gero在 人腎細(xì)胞癌中出現(xiàn)了表達(dá)升高的現(xiàn)象。然而，G6PD的表達(dá)及活性是否在腎細(xì)胞癌相應(yīng)細(xì)胞 系中存在異常，Gero在腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用是什么，以及其調(diào)控機制又如何？ 上述疑問，國內(nèi)外至今未見相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種Gero缺陷型Caki-I穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，作為細(xì)胞模型用于研宄 Gero與腎細(xì)胞癌的相關(guān)性及其作用機制。
[0007] 本發(fā)明所述的G6H)缺陷型Caki-I穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是含有靶向干擾G6H)基因表達(dá)的 DNA雙鏈片段和綠色焚光蛋白（green fluorescent protein, GFP)基因、可將Caki-I細(xì)胞 株經(jīng)siRNA干擾技術(shù)靶向沉默了內(nèi)源性G6H)表達(dá)量80%以上的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；所述的DNA雙 鏈片段為：干擾 F 鏈 5' -GATCCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTCAAGAGATGTCAAGTGGCACTGAGGCTTT TTTA-3' 和干擾 R 鏈 5' -AGCTTAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACATCTCTTGAATGTCAAGTGGCACTGAGG CGGG-3, 。
[0008] 上述Caki-I細(xì)胞株為現(xiàn)有技術(shù)，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。它來源于一位49歲白 種男性腎透明細(xì)胞癌患者的皮膚轉(zhuǎn)移灶，由J Fogh等人于1977年建立。該細(xì)胞貼壁生長， 屬上皮細(xì)胞，具有致瘤性（接種該細(xì)胞至免疫抑制的裸鼠，可產(chǎn)生類似于腎癌基本特征的 透明細(xì)胞癌）。經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析，Caki-I為亞三倍體合并Y染色體缺失的細(xì)胞。除N9和 N19外，其他常染色體均存在于該細(xì)胞中，呈2倍體或3倍體形式。該細(xì)胞已被鑒定的染色體 標(biāo)記有 13個：9q+，t(lp ; ? )，t(lqter>lq21: :20)，t(lql7q)，der(ll)t(3 ;11) (q21 ;ql4)， 19q+，4q+，4p+等。Caki-1 細(xì)胞DNA上的短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat, STR)包括： Amelogenin:X ；CSF1P0:10, 11 ；D13S317:11, 12 ；D16S539:12 ；D5S818:11, 12 ；D7S820:8, 12 ； THOl :6, 8 ;TP0X: 8, 11和vWA: 15, 17。本發(fā)明所述的G6H)缺陷型Caki-I穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 (Caki-1-G6PD siRNA)是將上述DNA雙鏈片段插入含GFP的pSP-GFP/Neo表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入 Caki-I細(xì)胞株，在細(xì)胞中表達(dá)siRNA，經(jīng)陽性細(xì)胞克隆篩選，得到siRNA靶向沉默了內(nèi)源性 G6PD表達(dá)量達(dá)80%以上的穩(wěn)轉(zhuǎn)Caki-1-G6PD siRNA細(xì)胞株。
[0009] 本發(fā)明所述的G6H)缺陷型Caki-I穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法由以下步驟組成：
[0010] 一、SiRNA序列和DNA模板的設(shè)計與合成
[0011] 用01 igoEngine RNAi軟件設(shè)計針對人G6H)基因3'端非編碼區(qū)的干擾序列 5' -GCCTCAGTGCCACTTGACA-3'，并以無關(guān)序列 5' -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3' 為對照，再分別 合成兩條互補并含干擾序列或無關(guān)序列的正義鏈和反義鏈的DNA模板，中間以9個脫氧核 苷酸的Hairpin結(jié)構(gòu)相連，后接RNA Poly III轉(zhuǎn)錄中止點，并在兩端引入Bgl I和Hind III 酶切位點；對應(yīng)于人G6H)基因3'端非編碼區(qū)的干擾序列的DNA模板是干擾F鏈5' -GATCC CCGCCTCAGTGCCACTTGACATTCAAGAGATGTCAAGTGGCACTGAGGCTTTTTTA-3' 和干擾 R 鏈' -AGCTTA AAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACATCTCTTGAATGTCAAGTGGCACTGAGGCGGG-3' ；而對應(yīng)于無關(guān)序列的 DNA 模板是無關(guān) F 鏈 5' -GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGITTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAAITT TTTA-3' 和無關(guān) R 鏈 5' -AGCTTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGA AGGG-3，；
[0012] 二、siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
[0013] 上述DNA模板分別經(jīng)稀釋、退火，與線性質(zhì)粒pSP-GFP/Neo連接；再轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 α，涂布平板，過夜培養(yǎng)；挑取兩4個單菌落進(jìn)行擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行測序；對于測 序正確的陽性克隆，提取其不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒；
[0014] 三、Caki-I細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染
[0015] 復(fù)蘇培養(yǎng)Caki-I細(xì)胞至狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染前一天傳代細(xì)胞至6孔板，每孔2 X IO5細(xì) 胞，次日觀察其匯合度為70 %?80 %時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染 試劑和Opti-MBl培養(yǎng)基，6孔板每孔的轉(zhuǎn)染量為4 μ g質(zhì)粒稀釋到250 μ L Opti-MBl培養(yǎng) 基，得到A液；取10 μ L Lipofectamine 2000溶解于250 μ L Opti-MEM培養(yǎng)基，得到B液； 室溫孵育5min后將A液和B液混合，室溫孵育20min后加入棄培養(yǎng)基的細(xì)胞中，孵育6? 8hr后更換為新鮮不含抗生素的完全培養(yǎng)基；
[0016] 四、Caki-1-G6PD siRNA穩(wěn)定