G6pd過(guò)表達(dá)型achn穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，尤其是采用siRNA干擾技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞研究 模型。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖 _6_ 憐酸脫氧酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD)廣泛存在 于生物體的各組織細(xì)胞中，是戊糖磷酸途徑（pentose-phosphatepathway,PPP)的關(guān)鍵酶。 G6H)基因定位于Xq2. 8 (NM_000402)，全長(zhǎng)18kb，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成，其mRNA 全長(zhǎng)2395bp，cDNA為1548bp，編碼515個(gè)氨基酸，單個(gè)亞基分子量為59kDa，有活性的G6H) 以二聚體或四聚體狀態(tài)存在。G6PD在催化葡萄糖6-磷酸（glucose-6-phophte，G-6-P)脫氫 生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯的同時(shí)產(chǎn)生還原型煙酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adeninedinucleotidephosphate,NADPH)。NADPH可維持細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘膚 (glutathione，GSH)水平，在體內(nèi)自由基和過(guò)氧化物清除過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。PPP的另 一重要產(chǎn)物為核糖5-磷酸（ribose-5-phosphate,R-5-P)，是合成核酸的基本原料。PPP其 他中間產(chǎn)物，如果糖6-磷酸和甘油醛3-磷酸則可進(jìn)入糖酵解（glycolysis)及三羧酸循環(huán) (tricarboxylicacidcycle,TAC)，繼續(xù)氧化供能。
[0003] 越來(lái)越多的研究表明，G6H)表達(dá)或者活性與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。F0hl 等發(fā)現(xiàn)，G6H)基因在正常組織與膀胱癌組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄存在明顯差異，而且其mRNA的高 低與腫瘤的惡性程度相關(guān)。YKekec以及JWang等的研究均表明，G6H)在胃癌組織中高表 達(dá)，并且G6H)活性與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。白血病患者的紅細(xì)胞中G6H)呈現(xiàn)高表達(dá) 和高活性。Wei-yingK等報(bào)道，G6H)高表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞呈現(xiàn)升高的NADPH和GSH，伴 隨著細(xì)胞增殖異常、誘發(fā)裸鼠成瘤能力增強(qiáng)等特點(diǎn)。聯(lián)合運(yùn)用G6H)抑制劑2-脫氧-D-葡 萄糖（deoxy-D-glucose，2_DG)和 6-氨基煙醜胺（6-aminonicotinamide，6-AN)可增加人 神經(jīng)膠質(zhì)瘤及鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系對(duì)放射性治療的敏感性，改善療效。我們先前的研究亦表 明，G6H)過(guò)表達(dá)在人惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。應(yīng)用siRNA-慢病 毒載體靶向敲低人皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞內(nèi)源性G6H)表達(dá)，構(gòu)建G6H)缺陷的A375細(xì)胞 (A375-G6H)A)，并發(fā)現(xiàn)A375-G6H)A細(xì)胞呈現(xiàn)生長(zhǎng)增殖抑制，腫瘤形成能力降低，凋亡率 升高，對(duì)巰基氧化劑二酰胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激更敏感。然而，迄今為止，G6H)在腫瘤發(fā)生、發(fā) 展過(guò)程中的分子機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步研究。
[0004] 腎癌又稱(chēng)腎細(xì)胞癌，是泌尿系統(tǒng)中惡性程度較高的腫瘤，約占成人腎臟惡性腫瘤 的80%?90%，占成人惡性腫瘤的2%?3%。世界范圍內(nèi)各國(guó)或各地區(qū)的發(fā)病率各不相 同，總體上發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率高于發(fā)展中國(guó)家，城市高于農(nóng)村，男性多于女性，男女患者比例 約為2:1，發(fā)病年齡可見(jiàn)于各年齡段，高發(fā)年齡50?70歲。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)腎癌發(fā)病率正 呈逐年上升趨勢(shì)，且腎癌的病因未明。雖然外科手術(shù)是公認(rèn)的腎癌治療手段，但約有1/3腎 細(xì)胞癌患者在初診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)后約有1/2病人在一定時(shí)間內(nèi)將出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。此外，腎 細(xì)胞癌對(duì)絕大部分放化療以及生物治療十分不敏感。因此，明確腎細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制，尋找有 效的化學(xué)、免疫等輔助療法對(duì)改善腎細(xì)胞癌的預(yù)后，成為亟待解決的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明人采用免疫組化方法已經(jīng)證實(shí)，G6H)在人腎細(xì)胞腺癌組織中表達(dá)量比癌旁 正常組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是G6ro表達(dá)或者活性變化與腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 及其機(jī)制又是怎樣的呢？目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種G6H)過(guò)表達(dá)型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，作為細(xì)胞模型用于研究 G6ro與腎細(xì)胞癌的相關(guān)性及其作用機(jī)制。
[0007] 本發(fā)明所述的G6TO過(guò)表達(dá)型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是一種G6TO過(guò)表達(dá)型ACHN穩(wěn) 轉(zhuǎn)細(xì)胞株，是將pBABE-pur〇-G6ro轉(zhuǎn)染人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞株ACHN，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選， Real-timePCR、Westernblot驗(yàn)證，以及反復(fù)傳代、凍存復(fù)蘇所得的G6H)表達(dá)量穩(wěn)定增加 40倍以上的細(xì)胞株。
[0008] 本發(fā)明所述的G6H)過(guò)表達(dá)型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0009]一、G6PD基因的克隆
[0010] 用Primer5. 0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)人G6PD基因的PCR正向引物5'-GGAAITCATGGCAGAG CAGGTGGCCCTG-3' 和反向引物 5' -ACGCGTCGACTCAGAGCTTGTGGGGGITCAC-3'，分別引入EcoR I和SalI酶切位點(diǎn)，以pMD19-Tsimple-G6PD-WT質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出G6PD 的編碼序列1548bp，純化PCR產(chǎn)物，獲得G6H)基因的cDNA;
[0011] 二、pBABE-puro-GGH)重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0012] 上述G6PD基因cDNA的PCR純化產(chǎn)物和pBABE-puro載體分別用EcoRI和Sal I進(jìn)行酶切，用TaKaRa的T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，涂布平板，過(guò)夜培 養(yǎng)；隨機(jī)挑取2個(gè)單菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行EcoRI和SalI雙酶切鑒定；對(duì) 于酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序及序列的分析比對(duì)；擴(kuò)增培養(yǎng)測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆，提取 其不含內(nèi)毒素的pBABE-pur〇-G6ro重組質(zhì)粒；
[0013] 三、ACHN細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染
[0014] 復(fù)蘇培養(yǎng)ACHN細(xì)胞至狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染前一天傳代細(xì)胞至6孔板，每孔加入2 X105 細(xì)胞，次日觀(guān)察其匯合度為70 %?80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn) 染試劑和〇pti-MEM培養(yǎng)基；6孔板每孔的轉(zhuǎn)染量為4 ii g質(zhì)粒稀釋到250 ii L Opti-MEM培養(yǎng) 基，得到A液，取10 ii L Lipofectamine 2000溶解于250 ii L Opti-MEM培養(yǎng)基，得到B液， 室溫孵育5min后將A液和B液混合，室溫孵育20min后加入棄培養(yǎng)基的細(xì)胞中；孵育6? 8hr后更換為新鮮不含抗生素的完全培養(yǎng)基；
[0015] 四、ACHN-G6PD穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選及鑒定
[0016]細(xì)胞轉(zhuǎn)染換液24hr后，更換完全培養(yǎng)基為含0. 25yg/mL嘌呤霉素的篩選培養(yǎng) 基，壓力篩選一周，中間換一次液；一周后在倒置顯微鏡下觀(guān)察，把單獨(dú)每一個(gè)細(xì)胞群圈出， 用0. 25%胰酶消化畫(huà)圈的細(xì)胞群，每一團(tuán)細(xì)胞收集到新的24孔板的一個(gè)孔培養(yǎng)；繼續(xù)用 0. 25yg/mL的嘌呤霉素壓力篩選一周；倒置顯微鏡下觀(guān)察，進(jìn)行亞克隆篩選，挑選出正常 生長(zhǎng)細(xì)胞群傳代，逐步放大培養(yǎng)；應(yīng)用Real-timePCR、Westernblot分別在mRNA和蛋白水 平檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株G6H)的表達(dá)水平，用紫外分光光度法在340nm檢測(cè)G6H)酶活性；將穩(wěn)轉(zhuǎn) 細(xì)胞株反復(fù)傳代、凍存及復(fù)蘇，觀(guān)察其G6H)表達(dá)是否穩(wěn)定；ACHN-G6H)細(xì)胞株已在體外傳代 20次以上，其G6ro表達(dá)量穩(wěn)定增加40倍以上，G6ro酶活性增加2. 2倍，表明G6ro過(guò)表達(dá) 型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。
[0017] 本申請(qǐng)是用PCR技術(shù)從pMD19-Tsimple-G6PD-WT質(zhì)粒中擴(kuò)增得到人G6H)基因 (NM_001042351. 2)的cDNA，分別用EcoRI和SalI雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物cDNA和pBABE-puro 表達(dá)質(zhì)粒后，用T4DNA連接酶將cDNA克隆入pBABE-puro質(zhì)粒，構(gòu)建pBABE-pur〇-G6ro重 組表達(dá)載體。該載體具有嘌呤霉素（puromycin)抗性基因，可用嘌呤霉素進(jìn)行篩選以建立 穩(wěn)定細(xì)胞系。經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選后，pBABE-pur〇-G6ro載體可穩(wěn)定整合入ACHN細(xì)胞的基 因組中，從而使G6H)基因可在A(yíng)CHN細(xì)胞中持續(xù)過(guò)表達(dá)。應(yīng)用Real-timePCR和Western blot進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示ACHN-G6H)細(xì)胞株的G6H)表達(dá)量可穩(wěn)定增加40倍以上，G6H)酶 活性升高2. 2倍，表明G6H)過(guò)表達(dá)型腎細(xì)胞癌細(xì)胞系構(gòu)建成功。
[0018] 上述ACHN細(xì)胞株為現(xiàn)有技術(shù)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。它來(lái)源于一位22歲白種 男性廣泛轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞腺癌患者的胸腔積液，由TFHogan等人于1979年建系。該細(xì)胞貼 壁生長(zhǎng)，屬上皮細(xì)胞，具有致瘤性（接種該細(xì)胞至免疫抑制的裸鼠，可在21d內(nèi)100%長(zhǎng)出侵 襲性腎癌基本特征的腫瘤）。干擾素可抑制該細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此，ACHN多用于干擾素及其誘 導(dǎo)劑的抗增殖研究。經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析，該細(xì)胞DNA上的短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandem r印eat,STR)包括：Amelogenin:X;CSF1P0:11 ;D13S317:12 ;D16S539:12, 13 ;D5S818:12 ; D7S820:9, 11 ;TH01:8 ;TP0X:8, 11 ;vWA:16, 17。本發(fā)明所述的G6PD過(guò)表達(dá)型ACHN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì) 胞株是將人G6H)的cDNA雙鏈片段插入pBABE-puro表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入ACHN細(xì)胞株，經(jīng)陽(yáng)性 細(xì)胞克隆篩選，得到G6H)表達(dá)量達(dá)穩(wěn)定增加40倍以上的穩(wěn)轉(zhuǎn)ACHN-G6H)細(xì)胞株。
[0019]pMD19-Tsimple-G6PD-WT質(zhì)粒DNA是含有正常人G6PD基因cDNA雙鏈的克隆載 體。EcoRI和Sa