一種多角體蛋白包裹型植酸酶的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種多角體蛋白包裹型植酸酶。具體地講，本發(fā)明 涉及共表達植酸酶基因及多角體蛋白基因的重組多角體桿狀病毒的構建及多角體包裹型 植酸酶。
【背景技術】
[0002] 植酸酶是一種能將飼料中植酸磷水解成無機磷和肌醇的新型單胃動物飼料添加 劑，主要應用于豬、雞、鴨等單胃動物和水產養(yǎng)殖類動物，應用范圍廣、需求量大。它可使植 物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷排泄量減少40%，同時還可降低植酸的抗營養(yǎng) 作用。因此在飼料中添加植酸酶對提高畜禽業(yè)生產效益及降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要 意義。它在歐洲使用較為廣泛，但在我國到目前為止，植酸酶并沒有在飼料中得到廣泛的推 廣應用，主要原因在于：1、植酸酶在天然材料中的含量太低，難以大量生產，生產成本昂貴； 2、植酸酶的抗逆性，尤其是熱穩(wěn)定性不能完全滿足飼料及飼料加工的要求。
[0003] 昆蟲病毒多角體（POlyhedra)是指昆蟲病毒在感染宿主細胞后產生的多面體粒 子，其主要用來包裹病毒粒子。它的功能是保護包裹的病毒顆粒免受不良環(huán)境的破壞，比 如：高溫、干燥、輻射等，以及它對各種蛋白分解酶也有抗性，并且在酸性條件下極其穩(wěn)定， 而在堿性環(huán)境下易溶解并釋放出病毒粒子。如：Ijiri等人將蛋白激酶C(protein kinase C)包裹進入了質型多角體中，并發(fā)現(xiàn)包裹型的蛋白激酶C相對于沒有經過包裹的蛋白有更 強生物學活性和持續(xù)的藥物緩釋效果；被多角體包裹的表皮生長因子（epidermal growth factor)不僅藥效延長了，而且其能抵抗高強度的射線破壞；曹翠平等人利用多角體包埋 外源蛋白時發(fā)現(xiàn)，經過包埋的EGFP蛋白（綠色熒光蛋白）放置2個月后仍能檢測到綠色熒 光，而干燥處理30min后同樣能檢測到蛋白活性。這些研宄表明多角體是耐酸、抗輻射、抗 干燥并具有包裹異源活性蛋白特性的優(yōu)良載體。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種多角體蛋白包裹型植酸酶，經多角體包裹后的植酸酶具 有耐酸、抗高溫、高效、持續(xù)、緩釋等特點。具體是包括利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，同時將質型 多角體蛋白基因和植酸酶基因分別構建到PFastBacTMDual載體的PH與PlO啟動子下，并 在植酸酶基因前引入SP引導基因，構建含有植酸酶基因及多角體基因的重組桿狀病毒；通 過該重組桿狀病毒感染昆蟲細胞（如Sf9或Sf21)，可以在細胞內產生大量被多角體包裹 的植酸酶的顆粒；通過分離、提取純化感染了重組桿狀病毒的細胞獲得大量的多角體顆粒； 對純化到的多角體顆粒進行植酸酶活性分析，驗證多角體包裹型植酸酶具有耐酸、抗高溫、 高效、持續(xù)、緩釋等特性。
[0005] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種多角體蛋白包裹型植酸酶，由植 酸酶aPPA分子和包裹層組成，所述包裹層為昆蟲質型多角體蛋白，所述植酸酶aPPA分子以 固態(tài)分子的形式被包裹于所述昆蟲質型多角體蛋白內；所述多角體蛋白包裹型植酸酶的顆 粒大小為0. 1?1 μπι，植酸酶蛋白濃度占比為10%?70%。
[0006] 優(yōu)選地，所述多角體蛋白包裹型植酸酶是通過如下方法制成，具體步驟如下：
[0007] Α、利用病毒基因組所展現(xiàn)的密碼子偏倚性，選取植酸酶的密碼子，合成植酸酶 aPPA基因，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；
[0008] B、將步驟A的所述植酸酶aPPA基因構建到pFastBacTMDual載體的plO啟動子下， 并在所述植酸酶aPPA基因前引入SP引導基因，構建含有植酸酶aPPA基因及多角體基因的 重組桿狀病毒載體，所述SP引導基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，所述多角體基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；
[0009] C、將步驟B中的所述重組桿狀病毒載體與桿狀病毒骨架重組，獲得重組桿狀病 毒；
[0010] D、用步驟C中的所述重組桿狀病毒感染昆蟲細胞，分離純化多角體顆粒，即得到 多角體蛋白包裹型植酸酶。
[0011] 優(yōu)選地，步驟D中所述昆蟲細胞為Sf9昆蟲細胞或Sf 21昆蟲細胞。
[0012] 優(yōu)選地，所述多角體蛋白包裹型植酸酶中植酸酶蛋白濃度占比為45 %?55 %。
[0013] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下，通過構建含有含編碼植酸酶的嵌合基因重 組多角體桿狀病毒載體，并將含編碼植酸酶的基因插入到病毒骨架載體中，獲得能表達多 角體包裹型植酸酶的重組多角體桿狀病毒BmBacmicL與其他方式表達的植酸酶作為飼料添 加劑種種不足（如酶活低、穩(wěn)定性差、易失活等）相比，由重組多角體桿狀病毒BmBacmid表 達產生的多角體蛋白包裹型植酸酶具有耐酸、抗高溫、持久緩釋等效果。
【附圖說明】
[0014] 圖1是Bacmid-polyhedrin-aPPA病毒感染的細胞內多角體的產生情況（X20倍 數(shù)下顯微鏡拍照）；
[0015] 圖2是Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA病毒感染的細胞內多角體的產生情況 (X20倍數(shù)下顯微鏡拍照）；
[0016] 圖3是未經病毒感染的正常細胞內多角體的產生情況（X20倍數(shù)下顯微鏡拍 照）；
[0017] 圖4是Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA病毒感染的細胞分離獲得的多角體在可見 光下情況（X20倍數(shù)下顯微鏡拍照）；
[0018] 圖5是Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA病毒感染的細胞分離獲得的多角體在熒光 下情況（X20倍數(shù)下顯微鏡拍照）；
[0019] 圖6是Bacmid-polyhedrin-aPPA病毒感染的細胞分離獲得的多角體在可見光下 情況（X20倍數(shù)下顯微鏡拍照）；
[0020] 圖7是植酸酶在昆蟲表達系統(tǒng)中的SDS-PAGE分析圖（1、重組桿狀病毒 Bacmid-polyhedrin感染細胞后分離的多角體；2、重組桿狀病毒Bacmid-polyhedrin-aPPA 感染細胞后分離的多角體；3、重組桿狀病毒Bacmid-polyhedrin-EGFP-aPPA感染細胞后分 離的多角體）；
[0021] 圖8是多角體蛋白包裹型植酸酶appA及植酸酶（EKEAR)的熱穩(wěn)定性對比圖；
[0022] 圖9是多角體蛋白包裹型植酸酶appA及植酸酶（EKEAR)的pH耐受性曲線對比 圖；
[0023] 圖10是胃蛋白酶對多角體蛋白包裹型植酸酶appA及植酸酶（EKEAR)活性的影響 對比圖；
[0024] 圖11是胰蛋白酶對多角體蛋白包裹型植酸酶appA及植酸酶（EKEAR)活性的影響 對比圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合具體實施例對本發(fā)明一種多角體蛋白包裹型植酸酶作進一步的詳細說 明。
[0026] 一種多角體蛋白包裹型植酸酶，由植酸酶aPPA分子和包裹層組成，所述包裹層為 昆蟲質型多角體蛋白，所述植酸酶aPPA分子以固態(tài)分子的形式被包裹于所述昆蟲質型多 角體蛋白內；所述多角體蛋白包裹型植酸酶的顆粒大小為〇. 1?I ym，植酸酶蛋白濃度占 比為10%?70%。
[0027] 所述多角體蛋白包裹型植酸酶是通過如下方法制成，具體步驟如下：
[0028] Α、構建合成的aPPA基因
[0029] 利用病毒基因組所展現(xiàn)的密碼子偏倚性，優(yōu)選的密碼子的確定可通過詳盡地調 查可得到的病毒或昆蟲基因的序列而定，如調查多角體蛋白的20種氨基酸及終止信號的 編碼密碼子后，優(yōu)選密碼子很容易地被找出，甘氨酸，GGC(60% );天冬氨酸，GAC(74% ) 對 GAT(26% );精氨酸，GGC(37% )或 CGT(33% )對 CCG(1% )或 CGA(1% );天冬酰胺， AAC (86% )對 AAT (14 % );異亮氨酸，ATC (69% )對 ATA (6% );蘇氨酸，ACC (53% )對 ACA(4% )或ACC(13% );半脫氨酸，TGC(73% )對TGT(27% );酪氨酸，TAC(81% )對 TAT(19% );苯丙氨酸，TTC(65% )對 TTT(35% );谷氨酰胺，CAA(94% )對 CAG出％ );組 氨酸，CAC(83% )對CAT(17% )和脯氨酸，CCC(58% )對CCA(10% )?；诿艽a子運用中 的優(yōu)勢及明顯的差異，我們設計并合成了 aPPA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；
[0030] B、含植酸酶aPPA與多角體蛋白共表達載體pPH-aPPA構建
[0031] 由上海生物工程公司人工合成多角體基因 polyhedrin構建到pUC57載體上，并在 上下游引BamHI和NotI位點，多角體基因 polyhedrin的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示； 將多角體基因 polyhedrin用BamHI/Notl從pUC57載體上切下來，經過膠回收純化，構建到 pFastBacDual載體polyhedrin啟動子下游相應的位點，連接產物轉化大腸桿菌ToplO,挑 取陽性克隆測序驗證，獲得多角體表達載體PPH ;
[0032] 由上海生物工程公司人工合成SP引導基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 嵌合基因由SP引導基因和植酸酶aPPA基因構成，并在兩端分別引入XhoI和KpnI位點，將 合成的全長片段SP-aPPA構建到pUC57載體；
[0033] 將SP-aPPA片段用Xhol/Kpnl從pUC57上酶切下來，經過膠回收純化，構建到pPH 載體PlO啟動子下游相應的位點，連接產物轉化大腸桿菌ToplO，挑取陽性克隆測序驗證， 獲得多角體與aPPA共表達載體pPH-aPPA ;
[0034] C、含有aPPA基因的重組桿狀病毒BcNPV的構建
[0035] 取共表達載體pPH-aPPA IOOng加入100 μ 1大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞，熱 擊轉化，涂布在含50 μ g/ml卡那霉素、10 μ g/ml四環(huán)素、7 μ g/ml慶大霉素、100 μ g/ml Blu〇-gal，40 μ g/ml IPTG 的 LB 固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng) 48h ;
[0036] 挑取白色克隆進行PCR鑒定與提取質粒送上海生工測序鑒定，將陽性克