提高雞精液品質(zhì)方法及其引物、試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及優(yōu)質(zhì)雞精液品質(zhì)密切相關(guān)基因診斷試劑盒及其使用方法，屬于分子生 物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，應(yīng)用于公雞的早期篩選。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類對(duì)家禽生產(chǎn)性狀從無(wú)意識(shí)到有意識(shí)選擇已經(jīng)歷幾千年的歷史，而從表型選擇 到遺傳基礎(chǔ)的研宄和基因型選擇這一過(guò)程僅是近幾十年的事情。優(yōu)秀的種公雞是提高經(jīng)濟(jì) 效益的關(guān)鍵之一，一方面可降低生產(chǎn)成本，特別是種雞的飼養(yǎng)成本。采取人工授精可使雞的 配種比例提高3倍左右，可以減少3/4的種公雞，這可以較大的降低成本，另一方面可大大 提高優(yōu)秀種公雞的利用率，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。當(dāng)前對(duì)公雞的選擇依然采用常規(guī)選 擇，雖然常規(guī)育種方法在家禽遺傳改良中取得一定進(jìn)展，但它對(duì)數(shù)量性狀的選擇要在個(gè)體 生長(zhǎng)發(fā)育到一定時(shí)期，育種周期長(zhǎng)，費(fèi)用高。優(yōu)質(zhì)雞精液品質(zhì)性狀為數(shù)量性狀，僅以個(gè)體或 親屬表型值進(jìn)行個(gè)體選擇結(jié)果不十分可靠，因此，需要遺傳標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇。隨著人類基 因組測(cè)序工作的完成，SNP的篩選及檢測(cè)正式成為研宄者廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。該技術(shù)具有特 異性高、檢測(cè)快速、通用性強(qiáng)、適用范圍廣、成本低廉等特點(diǎn)，在復(fù)雜疾病的基因定位、關(guān)聯(lián) 分析、個(gè)體疾病易感性分析與藥物基因組學(xué)等的研宄中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。
[0003] 經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和專利的檢索，至今未見(jiàn)有VIPRl、VIPR2和DAR2基因多態(tài) 性位點(diǎn)與雞精液品質(zhì)性狀相關(guān)性的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提高雞精液品質(zhì)方法及其引物、試劑盒及其使用方法， 本發(fā)明方法效果顯著，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，且不受外界環(huán)境的影響。
[0005] 本發(fā)明提供了一種雞精液品質(zhì)密切相關(guān)基因用引物，包括血管活性腸肽受體 I (VIPRl)基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物、血管活性腸肽受體2 (VIPR2)基因 PCR擴(kuò)增的 上下游引物混合物、多巴胺受體2 (DAR2)基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物；
[0006] 所述血管活性腸肽受體I(VIPRl)基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物中上游引物 序列：5' -gctcccgcagatatatggaa-3' ；下游引物序列：5' -tgggaggagacaaaacaaca-3' ；
[0007] 所述血管活性腸肽受體2(VIPR2)基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物的上游引物 序列：5' -gtgttcacttttgggcacct-3' ；下游引物序列：R:5' -cagccaaaaacattggtgtg-3' ；
[0008] 所述多巴胺受體2(DAR2)基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物，上游引物序列： 5' -gttggggagtggaggttcag-3' ；下游引物序列：5' -attgggctggagatggcaaa-3'。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種利用復(fù)合基因型提高雞精液品質(zhì)的方法，提取待測(cè)樣本的雞 基因組DNA，待測(cè)樣本的雞基因組DNA基因序列經(jīng)權(quán)利要求1所述的雞精液品質(zhì)密切相關(guān) 基因用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片段，擴(kuò)增得到192、250和270 bp的目的片段，目 的片段先進(jìn)行PCR-SSCP檢測(cè)后，凝膠電泳后用銀染顯色，分別得到DNA的SSCP圖譜，根據(jù) 3個(gè)圖譜中的帶型選擇選擇TT/GG/OQ三基因復(fù)合基因型的個(gè)體，即在73352、36127、201和 208處分別為T、G、T和A/G等位基因的個(gè)體。
[0010] 優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片段的反應(yīng)體系20 yL :在PCR反應(yīng)管中加 入上下游引物混合物2. 0 μ L、PCR反應(yīng)試劑3 μ L、50ng/ μ L DNA模板I. 0 μ L，加超純水至 20 μ L，充分混勻后短暫離心。
[0011] 優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為先94°C變性5min ;再經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循 環(huán)包括 94°C 30s、60°C 15s、72°C 30s ;然后 72°C延伸 lOmin、最后 4°C保存。
[0012] 優(yōu)選地，所述PCR-SSCP檢測(cè)包括：2 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入7 μ L上樣緩沖液，98°C 變性lOmin，然后冰浴5min ;3對(duì)引物的聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%，凝膠交聯(lián)度為29 :1， 電壓都為150V，過(guò)夜電泳。
[0013] 此外，本發(fā)明又提供了一種雞精液品質(zhì)三基因聯(lián)合效應(yīng)診斷試劑盒，包括盒體和 盒體內(nèi)的襯墊，襯墊的孔腔內(nèi)設(shè)有所述的血管活性腸肽受體I VIPRl基因 PCR擴(kuò)增的上下 游引物混合物P、血管活性腸肽受體2 VIPR2基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物P、所述多 巴胺受體2 DAR2基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物P以及PCR反應(yīng)試劑、超純水、上樣緩 沖液；所述PCR反應(yīng)試劑為10 X buffer、dNTP和Taq酶的混合物。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了雞精液品質(zhì)三基因聯(lián)合效應(yīng)診斷試劑盒的使用方法，包括以 下步驟：
[0015] (I)PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片段：采用20 μ L反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中加入上下 游引物混合物2. 0 μ L、PCR反應(yīng)試劑3 μ L、50ng/ μ L DNA模板I. 0 μ L，加超純水至20 μ L， 充分混勻后短暫離心；
[0016] (2)將PCR反應(yīng)管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增：先94°C變性5min ;再經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)， 每個(gè)循環(huán)包括94°C 30s、60°C 15s、72°C 30s ;然后72°C延伸lOmin、最后4°C保存。
[0017] (3)?〇?-55〇卩檢測(cè)：2以1^?〇?擴(kuò)增產(chǎn)物加入7以1^上樣緩沖液，98°〇變性101^11，然 后冰浴5min。3對(duì)引物的聚丙烯酰胺凝膠濃度為10 %，凝膠交聯(lián)度為29 :1，電壓都為150V， 過(guò)夜電泳；
[0018] (4)目的片段經(jīng)SSCP分析，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的SSCP圖譜，根據(jù)3 個(gè)圖譜中的帶型選擇VIPRl、VIPR2和DAR2基因的基因型分別為TT/GG/OQ三基因復(fù)合基因 型的個(gè)體，即在73352、36127、201和208處分別為T、G、T和A/G等位基因的個(gè)體。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0020] 第一，針對(duì)VIPRl、VIPR2和DAR2基因分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物，VIPRl引物的擴(kuò)增產(chǎn)物 經(jīng)SSCP分析產(chǎn)生3種基因型（CC、CT和TT)，直接測(cè)序表明TT型與CC型相比在73352 bp 處發(fā)生了 C - T突變；VIPR2引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析產(chǎn)生3種基因型（AA、AG和GG)， GG型與AA型在36127 bp處發(fā)生了 A - G突變；DAR2引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析產(chǎn)生5 種基因型（〇〇、〇P、〇Q、PP和PQ)，QQ型與OO型相比檢測(cè)到在201處發(fā)生C - T突變，PP型 和OO型相比發(fā)現(xiàn)208處A - G突變。3個(gè)基因不同復(fù)合基因型與優(yōu)質(zhì)肉雞雞冠及精液品 質(zhì)的相關(guān)分析表明，三個(gè)基因復(fù)合基因型TT/GG/OQ基因型組合的精液品質(zhì)最好，精液量顯 著高于TT/AA/PP、CC/AA/OO、CC/AA/OP和CT/AA/00型個(gè)體（P〈0. 05);精子密度顯著高于 CT/AA/PP、CC/GG/OP、CC/AA/OO、CC/GG/00 和 CT/AA/00 型個(gè)體（Ρ〈0· 05);精子活力顯著好 于 CT/AA/00 和 CC/AA/OP 型個(gè)體（Ρ〈0· 05);
[0021] 第二，本發(fā)明利用血管活性腸肽受體I (VIPRl)、血管活性腸肽受體2 (VIPR2)和多 巴胺受體2(DAR2)基因的復(fù)合基因型的檢測(cè)提供一種準(zhǔn)確性高、快速、價(jià)格低廉的基因分 型試劑盒。本發(fā)明試劑盒包括VIPR1、VIP2和DAR2基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物，PCR 所需試劑。在育種篩選時(shí)，提取待測(cè)樣本的雞基因組DNA，基因序列經(jīng)特異性引物擴(kuò)增得到 192、250和270 bp的目的片段，目的片段經(jīng)SSCP分析，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的 SSCP圖譜，根據(jù)3個(gè)圖譜中的帶型選擇選擇TT/GG/OQ三基因復(fù)合基因型的個(gè)體。本發(fā)明方 法效果顯著，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，且不受外界環(huán)境的影響。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖 1 是 VIPRl 基因的 SSCP 圖譜；圖中 1，2 :CC 型；3,4 :CT 型；5,6 :TT 型。
[0023] 圖2是VIPRl基因的測(cè)序圖。
[0024] 圖 3 是 VIPR2 基因的 SSCP 圖譜；圖中 2,3,5 :ΑΑ 型；4,6 :GG 型；I :AG 型。
[0025] 圖4是VIPR-2基因的測(cè)序圖；
[0026] 圖 5 是 DAR2 基因的 SSCP 圖譜；圖中 I :QQ 型；2 :PP 型；3 :PQ 型；4,5 :OQ 型；6,8 : OP 型；7 :00 型。
[0027] 圖6是DAR2基因的測(cè)序圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 一種雞精液品質(zhì)密切相關(guān)基因用引物，包括血管活性腸肽受體IVIPRl基因 PCR擴(kuò) 增的上下游引物混合物、血管活性腸肽受體2VIPR2基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物、多 巴胺受體2 DAR2基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物。
[0029] 血管活性腸肽受體IVIPRl基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物中上游引物序列： 5' _gctcccgcagatatatggaa_3' 弓歹Ij _tgggaggagacaaaacaaca_3'〇
[0030] 血管活性腸肽受體2VIPR2基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物的上游引物序列： 5' -gtgttcacttttgggcacct-3' ；下游弓丨物序列：R:5' -cagccaaaaacattggtgtg-3'。
[0031] 多巴胺受體2 DAR2基因 PCR擴(kuò)增的上下游引物混合物，上游引物序列： 5' -gttggggagtggaggttcag-3' ；下游引物序列：5' -attgggctggagatggcaaa-3'。
[0032] 利用復(fù)合基因型提高雞精液品質(zhì)的方法：提取待測(cè)樣本的雞基因組DNA，待測(cè)樣 本的雞基因組DNA基因序列經(jīng)權(quán)利要求1所述的雞精液品質(zhì)密切相關(guān)基因用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片段，擴(kuò)增得到192、250和270 bp的目的片段，目的片段進(jìn)行PCR-SSCP 檢測(cè)后，凝膠電泳后用銀染顯色，分別得到DNA的SSCP圖譜，根據(jù)3個(gè)圖譜中的帶型選擇選 擇TT/GG/OQ三基因復(fù)合基因型的個(gè)體，即在73352、36127、201和208處分別為T、G、T和 A/G等位基因的個(gè)體。
[0033] PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片段的反應(yīng)體系20 yL :在PCR反應(yīng)管中加入上下游引物混 合物2. 0 μ L (每個(gè)上下游引物混合物對(duì)應(yīng)一個(gè)PCR反應(yīng)管）、PCR反應(yīng)試劑3 μ L、50ng/ μ L DNA模板I. 0 μ L，加超純水至20 μ L，充分混勻后短暫離心。
[0034] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為先94 °C變性5min ;再經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 94°C 30s、60°C 15s、72°C 30s ;然后 7