一種檢測(cè)細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因的引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因的引 物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，包括金霉、土霉素、四環(huán)素及 半合成衍生物甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺基四環(huán)素等，其結(jié)構(gòu)均含并四苯基本骨架。
[0003] 四環(huán)素類是主要抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的廣譜抗生素，高濃度具有殺菌作用。作用 機(jī)制在于藥物能特異性地與細(xì)菌核糖體30S亞基的A位置結(jié)合，阻止氨基酰一 tRNA在該位 上的聯(lián)結(jié)，從而抑制肽連的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。其抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陰性需氧 菌和厭氧菌、立克次體、螺旋體、支原體、衣原體及某些原蟲等有抗菌作用。
[0004] 四環(huán)素類抗生素在臨床上多年來由于四環(huán)素類的廣泛應(yīng)用，臨床常見病原菌包 括葡萄球菌等革蘭陽性菌及腸桿菌屬等革蘭陰性桿菌對(duì)四環(huán)素多數(shù)耐藥，并且，同類品種 之間存在交叉耐藥。另外，由于四環(huán)素類抗生素除了常見的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及厭 氧菌外，多數(shù)立克次體屬、支原體屬、衣原體屬、非典型分枝桿菌屬、螺旋體也對(duì)本藥敏感。 對(duì)革蘭陽性菌的作用優(yōu)于革蘭陰性菌，但腸球菌屬對(duì)其耐藥。其他如放線菌屬、炭疽桿菌、 單核細(xì)胞增多性李斯特菌、梭狀芽孢桿菌、奴卡菌屬等對(duì)本藥敏感。對(duì)淋病奈瑟菌具一定抗 菌活性，但耐青霉素的淋球菌對(duì)四環(huán)素也耐藥。對(duì)弧菌、鼠疫桿菌、布魯菌屬、彎曲桿菌、耶 爾森菌等革蘭陰性菌抗菌作用良好，對(duì)銅綠假單胞菌無抗菌活性，對(duì)部分厭氧菌屬細(xì)菌具 一定抗菌作用。四環(huán)素類抗生素對(duì)惡性腫瘤、囊腫、頑固性胸腔積氣、積液、支氣管胸膜瘺、 急性痘瘡樣苔蘚樣糠疹等有相應(yīng)的療效，常常使用四環(huán)素類及其他類別抗生素的聯(lián)合用藥 方案，另外，近年來發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素局部注射治療嬰兒乳糜胸、癌性心包積液、鞘膜積液、食管 靜脈曲張出血等，亦有良好的效果。此外，四環(huán)素類抗生素藥除用于醫(yī)療，還應(yīng)用于生物科 學(xué)研究、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和食品工業(yè)等方面，而且在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)中非治療用途的抗生素類 藥，稱為抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑。
[0005] 近30年來，由于大量治療用抗生素在臨床的不合理應(yīng)用，臨床疾病相關(guān)細(xì)菌的耐 藥性不斷增加，引起正常菌群失調(diào)和大量耐藥菌株出現(xiàn)。耐藥菌能夠承受住抗生素藥物的 攻擊，這樣一來標(biāo)準(zhǔn)的治療就失去了效果，感染持續(xù)存在并可傳染他人?？股啬退幮允怯?使用抗生素藥物，特別是對(duì)抗生素藥物的不當(dāng)使用造成的，當(dāng)細(xì)菌發(fā)生突變或獲得耐藥基 因時(shí)，就產(chǎn)生了耐藥性。四環(huán)素類藥物在臨床中的廣泛應(yīng)用使得越來越多的產(chǎn)生了對(duì)該類 抗生素耐藥的菌株，導(dǎo)致臨床治療失敗。另外，因?yàn)樵谛竽琉B(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用四環(huán)素類抗生 素的情況非常普遍，不僅動(dòng)物、禽類及魚類體內(nèi)殘留的抗生素會(huì)轉(zhuǎn)移到人體，它們體內(nèi)產(chǎn)生 的耐藥菌和耐藥基因也會(huì)傳播給人類。這樣就需要一種能方便快捷的檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的方 法，從而來及早發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)菌，進(jìn)而改變用藥方案，指導(dǎo)臨床治療。
[0006] 耐藥性的檢測(cè)可以分為常規(guī)表型檢測(cè)（即藥敏試驗(yàn)）和耐藥基因型檢測(cè)。常規(guī)藥 敏試驗(yàn)首先需要通過培養(yǎng)的方法從臨床標(biāo)本中分離到菌株，而許多生長(zhǎng)較慢和不易培養(yǎng)的 細(xì)菌，是無法通過常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)其耐藥性的。在過去的20年，為適應(yīng)臨床需要，以DNA 探針和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)為基礎(chǔ)的分子手段檢測(cè)耐藥基因取得了很大進(jìn)展，其中部分方 法已被美國食品和藥品管理局（FDA)批準(zhǔn)用于臨床工作。從最初的定性PCR和電泳到后期 的基因芯片等技術(shù)都可以檢測(cè)細(xì)菌抗生素相關(guān)耐藥基因，但定性PCR及電泳法具有容易污 染、操作繁瑣等缺陷，基因芯片技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)耐藥基因，但成本也非常高，操作復(fù)雜， 所需時(shí)間長(zhǎng)，不適宜臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0007] 實(shí)時(shí)突光定量 PCR 技術(shù)（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 簡(jiǎn)稱Real Time PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系 中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì) 樣品中的DNA(或cDNA)進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量， 而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染、成本低廉等特點(diǎn)。目 前已有多種運(yùn)用定量PCR技術(shù)的試劑盒應(yīng)用于臨床疾病相關(guān)的病原體檢測(cè)、基因分型、突 變研究等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，提供一種靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的新型檢測(cè)試劑 盒，實(shí)現(xiàn)對(duì)常見細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因 tetA(P)、tetB(P)、tetCl、tetj、tetM、tetQ/P的快 速檢測(cè)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] 檢測(cè)細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因的引物，包括如下引物對(duì)：
[0011] ⑴擴(kuò)增tetA⑵耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO : 2所示；
[0012] ⑵擴(kuò)增tetB(P)耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO : 4所示；
[0013] ⑶擴(kuò)增tetCl耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO : 6所示；
[0014] ⑷擴(kuò)增tetj耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8 所示；
[0015] (5)擴(kuò)增tetM耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10 所示；
[0016] (6)擴(kuò)增tetQ/P耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :11和SEQ ID NO : 12所示；
[0017] 上述6對(duì)引物對(duì)在一次檢測(cè)中共同使用。
[0018] 上述檢測(cè)細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因的引物在制備檢測(cè)細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因的試 劑中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0019] 一種細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括如下試劑：
[0020] (I)PCR反應(yīng)液：該P(yáng)CR反應(yīng)液中含有DNA聚合酶、EvaGreen熒光染料、Mg2+、PCR反 應(yīng)緩沖液、dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP ;
[0021] ⑵引物混合液：將SEQ ID NO :1?10所示的10種引物混合，用雙蒸水溶解，每 條引物的濃度為lymol/L ;
[0022] (3)陽性對(duì)照：分別含有 tetA(P)、tetB(P)、tetCl、tetj、tetM、tetQ/P 耐藥基因 的六種細(xì)菌基因組DNA和大腸桿菌基因組DNA的水溶液；
[0023] (4)陰性對(duì)照：大腸桿菌基因組DNA的水溶液。
[0024] 其中，陽性對(duì)照中，每一種含耐藥基因的細(xì)菌基因組DNA濃度為IOng/ μ L，大腸桿 菌基因組DNA濃度為50ng/ μ L。
[0025] 其中，陰性對(duì)照中，大腸桿菌基因組DNA的濃度為IOOng/ μ L。
[0026] 上述細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)細(xì)菌四環(huán)素類耐藥基因中的應(yīng)用 也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0027] 有益效果：
[0028] (1)通過在NCBI的基因序列庫中比對(duì)多種菌及臨床隔離株四環(huán)素類耐藥基因 序列，在保守位點(diǎn)處設(shè)計(jì)的特異性引物，能夠?qū)εR床常見致病菌6種四環(huán)素類耐藥基因 tetA (P)、tetB (P)、tetCl、tetj、tetM、tetQ/P 進(jìn)行快速檢測(cè)。
[0029] (2)本發(fā)明提供的四環(huán)素類耐藥基因檢測(cè)試劑盒使用了一種穩(wěn)定性強(qiáng)、雙鏈結(jié)合 特異性高、對(duì)PCR反應(yīng)抑制小的EvaGreen熒光染料，提高了熒光定量PCR擴(kuò)增的特異性及 穩(wěn)定性。
[0030] (3)本發(fā)明所述的核酸序列和試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低 廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于輔助臨床快速診斷致病性細(xì)菌四環(huán)素類抗生素的耐藥情況，為 臨床治療提供參考依據(jù)。
【附圖說明】
[0031] 圖1為陽性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果圖。
[0032] 圖2為陰性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果圖。
[0033] 圖3為1例大腸桿菌四環(huán)素類抗生素耐藥基因檢測(cè)結(jié)果圖。
[0034] 圖4為1例肺炎克雷伯菌四環(huán)素類抗生素敏感基因檢測(cè)結(jié)果圖。
[0035] 圖中英文字母對(duì)應(yīng)的中文名稱為：
[0036] Cycles :循環(huán)數(shù)；Fluorescence :突光值；Amplification Curves :擴(kuò)增曲線； Select :選擇；Zoom :放大。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0038] 實(shí)施例1 :檢測(cè)細(xì)菌四環(huán)素類6種耐藥基因耐藥基因 tetA(P)、tetB(P)、tetCl、 tetj、tetM、tetQ/P的核酸序列。6對(duì)特異性引物委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合 成：
[0039] 擴(kuò)增tetA(P)耐藥基因的引物對(duì)：
[0040] F1(SEQ ID NO :1) :5，-GGAGTTTCAGGCTTTTTTGGCTTT-3，，
[0041] R1(SEQ ID NO ：2) ：5' -GGAGTTCTTTGGGATCGTTTTTGT-3;；
[0042] 擴(kuò)增tetB(P)耐藥基因的引物對(duì)：
[0043] F2(SEQ ID NO :3) :5，-CACAGAGGATAGAAGCAGGGGATA-3，，
[0044] R2(SEQ ID NO :4) :5，-GAA