本發(fā)明屬于飼料檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種飼料中110種藥物的篩查方法。
背景技術(shù)：
：自moore等(1946)首次報(bào)道，在飼料中添加抗菌藥物，能明顯提高肉雞的日增重。自此先后有60余種抗菌藥物應(yīng)用于畜牧業(yè)，在動(dòng)物疾病防治、提高飼料利用率、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)等方面發(fā)揮了重要作用。但隨著抗菌藥物的大量使用，特別是不科學(xué)地濫用，細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問(wèn)題日益突出，引起世界各國(guó)政府及業(yè)內(nèi)人士的高度重視。2006年，歐盟全面禁止了抗菌藥物飼料添加劑的應(yīng)用。我國(guó)是畜禽生產(chǎn)大國(guó)，在我國(guó)飼料生產(chǎn)過(guò)程中，使用抗菌藥物的現(xiàn)象十分普遍。化學(xué)工業(yè)學(xué)會(huì)和制藥工業(yè)學(xué)會(huì)2005年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年抗菌藥物原料生產(chǎn)量約為21萬(wàn)噸，其中有9.7萬(wàn)噸(占年總產(chǎn)量的46.1％)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。使用抗菌藥物的種類包括b一內(nèi)酰胺類的阿莫西林、氨基糖苷類的慶大霉素和新霉素、大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素、林可胺類的克林霉素等。有報(bào)道指出全球每年消耗的抗菌藥物總量中90％被用在食用動(dòng)物身上，且其中90％都只是為了提高飼料轉(zhuǎn)化率而作為飼料添加劑來(lái)使用。目前，飼料中使用抗菌藥物問(wèn)題主要是：1、在飼料中盲目、隨意用藥問(wèn)題突出。我國(guó)養(yǎng)殖戶(場(chǎng))缺乏科學(xué)養(yǎng)殖技術(shù)和獸醫(yī)知識(shí)，僅僅憑感覺(jué)用藥；2、過(guò)量、長(zhǎng)期使用抗菌藥物；3、使用禁用抗菌藥物現(xiàn)象時(shí)而發(fā)生；2000年以來(lái)，國(guó)家陸續(xù)公布了一些在畜禽生產(chǎn)中禁用的藥物。如農(nóng)業(yè)部2002年4月公布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》等。其中明文禁止氯霉素及其鹽、酯(包括琥珀氯霉素)及制劑在所有食品動(dòng)物作所有用途的使用。但在獸藥監(jiān)督檢查或養(yǎng)殖場(chǎng)中時(shí)而能夠看到，其使用依然禁而不止。4、人藥獸用現(xiàn)象依然存在?！东F藥管理?xiàng)l例》明令禁止人藥獸用。在生產(chǎn)中，由于獸藥抗菌藥物的品種較少，或人們擔(dān)心獸藥的質(zhì)量，往往使用醫(yī)用藥物。5、不按規(guī)定休藥期使用。休藥期的長(zhǎng)短與藥物在動(dòng)物體內(nèi)的消除率和殘留量有關(guān)，而且與動(dòng)物種類、用藥劑量和給藥途徑有關(guān)。國(guó)家對(duì)有些獸藥特別是藥物飼料添加劑都規(guī)定了休藥期，但是部分養(yǎng)殖戶(場(chǎng))使用含藥物添加劑的飼料時(shí)很少按規(guī)定休藥期執(zhí)行。由于上述原因，從而增加了細(xì)菌耐藥性的機(jī)會(huì)，直接或間接地危害了人類的身體健康，破壞了生態(tài)環(huán)境。因此，飼料的質(zhì)量安全是人類食品安全的基礎(chǔ)，建立飼料中抗菌類藥物快速有效的檢測(cè)方法是非常必要的。目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的藥物多殘留檢測(cè)方法主要有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等方法?，F(xiàn)存的檢測(cè)方法對(duì)單一種類藥物研究已相對(duì)較為成熟，藥物多殘留的檢測(cè)方法建立時(shí)需要考慮的因素較多，各藥物的物理化學(xué)性質(zhì)差異，前處理方法較為復(fù)雜，存在靈敏度低、藥物種類覆蓋面窄等缺點(diǎn)?；谒幬锒鄽埩艏夹g(shù)具有的特殊監(jiān)測(cè)和預(yù)警優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)，我國(guó)各科研單位也逐漸重視藥物多殘留檢測(cè)技術(shù)的研究。目前國(guó)內(nèi)同時(shí)測(cè)定畜產(chǎn)品中多殘留藥物并對(duì)其準(zhǔn)確定量的方法較為缺乏，因此急需建立一種同時(shí)測(cè)定多種藥物殘留的檢測(cè)技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種飼料中110種藥物的篩查方法，為飼料中添加殘留抗菌藥物提供了一種完整的檢測(cè)方法，豐富了國(guó)家行業(yè)殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，增加了抗菌藥物篩查技術(shù)手段，為國(guó)家飼料產(chǎn)品及綠色養(yǎng)殖提供安全保障。本發(fā)明的目的是以下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種飼料中110種藥物的篩查方法，具體包括以下步驟：所述的110種抗菌藥物為：(a)、大環(huán)內(nèi)酯類：泰樂(lè)菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、羅紅霉素、那他霉素、竹桃霉素、螺旋霉素i、吉他霉素；(b)、氟喹諾酮類：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、諾氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、麻保沙星、奧比沙星、氟甲喹、萘啶酸、西諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氟羅沙星；(c)、磺胺類：磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺異噁唑、苯?；前?、磺胺硝苯、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺噻唑；(d)、喹噁啉類：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；(e)、β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林、苯唑西林、氟氯西林、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻呋；(f)、林可胺類：林可霉素、克林霉素；(g)、四環(huán)素類：土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素；(h)、酰胺醇類：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；(i)、硝基呋喃類：呋喃唑酮、呋喃它酮；(j)、硝基咪唑類：奧硝唑、地美硝唑、異丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；(k)、抗球蟲(chóng)類：氯苯胍、氯羥吡啶；(l)、苯并咪唑類：非班太爾、氟苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、芬苯噠唑、奧苯達(dá)唑、奧芬噠唑、噻苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、甲苯達(dá)唑；(m)、β-受體激動(dòng)劑：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉貝特羅、班布特羅、噴布特羅、溴布特羅；(n)、鎮(zhèn)靜劑類：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、異丙嗪、賽拉嗪、奧沙西泮、硝西泮、地西泮、奮乃靜；(o)、抗病毒類：金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋；(p)、其他：甲氧芐啶、阿托品；(1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10mg，于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1mg/ml各標(biāo)準(zhǔn)貯備液；對(duì)于難溶藥物，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星加入少量0.1mol/lhcl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/lnaoh溶液，頭孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加適量二甲基亞砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；分別量取各標(biāo)準(zhǔn)貯備液1ml，于100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液；取混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液0.1ml，用乙腈+水混合液稀釋，制成1μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；(2)待測(cè)樣品的分析前處理：1)稱取2±0.02g試樣于50ml離心管中，加入6ml提取液，渦旋30s，振蕩提取10min，以8000r/min的速度離心5min，移取上清液于10ml離心管中；殘?jiān)?ml乙腈重復(fù)提取，離心后合并上清液，作為備用液；2)氨基固相萃取柱，用6ml乙腈活化，移取備用液過(guò)柱，收集流出液，用50％乙腈溶液定容至5ml，混勻，過(guò)0.22μm微孔尼龍濾膜；(3)數(shù)據(jù)庫(kù)建立：確定110種藥物的分子式和分子量，將110種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的總離子流圖，再把每種藥物的離子色譜圖提取出來(lái)，確定每種藥物的保留時(shí)間；將藥物的分子量和保留時(shí)間輸入msms分析系統(tǒng)，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行msms分析，得到各藥物的子離子掃描質(zhì)譜圖，并根據(jù)各藥物的碎片的斷裂機(jī)理和斷裂難度，確定各藥物的特征碎片離子；將各藥物的種類、名稱、分子式、保留時(shí)間和特征碎片離子信息匯總，建立110種藥物篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，如下表所示：表1數(shù)據(jù)庫(kù)(4)定性分析：1)對(duì)經(jīng)過(guò)步驟(2)所述方法處理的待測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，將得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，空白溶劑不能出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的離子峰，試樣的母離子及特征碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的一致，偏差均應(yīng)≤0.05da，試樣色譜峰的保留時(shí)間，應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致，容許偏差為±0.2min，母離子與碎片離子色譜峰的信噪比(s/n)都在3:1以上，信噪比以峰對(duì)峰(ptp)計(jì)算，全掃描光譜記錄時(shí)，試樣中特征碎片離子的相對(duì)豐度必須超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液參照的特征離子光譜豐度的10％，篩選出滿足定性條件的藥物，即為疑似陽(yáng)性樣品；2)對(duì)于疑似陽(yáng)性樣品，根據(jù)藥物的保留時(shí)間和分子量編輯msms方法，并采集數(shù)據(jù)，所得到的疑似物質(zhì)的子離子掃描質(zhì)譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的子離子掃描質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，在相同的條件和相近的濃度下，試樣中主要碎片離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度的允許偏差不超過(guò)下表規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物：表2主要碎片離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度的允許偏差所述步驟(3)和步驟(4)中的液相色譜分析條件為：采用watersuplctmbehc18色譜柱，2.1mm×100mm，1.7μm，有機(jī)相比例從初始的2％緩慢變化到95％，以保證所有藥物都能有效檢出，梯度洗脫程序見(jiàn)下表3：表3色譜梯度洗脫程序注：esi+：a：0.1％甲酸溶液；b：乙腈，梯度洗脫；esi-：a：水；b：乙腈，梯度洗脫；1為即時(shí)變化，6為線性變化。所述步驟(3)和步驟(4)中的質(zhì)譜分析條件如下表所示：表4離子源參數(shù)表5篩查質(zhì)譜方法參數(shù)注：亮氨酸腦啡肽實(shí)時(shí)在線分子量校正，分子量為556.2771(esi+)/554.2615(esi-)，掃描時(shí)間0.5s，掃描間隔10s。所述步驟(1)中乙腈和水的混合液的乙腈和水的體積比為1:1。所述步驟(2)中的提取液為乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的體積比為1:1。還包括對(duì)110種藥物的檢測(cè)限的測(cè)定，測(cè)定方法為：添加10μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液100μl于2g空白飼料中，經(jīng)提取后測(cè)定，藥物的信噪比s/n＞3，表明各藥物的檢測(cè)限為0.5mg/kg。本發(fā)明利用液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，高靈敏度的msms功能，能夠精確的測(cè)定出藥物中母離子與子離子，快速的判斷出添加的藥物成分。該方法應(yīng)用范圍廣泛，同時(shí)又建立了飼料中多種抗菌藥物的檢測(cè)方法，針對(duì)我國(guó)飼料行業(yè)添加多種抗菌藥物具有高效、準(zhǔn)確精密的檢測(cè)手段，目前屬于國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。本發(fā)明建立的篩查方法，大大提高了飼料行業(yè)中亂填亂加的現(xiàn)象，為檢測(cè)部門完善了更加精密準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，省去更多的時(shí)間，節(jié)省了大部分的實(shí)驗(yàn)耗材，對(duì)食品安全及人類健康生活有不可估量的貢獻(xiàn)。附圖說(shuō)明圖1是混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖(esi+)。圖2是恩諾沙星的提取離子色譜圖(esi+)。圖3是恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液子離子掃描質(zhì)譜圖。圖4是林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液特征碎片離子提取色譜圖。圖5是林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液母離子提取色譜圖。圖6是樣品1中林可霉素特征碎片離子提取色譜圖。圖7是樣品1中林可霉素母離子提取色譜圖。圖8是林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖9是樣品1中林可霉素二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖10是阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液特征碎片離子提取色譜圖圖11是阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液母離子提取色譜圖。圖12是樣品5中阿苯達(dá)唑特征碎片離子提取色譜圖。圖13是樣品5中阿苯達(dá)唑母離子提取色譜圖。圖14是阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖15是樣品5中阿苯達(dá)唑二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖16是互補(bǔ)的兩種或幾種固相萃取柱配合使用的思路的示意圖。圖17是carb和nh2配合使用時(shí)的流程示意圖。具體實(shí)施方式所述飼料為配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料。所述的110種抗菌藥物為：(a)、大環(huán)內(nèi)酯類(11種)：泰樂(lè)菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、羅紅霉素、那他霉素、竹桃霉素、螺旋霉素i、吉他霉素；(b)、氟喹諾酮類(17種)：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、諾氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、麻保沙星、奧比沙星、氟甲喹、萘啶酸、西諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氟羅沙星；(c)、磺胺類(20種)：磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺異噁唑、苯?；前贰⒒前废醣?、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺噻唑；(d)、喹噁啉類(4種)：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；(e)、β-內(nèi)酰胺類(8種)：氨芐西林、苯唑西林、氟氯西林、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻呋；(f)、林可胺類(2種)：林可霉素、克林霉素；(g)、四環(huán)素類(4種)：土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素；(h)、酰胺醇類(3種)：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；(i)、硝基呋喃類(2種)：呋喃唑酮、呋喃它酮；(j)、硝基咪唑類(5種)：奧硝唑、地美硝唑、異丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；(k)、抗球蟲(chóng)類(2種)：氯苯胍、氯羥吡啶；(l)、苯并咪唑類(9種)：非班太爾、氟苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、芬苯噠唑、奧苯達(dá)唑、奧芬噠唑、噻苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、甲苯達(dá)唑；(m)、β-受體激動(dòng)劑(8種)：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉貝特羅、班布特羅、噴布特羅、溴布特羅；(n)、鎮(zhèn)靜劑類(10種)：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、異丙嗪、賽拉嗪、奧沙西泮、硝西泮、地西泮、奮乃靜；(o)、抗病毒類(3種)：金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋；(p)、其他(2種)：甲氧芐啶、阿托品。1.標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10mg，于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1mg/ml各標(biāo)準(zhǔn)貯備液；對(duì)于難溶藥物，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星加入少量0.1mol/lhcl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/lnaoh溶液，頭孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加適量二甲基亞砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；分別量取各標(biāo)準(zhǔn)貯備液1ml，于100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液；取混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液0.1ml，用乙腈+水混合液稀釋，制成1μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。2.待測(cè)樣品的分析前處理：2.1取粉碎后的供試樣品，作為供試試樣。2.2常溫干燥貯存?zhèn)溆谩?.3提取液篩選及樣品提取2.3.1提取溶劑的選擇參考相關(guān)文獻(xiàn)，我們考察了乙腈、甲醇和水這三種較常用的溶液。分別比較了乙腈及甲醇不同比例水溶液進(jìn)行提取的效果，發(fā)現(xiàn)乙腈+水和甲醇+水作為提取液，藥物的提取效果都比較理想。但甲醇+水的沉淀效果較差，提取液渾濁難凈化，所以選用提取效率高并且沉淀效果好的乙腈+水作為提取液。在比較了不同比例乙腈水的回收率后，最終采用6ml水+乙腈(50+50,v/v)提取，殘?jiān)?ml乙腈重復(fù)提取。2.3.2稱取2g試樣(精確到0.01g)于50ml離心管中，加入6ml水+乙腈(50+50,v/v)，渦旋30s，振蕩提取10min，以8000r/min的速度離心5min，移取上清液于10ml離心管中。殘?jiān)?ml乙腈重復(fù)提取一次，離心，合并上清液，作為備用液。2.3.3凈化條件的確定根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下幾種凈化方案：1)提取液直接凈化除脂a.nh2柱：乙腈活化→上樣→收集過(guò)柱液→氮吹→定容。b.碳黑柱：二氯甲烷、甲醇活化→上樣→收集過(guò)柱液→氮吹→定容。c.氧化鋁柱(酸性、中性、堿性)：乙腈活化→上樣→收集過(guò)柱液→氮吹→定容。d.正己烷除脂。2)提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈?，加水溶解后過(guò)固相萃取柱凈化，洗脫液氮?dú)獯蹈珊蠖ㄈ葸^(guò)濾上機(jī)，考察凈化及保留效果。主要考察了max、mcx、hlb、scx、碳黑等常見(jiàn)固相萃取柱。處理方法如下：a.max：甲醇、水活化→上樣→水、甲醇淋洗→5％甲酸甲醇洗脫。b.mcx、scx：甲醇、水活化→上樣→水、甲醇淋洗→5％氨化甲醇洗脫。c.hlb:甲醇、水活化→上樣→水淋洗→甲醇洗脫。d.carb：二氯甲烷、甲醇、水活化→上樣→甲醇洗脫。3)由于這些萃取柱選擇性較強(qiáng)，而藥物的性質(zhì)差異很大，一種小柱不可能對(duì)所有藥物均有保留，因此我們考慮將互補(bǔ)的兩種或幾種固相萃取柱配合使用，思路如附圖16所示。例如，carb和nh2配合使用時(shí)的流程圖如附圖17所示。分別考察了正己烷除脂及固相萃取柱凈化等方法，由于正己烷與乙腈有一定的互溶性，故采用乙腈飽和正己烷進(jìn)行除脂，發(fā)現(xiàn)回收率較低，原因可能為基質(zhì)中干擾成分去除不完全，仍對(duì)檢測(cè)造成干擾，或者為在除脂過(guò)程中一部分目標(biāo)物溶入正己烷層，造成一定的損失。考察了scx柱、mcx柱、max柱及hlb柱對(duì)，由于各類藥物活性基團(tuán)不同，保留效果差異較大，如scx柱對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類回收率在64％～92％之間，但對(duì)磺胺類藥物卻沒(méi)有保留。分別考察了氨基柱，氧化鋁(中性、堿性和酸性)柱及碳黑柱對(duì)各藥物的回收率。結(jié)果表明，氧化鋁小柱對(duì)四環(huán)素和喹諾酮類藥物回收率極低，碳黑柱對(duì)喹諾酮類藥物收率較差，而氨基柱對(duì)蛋白質(zhì)有一定的保留，達(dá)到了凈化的目的，同時(shí)所有藥物均有較好的回收，能夠滿足實(shí)驗(yàn)的要求。最終確定凈化方法為：氨基固相萃取柱，用6ml乙腈活化，移取備用液過(guò)柱，收集流出液，用50％乙腈溶液定容至5ml，混勻，過(guò)0.22μm微孔尼龍濾膜。3.儀器參數(shù)設(shè)定3.1液相色譜參考條件色譜柱：watersuplctmbehc18柱，柱長(zhǎng)100mm，柱內(nèi)徑2.1mm，粒度1.7μm或相當(dāng)?shù)姆治鲋?。柱溫?0℃。流動(dòng)相：esi+：a相：0.1％甲酸溶液，b相：乙腈，梯度洗脫。esi-：a相：水；b相：乙腈，梯度洗脫。梯度洗脫程序見(jiàn)表3-1。流速：0.45ml/min。進(jìn)樣量：2μl。表3-1色譜梯度洗脫程序注：1為即時(shí)變化，6為線性變化。3.2質(zhì)譜分析條件由于涉及的藥物種類多，且藥物性質(zhì)差異大，不可能每種藥物都達(dá)到最佳檢測(cè)條件。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，最終確定離子源參數(shù)篩查質(zhì)譜方法參數(shù)，分別如表3-2、表3-3所示，在此條件下，大部分藥物都有較好的響應(yīng)。表3-2離子源參數(shù)表3-3飛行時(shí)間質(zhì)譜方法參數(shù)注：亮氨酸腦啡肽實(shí)時(shí)在線分子量校正，分子量為556.2771(esi+)/554.2615(esi-)，掃描時(shí)間0.5s，掃描間隔10s。4.數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：確定110種藥物的分子式和精確分子量，將各藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的總離子流圖，如圖1所示；再把每種藥物的離子色譜圖提取出來(lái)，確定每種藥物的保留時(shí)間，以恩諾沙星為例，提取結(jié)果如圖2所示；將藥物的分子量和保留時(shí)間輸入msms分析系統(tǒng)，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行msms分析，得到各藥物的子離子掃描質(zhì)譜圖，以恩諾沙星為例，恩諾沙星的子離子掃描質(zhì)譜圖如圖3所示，并根據(jù)各藥物的碎片的斷裂機(jī)理和斷裂難度，確定各藥物的特征碎片離子；將各藥物的種類、名稱、分子式、保留時(shí)間和特征碎片離子信息匯總，建立122中非處方藥物篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，如下表所示：表4-1數(shù)據(jù)庫(kù)5.對(duì)經(jīng)過(guò)步驟2所述方法處理的待測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定，進(jìn)樣順序?yàn)椋喝軇┛瞻走M(jìn)1針；標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)1針，其rsd<10％，確定系統(tǒng)是否在允許誤差之內(nèi)；溶劑空白進(jìn)1針；樣品1進(jìn)1針；溶劑空白進(jìn)1針；…………交替進(jìn)行；…………試劑空白進(jìn)1針；標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)1針；…………注：順序的任何調(diào)整應(yīng)有充分理由證明其合理性。6.定性分析和結(jié)果確證6.1定性分析將步驟5得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，空白溶劑不能出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的離子峰，試樣的母離子及特征碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的一致，偏差均應(yīng)≤0.05da，試樣色譜峰的保留時(shí)間，應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致，容許偏差為±0.2min，母離子與碎片離子色譜峰的信噪比(s/n)都在3:1以上，信噪比以峰對(duì)峰(ptp)計(jì)算，全掃描光譜記錄時(shí)，試樣中特征碎片離子的相對(duì)豐度必須超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液參照的特征離子光譜豐度的10％，篩選出滿足定性條件的藥物，即為疑似陽(yáng)性樣品。6.2結(jié)果確證對(duì)于疑似陽(yáng)性樣品，根據(jù)藥物的保留時(shí)間和分子量編輯ms/ms方法，并采集數(shù)據(jù)，所得到的疑似物質(zhì)的子離子掃描質(zhì)譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的子離子掃描質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，在相同的條件和相近的濃度下，試樣中主要碎片離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度的允許偏差不超過(guò)下表規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物：表6-1主要碎片離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度的允許偏差相對(duì)離子豐度(％)>50>20～50>10～20≤10允許的最大偏差(％)±20±25±30±507.實(shí)際樣品檢測(cè)用上述方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表7-1所示，陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖4-15。表7-1實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果樣品編號(hào)飼料名稱樣品來(lái)源檢出非處方成分1雞配合料養(yǎng)殖場(chǎng)林可霉素2雞濃縮料飼料企業(yè)未檢出3豬預(yù)混料養(yǎng)殖場(chǎng)未檢出4豬濃縮料養(yǎng)殖場(chǎng)未檢出5豬配合料飼料企業(yè)阿苯達(dá)唑8.檢測(cè)限的確定為了不引起儀器的污染，在樣品上機(jī)測(cè)定之前，對(duì)樣品至少稀釋1000倍后測(cè)定。由于注射液、溶液及可溶性粉經(jīng)提取液稀釋后，上機(jī)測(cè)定的溶液與標(biāo)準(zhǔn)品的溶液基本等同。因此，我們將各種藥物標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限定為本方法的檢測(cè)限。添加10μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液100μl于2g空白飼料中，經(jīng)提取后測(cè)定，藥物的信噪比s/n＞3，表明各藥物的檢測(cè)限為0.5mg/kg。9.回收率實(shí)驗(yàn)選擇空白配合飼料、濃縮飼料及預(yù)混合飼料樣品做為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)。在0.5mg/kg濃度進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。110種藥物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表9-1。表9-1添加回收率試驗(yàn)結(jié)果以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明整體構(gòu)思前提下，還可以作出若干改變和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12