一種銀杏葉片葉綠體蛋白質(zhì)的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及木本植物銀杏葉片葉綠體蛋白質(zhì)的提取方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 銀杏（GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬落葉喬木，素有植物界的"活化石"之 稱，是現(xiàn)有種子植物中最古老的裸子植物。中國是銀杏的故鄉(xiāng)，現(xiàn)有的銀杏資源約占世界銀 杏資源的70%以上。銀杏是一種集食用、藥用、保健、化妝、用材于一體的優(yōu)良經(jīng)濟樹種 [1]， 近年來，銀杏作為全國各地的重要綠化樹種也得到了廣泛的運用。由于銀杏是珍貴孑遺植 物，因此具有許多原始特性，是科學(xué)家們重點研宄的植物品種之一，受到不同科研工作者的 重視和研宄。
[0003] 在過去幾年里，亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)從一定程度上為蛋白質(zhì)的定位和功能研宄提供 了新的見解，葉綠體作為綠色植物中重要的細胞器之一具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，是植物通過光合 作用還原和同化二氧化碳、形成碳水化合物的場所，同時也是植物次生物質(zhì)代謝的場所，研 宄表明樹木光合作用的下降與其葉綠體蛋白結(jié)構(gòu)組分的變化有關(guān) [2]，因此葉綠體蛋白質(zhì)組 的研宄受到越來越多人的關(guān)注。
[0004] 雙向電泳（tow-dimensionalelectrophoresis, 2-DE)技術(shù)是將蛋白質(zhì)等電點和 分子質(zhì)量兩種特性結(jié)合起來進行蛋白質(zhì)分離的技術(shù)，具有較高的分辨率和靈敏度。2-DE技 術(shù)是研宄蛋白質(zhì)組的核心方法之一，已經(jīng)成為復(fù)雜體系中檢測和分析蛋白質(zhì)的一種強有 力的生化手段。近年來，2-DE技術(shù)在植物研宄中的應(yīng)用越來越多，而樣品制備是進行2-DE 的先決條件。在樣品制備中，增加處理步驟能改善電泳分析結(jié)果，但同時也能導(dǎo)致一些蛋 白質(zhì)的丟失。目前，針對植物組織蛋白質(zhì)的提取方法較多，但由于不同植物組織和器官所含 有的組成成分不同，從而導(dǎo)致提取方法有所不同，而且由于實驗?zāi)康牡牟煌崛》椒ㄒ矔?有所不同。因此，針對不同樣品不同組織或器官建立一套可靠而有效的蛋白質(zhì)提取方法是 2-DE分析成功的關(guān)鍵。
[0005] 由于銀杏葉片中蛋白質(zhì)的含量較低，且富含多酚、色素、多糖及碳水化合物等干 擾物質(zhì)會影響蛋白質(zhì)的提取的質(zhì)量 [3]。多酚類化合物通過氫鍵可與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致電 荷的異質(zhì)性和蛋白質(zhì)點的拖尾；色素也能造成蛋白質(zhì)點拖尾和電荷的異質(zhì)性；碳水化合物 則阻塞凝膠孔使部分蛋白質(zhì)沉淀，不僅延長等電聚焦時間，而且使可溶性蛋白質(zhì)的數(shù)量減 少，凝膠圖譜上出現(xiàn)橫縱條紋 [4]。由此可見，銀杏葉片葉綠體蛋白質(zhì)樣品的制備更加困 難。TCA-丙酮沉淀法作為目前蛋白質(zhì)提取最通用的方法，雖然操作步驟較為簡單，蛋白粗 提物的產(chǎn)量較高 [5]，但是在銀杏葉綠體蛋白質(zhì)提取時采用此法所得蛋白粉末的再溶解性較 差，樣品中雜質(zhì)殘留較多，2-DE圖譜背景模糊并會有明顯的條紋[6]。而當前對植物葉綠體 蛋白質(zhì)提取方法的研宄主要集中在水稻、擬南芥等草本植物 [7]，而銀杏作為珍貴孑遺木本 植物，其葉綠體蛋白質(zhì)提取的效率和質(zhì)量還不足以滿足其蛋白質(zhì)組學(xué)的研宄需要。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是提供一種銀杏葉綠體蛋白質(zhì)提取方法，該方法是采用銀杏葉片， 先制得葉綠體粗顆粒，再通過Percoll細胞分離液進行梯度離心，用特定的離心力，獲得完 整葉綠體。然后采用蛋白質(zhì)提取緩沖液溶解蛋白質(zhì)，再加入等體積的Tris-平衡酚抽提后 乙酸銨甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)。本發(fā)明可以有效的增加葉綠體蛋白質(zhì)提取的效率和純度。采 用本方法獲得的銀杏葉綠體蛋白質(zhì)可用于銀杏葉片及其他富含干擾物質(zhì)的木本植物材料 的蛋白質(zhì)組學(xué)分析時使用，提高了蛋白質(zhì)的溶解性及純度，2-DE圖譜背景清晰，可分辨的蛋 白質(zhì)點數(shù)多。
[0014] 與已公開發(fā)表的銀杏葉綠體提取方法相比，本方法所需的實驗條件更易滿足，不 需要使用超高速冷凍離心機提前混合Percoll且只需兩個Percoll梯度即能完成完整葉綠 體的提取。與傳統(tǒng)TCA-丙酮沉淀法提取葉綠體蛋白質(zhì)相比，本方法通過對離心時間、離心 速度、沉淀時間等操作步驟改進和蛋白提取緩沖液中增加適量去污劑TritonX-100等的方 式使提取的葉綠體蛋白質(zhì)所含干擾物質(zhì)明顯減少，純度更高，雙向電泳效果更好，2-DE圖譜 背景清晰，條紋影響較小，得到了更多數(shù)量的蛋白質(zhì)點，且蛋白點外觀圓滑清晰，聚焦情 況良好。
[0015] 本發(fā)明所述銀杏葉片葉綠體蛋白質(zhì)提取方法，包括以下主要步驟：
[0016] (1)采用經(jīng)24小時以上暗處理后耗盡淀粉粒的銀杏葉片10g;
[0017] (2)將葉片冰浴下用研缽碾碎，加入一定量的提取緩沖液研磨成漿后4層紗布過 濾，取濾液，所述提取緩沖液成分為：〇. 3M山梨醇，ImMMgCl2,50mMHEPES/KOH(pH7. 8)，2mM￡0丁六，0.04%巰基乙醇，0.1%?￥卩；
[0018](3)濾液于4°C，1500g離心lOmin進行沉積得葉綠體沉淀顆粒，并用用6ml分離緩 沖液懸浮，所述分離緩沖液成分為：〇. 3M山梨醇，ImMMgCl2,50mMHEPES/KOH(pH7. 8)，2mM EDTA；
[0019] (4)Percoll密度梯度液制備：用分離緩沖液分別配制40%和80%Percoll，由上 至下分別加入5ml的40%Percol和2. 5ml的80%Percoll，形成Percoll密度梯度液；
[0020] (5)將懸浮的葉綠體顆粒1ml加入到制好的Percoll密度梯度液的頂端，經(jīng)4°C， 6000g離心30min后。在80%和40%Percoll細胞分離液之間的分界面上收集完整葉綠 體，并用分離緩沖液清洗兩次，分離得到完整的葉綠體顆粒；
[0021] (6)將1. 5ml蛋白質(zhì)提取緩沖液加入到由10g銀杏葉片所提取的葉綠體顆粒中， 室溫下漩渦混勻5min，加入等體積的Tris-平衡酚（pH8. 0)，超聲波混勻lOmin。所述蛋 白質(zhì)提取緩沖液成分為：l〇〇mMTris,lOOmMEDTA, 50mM硼砂，50mM維生素C，1 %Triton 父-100,2%巰基乙醇，30%蔗糖；
[0022] (7)混合液經(jīng)4°C，15000g離心15min后，將上層的酚相轉(zhuǎn)移到新離心管中；
[0023] (8)酚相中加入5倍體積的0? 1M醋酸銨（用80%甲醇配）溶液，放入-20 °C條件 下6小時以上以沉淀蛋白，后經(jīng)4°C，15000g離心15min得蛋白質(zhì)顆粒；
[0024] (9)蛋白質(zhì)顆粒重新懸浮，用冰凍的甲醇和丙酮各清洗兩次，每次清洗均經(jīng)4°C， 15000g離心5min