7。C、含C025v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天按照下列濃度加G418進行耐受性測試:200、400、600、800、1000、1200和1400 μδ/mL。保持各孔G418的濃度不變，每3天更換新鮮培養(yǎng)基。篩選到第7天時，引起細(xì)胞全部死亡的G418濃度作為MARC-145進行單克隆篩選的最佳藥物作用濃度。本發(fā)明篩選的最佳G418作用濃度為600 Pg/mL。
[0024]2.2 重組質(zhì)粒 pC1-pCD163 轉(zhuǎn)染 MARC-145 細(xì)胞
具體操作按Lipofectamine? 2000 (Invitrogen)說明書進行。轉(zhuǎn)染在6孔細(xì)胞板上進行，在轉(zhuǎn)染的前一天，消化MARC-145細(xì)胞，用10%的胎牛血清DMEM (不含抗生素)稀釋細(xì)胞，使其密度達(dá)到I X 14個細(xì)胞/mL，在6孔細(xì)胞板上每孔接種2.5 mL，于37。C、含C025v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在滅菌的1.5 mL的離心管中先加入500 μ?,37。C預(yù)熱的OPT1-MEM無血清培養(yǎng)基，然后加入1.0 μg的重組質(zhì)粒pC1-p⑶163，輕輕混勻；在另一個滅菌的1.5mL的離心管中先加入500 μ?,37 ° C預(yù)熱的OPT1-MEM無血清培養(yǎng)基，然后加入2.5 μ?Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勾，在室溫放置5 min ;然后將兩個1.5 mL的離心管中的液體混勻在一起，室溫放置20 min ;從CO2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，棄去上清，把液體混合物輕輕加入到細(xì)胞面上，然后立即把細(xì)胞板放入0)2培養(yǎng)箱中；溫育6 h后，吸掉上清，輕輕加入2.0 mL 37 ° C預(yù)熱的含10%的胎牛血清DMEM，放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)未轉(zhuǎn)染的MARC-145細(xì)胞對照。
[0025]2.3 pCD163-MARC 細(xì)胞系的篩選
轉(zhuǎn)染24小時后，在培養(yǎng)基中加入600 Pg/mL G418，每3天更換新鮮培養(yǎng)基。篩選到第7天時，對照未轉(zhuǎn)染的MARC-145細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染pCI_pCD163的MARC-145細(xì)胞出現(xiàn)存活的抗性細(xì)胞克隆。挑取單克隆抗性細(xì)胞并擴大培養(yǎng)，長成單層后消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，測定細(xì)胞數(shù)量，有限稀釋法稀釋細(xì)胞，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使得每個孔細(xì)胞數(shù)量為1- 2個，于37。C、含C025v%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次新鮮的600 Pg/mL G418的生長液。長成單層后消化細(xì)胞再進行亞克隆，如此進行3次細(xì)胞亞克隆。然后將得到的單克隆細(xì)胞株擴大培養(yǎng)，進行鑒定。
[0026]3.pCD163-MARC 細(xì)胞系的鑒定
3.1 IFA鑒定
分別將篩選到的P⑶163-MARC細(xì)胞和對照MARC-145細(xì)胞鋪入含有載玻片的24孔板，于37。C、含0)254的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 ho 30 h后，加入與原培養(yǎng)液等體積的預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定，4。C作用45 min, PBS洗滌3次，每次5min ；加入0.2% TritonX-1OO通透15 min ;然后取出載玻片，加入1:600稀釋的小鼠抗pCD163的單克隆抗體，37 ° C作用45 min，PBS洗3次，每次5 min ;加入1:600稀釋的Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)的二抗，37 ° C孵育45 min, PBS洗滌3次，每次5 min ；然后將載玻片置于含有60%甘油、0.1%疊氮鈉的PBS的長的載玻片上，用指甲油封邊。于熒光顯微鏡下觀察，記錄結(jié)果。結(jié)果見圖3。篩選到的PCD163-MARC細(xì)胞系呈現(xiàn)較亮的綠色熒光，而對照MARC-145細(xì)胞熒光較淡，說明P⑶163蛋白在p⑶163-MARC細(xì)胞系的表達(dá)量明顯高于對照MARC-145細(xì)胞。
[0027]3.2 Western blot 鑒定
分別將篩選到的P⑶163-MARC細(xì)胞和對照MARC-145細(xì)胞鋪入6孔板，于37。C、含0)254的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h? 30 h后棄去培養(yǎng)液，加入與原培養(yǎng)液等體積的預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，將6孔板置于冰上，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30 min后，4。C 12000 rpm離心10 min。取上清液與上樣緩沖液混合后煮沸10分鐘。將制得的樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳后，參照B1-Rad公司半干轉(zhuǎn)印儀操作說明進行電轉(zhuǎn)印，然后進行免疫檢測。將麗春紅染色后的NC膜轉(zhuǎn)移至封閉液中，室溫輕搖I h后4 ° C封閉過夜；傾去封閉液，用洗滌液TBST洗膜5次，每次5 min，然后加入1:5000稀釋的小鼠抗P⑶163的單克隆抗體，室溫下振蕩I h ;再用TBST洗膜5次，每次5 min,然后加入以封閉液1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，室溫振蕩I h ;再用TBST洗膜5次，每次5 min，最后用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(Supersignal?West Pico Trial Kit)進行顯色，在X膠片上曝光、顯影和定影觀察。
[0028]試驗同時設(shè)立β-actin對照，一抗為β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司)，二抗為1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP。
[0029]檢測檢測結(jié)果見圖4，從圖中可以看到，P⑶163得到了正確的表達(dá)，分子量約120kD。本發(fā)明的P⑶163-MARC細(xì)胞系中p⑶163蛋白表達(dá)量明顯高于對照MARC-145細(xì)胞。經(jīng)過B1-Rad ChemiDoc XRS System分析，pCD163_MARC細(xì)胞系中pCD163蛋白表達(dá)量約為對照MARC-145細(xì)胞中⑶163蛋白表達(dá)量的8.7倍。將篩選到的p⑶163-MARC細(xì)胞系傳至20代，通過檢測發(fā)現(xiàn)均可穩(wěn)定高效表達(dá)PCD163，各代次之間表達(dá)量無差異。
[0030]3.3 pCD163-MARC和對照細(xì)胞增殖PRRSV的生長曲線測定
將pCD163-MARC細(xì)胞與對照細(xì)胞同時感染1M0I的PRRSV經(jīng)典株SD-1株(GenBank No:AY747596)和高致病性毒株 SD-JN株(GenBank No: FJ422123)，分別于 24 h、48 h、72 h、96h和120 h取樣，測定TCID5tl，繪制兩株病毒的一步生長曲線。檢測結(jié)果見圖5(A)和(B)，兩株病毒生長曲線趨勢相似，在96 11，在成0163-麻1^細(xì)胞的滴度最高分別為1\108_61'(:105(|/mL和 IX 108 3TCID5Q/mL，在對照細(xì)胞的滴度最高分別為 IX 108_°TCID5Q/mL 和 IX 17 7TCID5tl/mL, P⑶163-MARC細(xì)胞對兩株病毒的滴度相比較于對照細(xì)胞，有明顯提高。
[0031 ] 3.4 pCD163-MARC和對照細(xì)胞增殖PRRSV的RNA測定
將上述24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取的樣品，用TRIzol試劑提取病毒RNA，以oligo(^)12-18為引物進行反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為SYBR Green Real-time PCR的模板，測定樣品中的 PRRSV 的 RNA。
[0032]SYBR Green Real-time PCR 的引物序列為:
上游引物 N-Fwd: 5 ’ -AATAACAACGGCAAGCAGCAG-3 ’，
下游引物 N-Rev: 5 ’ -CCTCTGGACTGGTTTTGTTGG-3 ’。
[0033]反應(yīng)條件為:預(yù)變性95。C 2 min;然后進行40個循環(huán)，循環(huán)條件為95。C 15s,61。C I min。結(jié)果見圖6 (A)和(B)，pCD163_MARC細(xì)胞增殖的經(jīng)典株SD-1株和高致病性毒株SD-JN株P(guān)RRSV的RNA明顯高于對照細(xì)胞。
[0034]4.pCD163-MARC 細(xì)胞系的應(yīng)用
4.1臨床樣品PRRSV的分離
將本實驗室2012.06-2014.06臨床上RT-PCR檢測陽性的PRRSV病料樣品120份同時接種pCD163-MARC細(xì)胞與對照細(xì)胞，盲傳5代，出現(xiàn)明顯CPE的判為分離到病毒，分離率分別為100%和85%，pCD163-MARC細(xì)胞明顯提高了 PRRSV分離率，更適合于臨床PRRSV的分離。
[0035]4.2 PRRS疫苗毒的初步生產(chǎn)
將P⑶163-MARC細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞擴大至轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，同時感染IMOI的廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司生產(chǎn)的PRRS疫苗JXAl-R株，96 h收毒，在p⑶163-MARC細(xì)胞的滴度為lX 108 5TCID5Q/mL，在對照細(xì)胞的滴度為I X 107 8TCID5(l/mL。pCD163_MARC細(xì)胞較對照細(xì)胞有更強的PRRS疫苗JXAl-R株的增殖能力，可以初步應(yīng)用于PRRS疫苗毒的生產(chǎn)。
[0036]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種表達(dá)豬P⑶163的細(xì)胞系，其特征是通過以下步驟得到的: 通過RT-PCR擴增獲得P⑶163受體基因，將其插入真核表達(dá)載體pC1-neo中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pC1-pCD163，將真核表達(dá)質(zhì)粒pC1-pCD163轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，通過G418進行抗性篩選，獲得單克隆細(xì)胞并擴大培養(yǎng)即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系，其特征在于RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因中使用的引物序列如下:pCD163-Fwd(ZAoI):5’ -ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，pCD163-Rev(AfoiI): 5’ -ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞系，其特征在于RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因中 PCR 反應(yīng)體系為 25 μ?，含 cDNA I μ?, Mg2+ 1.5 mmoL/L，dNTP 200 MmoL/L，1XLA PCRBuffer 2.5 μ?，pCD163_Fwd UXoI)和 pCD163_Rev OVoiI)各 400 nmoL/L，TaKaRa LA Taq 2U； 反應(yīng)條件為:預(yù)變性95。C 5 min ;然后進行35個循環(huán)，循環(huán)條件為95。C 45 s，61° C 45 S，72 ° C I min ;然后 72 ° C 延伸 10 min。
4.一種權(quán)利要求1-3中任一項所述的細(xì)胞系在臨床分離PRRSV病毒和生產(chǎn)PRRSV疫苗中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于將含有PRRSV的病料樣品接種至所述的細(xì)胞系，盲傳5代，出現(xiàn)明顯CPE的為分離到病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于將所述的細(xì)胞系感染PRRS疫苗株，培養(yǎng)若干小時后收毒，用于疫苗的生產(chǎn)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)中基因表達(dá)領(lǐng)域，特別涉及一種表達(dá)豬pCD163的細(xì)胞系，通過RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因，將其插入真核表達(dá)載體pCI-neo中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-pCD163，將真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-pCD163轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，通過G418進行抗性篩選，獲得單克隆細(xì)胞并擴大培養(yǎng)即得。所述的細(xì)胞系在臨床分離PRRSV病毒和生產(chǎn)PRRSV疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建的pCD163-MARC細(xì)胞系可以在病毒滴度較低的情況下快速、高效地增殖PRRSV，突破了PRRSV增殖率低的局限性；對臨床樣品的PRRSV分離率高，病毒增殖滴度高，更加適合于疫苗生產(chǎn)。
【IPC分類】A61P31-14, C12N5-10, A61K39-12, C12N7-00
【公開號】CN104593331
【申請?zhí)枴緾N201510027577
【發(fā)明人】杜以軍, 王金寶, 叢曉燕, 陳蕾, 齊靜, 孫文博, 吳家強, 陳智, 于江, 郭立輝, 任素芳
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月20日