一種用于畜禽飲水的地衣芽孢桿菌制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于添加劑制劑領(lǐng)域，涉及地衣芽孢桿菌益生菌的制劑工藝一一將液體發(fā) 酵的地衣芽孢桿菌制成用于畜禽飲水的液體或固體制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)被認為是對畜禽養(yǎng)殖高度有效的商業(yè) 產(chǎn)品之一，也是我國農(nóng)業(yè)部批準使用的主要益生菌品種之一。
[0003] 地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生多種酶類，具有較強的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同時還 可降解植物性飼料中復雜碳水化合物的酶，如果膠酶、葡聚糖酶、纖維素酶等，其中很多酶 是哺乳動物和禽類在體內(nèi)不能合成的酶，從而促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。
[0004] 地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的孢子是家禽飼料中可直接飼喂微生物中強有力的新型種類 之一。它可蒸汽制粒，可在腸道中生長，消耗氧氣，造成更有利原籍乳酸菌和雙歧桿菌的厭 氧環(huán)境，有利于這些原籍且能在腸黏膜生成菌落的有益細菌大量繁殖，產(chǎn)生有機酸，抑制病 原菌，從而保護畜禽腸道健康和改善禽畜生產(chǎn)性能。
[0005] 飼用地衣芽孢桿菌產(chǎn)品是以芽孢形式存在，對動物能發(fā)揮有益的作用，能在動物 消化道前部萌發(fā)成具有代謝活性的營養(yǎng)細胞，且具有能穩(wěn)定動物腸道微生物區(qū)系的能力， 消化道中地衣芽孢桿菌數(shù)量不斷增加能拮抗動物病原菌，維護和調(diào)節(jié)腸道生態(tài)平衡。
[0006] 飼用地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)如維生素、氨基酸、促生長因子等，參與機 體的新陳代謝，且能產(chǎn)生乳酸，可提高動物對鈣、磷、鐵的利用，促進維生素D的吸收。
[0007] 地衣芽孢桿菌的液體發(fā)酵工藝成熟，作為飼料添加劑已經(jīng)受到廣泛的應用并起到 良好的效果。然而，在養(yǎng)殖現(xiàn)場，常需在畜禽飲水系統(tǒng)中添加地衣芽孢桿菌，以提高畜禽養(yǎng) 殖效果。但是，由于常規(guī)地衣芽孢桿菌制劑輔料、發(fā)酵雜質(zhì)等過多，在畜禽飲水系統(tǒng)中添加， 會因為其中的雜質(zhì)沉積而堵塞飲水乳頭，嚴重時造成管道堵塞，因而不適宜于飲水添加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種地衣芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)工藝，克服常規(guī)發(fā) 酵過程中出現(xiàn)的底物過多、雜質(zhì)過多、無法進行畜禽飲水添加的問題，以達到養(yǎng)殖現(xiàn)場方便 使用的目的。
[0009] 本發(fā)明的一種用于畜禽飲水的地衣芽孢桿菌制劑的制備方法，包括液體制劑和固 體制劑的制備方法，其中，
[0010] 液體制劑的制備方法包括如下步驟：
[0011] la)取適量地衣芽孢桿菌接種于內(nèi)含培養(yǎng)基I的三角瓶中，于培養(yǎng)搖床內(nèi)培養(yǎng)，得 到一級種子；
[0012] 2a)取第一提取罐，并投入配制的培養(yǎng)基II，調(diào)節(jié)pH為7. 0后進行蒸煮，將蒸煮過 的液體靜置沉淀，將上層清液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵種子罐；
[0013] 3a)將步驟2a)的發(fā)酵種子罐內(nèi)上層清液進行高溫滅菌后，投入步驟la)的一級種 子，擴大培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌菌液；
[0014] 4a)取第二提取罐，并投入配制的培養(yǎng)基II，調(diào)節(jié)pH為7. 0后進行蒸煮，將蒸煮過 的液體靜置沉淀，將上層清液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐；
[0015] 5a)將步驟4a)的發(fā)酵罐內(nèi)上清液進行高溫滅菌后，投入步驟3a)的地衣芽孢桿 菌菌液，發(fā)酵培養(yǎng)直至芽孢轉(zhuǎn)化率達95 %以上后，停止發(fā)酵，鑒定地衣芽孢桿菌活菌數(shù)，并 調(diào)整pH為3. 5-4. 0,得到發(fā)酵液；
[0016] 6a)根據(jù)檢測含量和目標產(chǎn)物含量，確定稀釋比例，向步驟5a)的發(fā)酵液內(nèi)加注無 菌水，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾后生產(chǎn)成地衣芽孢桿菌水平為I. OX 101(lcfu/g的液體制劑；
[0017] 固體制劑的制備方法包括如下步驟：
[0018] Ib)取適量地衣芽孢桿菌接種于內(nèi)含培養(yǎng)基I的三角瓶中，于培養(yǎng)搖床內(nèi)培養(yǎng)，得 到一級種子；
[0019] 2b)取第一提取罐，并投入配制的培養(yǎng)基II，調(diào)節(jié)pH為7. 0后進行蒸煮，將蒸煮過 的液體靜置沉淀，將上層清液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵種子罐；
[0020] 3b)將步驟2b)的發(fā)酵種子罐內(nèi)上層清液進行高溫滅菌后，投入步驟Ib)的一級種 子，擴大培養(yǎng)得到地衣芽孢桿菌菌液；
[0021] 4b)取第二提取罐，并投入配制的培養(yǎng)基II，調(diào)節(jié)pH為7. 0后進行蒸煮，將蒸煮過 的液體靜置沉淀，將上層清液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐；
[0022] 5b)將步驟4b)的發(fā)酵罐內(nèi)上清液進行高溫滅菌后，投入步驟3b)的地衣芽孢桿菌 菌液，發(fā)酵培養(yǎng)直至芽孢轉(zhuǎn)化率達95%以上后，停止發(fā)酵，鑒定地衣芽孢桿菌活菌數(shù)，并調(diào) 整pH為3. 5-4. 0,得到發(fā)酵液；
[0023] 6b)將步驟5b)的發(fā)酵液用100目篩網(wǎng)過濾后得到清液，根據(jù)檢測量和固液 比，投入可溶性輔料混合后離心并濃縮，然后經(jīng)過噴霧干燥得到地衣芽孢桿菌水平為 2. OX 10ncfu/g的固體可溶性制劑。
[0024] 進一步的，所述步驟la)和步驟Ib)的地衣芽孢桿菌為保藏號為CGMCC No. 9385 的地衣芽孢桿菌，該地衣芽孢桿菌菌液含量為I. 5X 101(lcfu/g。
[0025] 進一步的，所述步驟la)和步驟lb)的培養(yǎng)基I為牛肉膏蛋白胨搖瓶培養(yǎng)基，為高 溫滅菌的pH為7. 0且內(nèi)含5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉的水基培養(yǎng)基；所述 培養(yǎng)搖床內(nèi)培養(yǎng)時間為16_20h。
[0026] 進一步的，所述步驟2a)和步驟2b)的培養(yǎng)基II為發(fā)酵培養(yǎng)基，為高溫滅菌的pH 為7. 0且內(nèi)含5g/L膨化豆柏、12g/L玉米粉、10g/L玉米淀粉、5g/L氯化鈣、10g/L酵母浸 膏、lg/L磷酸二氫鉀、0. 05g/L硫酸猛、I. 8g/L硫酸鎂、10g/L玉米衆(zhòng)、20g/L麩皮和lg/L豆 油的水基培養(yǎng)基。
[0027] 進一步的，所述步驟2a)、步驟4a)、步驟2b)和步驟4b)的蒸煮條件為溫度100°C， 時間l_3h，沉淀時間為3-5h。
[0028] 進一步的，所述步驟3a)和步驟3b)中投入一級種子時，發(fā)酵種子罐溫度為37°C， 罐壓為0. 01-0. 02Mpa ;所述擴大培養(yǎng)條件為溫度37-39 °C，時間18-20h，攪拌，通氣量 10-12m3/h〇
[0029] 進一步的，所述步驟5a)和步驟5b)中投入的地衣芽孢桿菌菌液為150L;投入 地衣芽孢桿菌菌液時，發(fā)酵罐溫度為37°C，罐壓為0. 01-0. 02Mpa ;所述培養(yǎng)條件為溫度 37-39°C，時間 16-24h，攪拌，通氣量 800-1000m3/h。
[0030] 進一步的，所述步驟la)和步驟lb)的三角瓶含量為5L，內(nèi)裝2L培養(yǎng)基I ;所述步 驟2a)和步驟2b)的第一提取罐容量為500L，內(nèi)裝300L培養(yǎng)基II ;所述步驟4a)和步驟 4b)的第二提取罐容量為20T，內(nèi)裝15T培養(yǎng)基II。
[0031] 進一步的，所述步驟6b)可溶性輔料為糊精；所述離心采用的容器為碟式離心機； 所述濃縮條件為濃縮至原體積的30-35% ;所述噴霧干燥為于噴霧干燥塔內(nèi)以進風口溫度 200-220°C，出風口溫度90-100°C進行噴霧干燥。
[0032] 進一步的，所述高溫滅菌條件為溫度121-128°C，時間30-35min。 本發(fā)明所用地衣芽孢桿菌菌液保藏號為：CGMCC No. 9385,單位為：中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，時間為：2014 年6月25日，名稱為：地衣芽抱桿菌Bacillus licheniformis。
[0033] 本發(fā)明的一種用于畜禽飲水的地衣芽孢桿菌制劑的制備方法制備的地衣芽孢桿 菌液體制劑和固體制劑具有較常規(guī)發(fā)酵生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌粉劑更好的水溶性及流動性； 且均可促進斷奶仔豬腸道中有益微生物（乳酸桿菌和雙歧桿菌）的生長和抑制有害微生物 (大腸桿菌）的繁殖，提高斷奶仔豬的生長性能，并控制腹瀉率。
【具體實施方式】
[0034] 為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0035] 本實施例的一種用于畜禽飲水的地衣芽孢桿菌制劑的制備方法，包括液體制劑和 固體制劑的制備方法，其中，
[0036]液體制劑的制備方法包括如下步驟：
[0037] la)取3g濃度為I. 5 X 101Qcfu/g的地衣芽孢桿菌菌液（保藏號為CGMCC No. 9385) 接種于內(nèi)含2L培養(yǎng)基I的5L三角瓶中，該培養(yǎng)基I為牛肉膏蛋白胨搖瓶培養(yǎng)基，為內(nèi)含 5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉的水基培養(yǎng)基，之后調(diào)節(jié)pH為7. 0并于121°C下 高溫滅菌30min，再放于培養(yǎng)搖床內(nèi)培養(yǎng)18h，得到一級種子；
[0038] 2a)取容量為500L第一提取罐，并投入配制的300L培養(yǎng)基II，該培養(yǎng)基II為發(fā) 酵培養(yǎng)基，為內(nèi)含5g/L膨化豆柏、12g/L玉米粉、10g/L玉米淀粉、5g/L氯化UlOg/L酵母 浸膏、lg/L磷酸二氫鉀、0. 05g/L硫酸猛、I. 8g/L硫酸鎂、10g/L玉米衆(zhòng)、20g/L麩皮和lg/L 豆油的水基培養(yǎng)基，之后調(diào)節(jié)pH為7. 0,升溫至100°C進行蒸煮2h，將蒸煮后的液體靜置沉 淀4h后，將上層清液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵種子罐；
[0039] 3a)將步驟2a)的發(fā)酵種子罐內(nèi)上層清液進行高溫滅菌（121°C )30min后，降溫至 37°C，控制罐壓為0. OIMpa，投入步驟la)得到的一級種子，于37°C下攪拌液體并保持通氣 量為IOm3A條件下擴大培養(yǎng)18h得到地衣芽孢桿菌菌液；
[0040] 4a)取容量為20T第二提取罐，并投入配制的15T培養(yǎng)基II，培養(yǎng)基II的配制方 法同步驟2a)，之后調(diào)節(jié)pH為7. 0,升溫至KKTC進行蒸煮2h，將蒸煮后的液體靜置沉淀4h 后，將上層清液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐；
[0041] 5a)將步驟4a)的發(fā)酵罐內(nèi)上清液進行121°C下高溫滅菌30min后，降溫至37°C， 控制罐壓為0. OIMpa，投入150L步驟3a)的地衣芽孢桿菌