一種基于石墨烯氧化物芯片dna解旋酶的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)檢測(cè)，尤其一種基于生物芯片的DNA解旋酶檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA解旋酶是一種蛋白質(zhì)，利用三磷酸腺苷(ATP)水解提供的能量打開(kāi)互補(bǔ)的核酸雙鏈，獲得單鏈，在DNA的復(fù)制、修復(fù)、重組以及轉(zhuǎn)錄等代謝過(guò)程都起著重要作用。它們常常依賴(lài)于單鏈的存在，并能識(shí)別復(fù)制叉的單鏈結(jié)構(gòu)。一般在DNA復(fù)制過(guò)程中起到催化雙鏈DNA解旋的作用，這在病毒復(fù)制以及細(xì)胞繁殖需要單鏈DNA的反應(yīng)中有著十分重要的作用，已被用于治療許多病毒性疾病，因此檢測(cè)DNA解旋酶的活性有著極其重要的意義。
[0003]目前存在的DNA解旋酶活性的檢測(cè)方法多數(shù)通過(guò)32P的標(biāo)記DNA鏈中的一條，通過(guò)凝膠電泳的方法來(lái)檢測(cè)，但這種方法成本較高、耗時(shí)、檢測(cè)的通量低。
[0004]2004年英國(guó)曼徹斯特大學(xué)的兩位科學(xué)家安德烈?海姆(Andre Geim)和康斯坦丁.諾沃肖羅夫(Konstantin Novoselov)首次制備出石墨稀，并獲2010年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)，受到了全世界研宄人員的關(guān)注。石墨烯的氧化物制備簡(jiǎn)單，成本比較低，表面有較多的功能基團(tuán)，如醛基、羧基等，在石墨烯氧化物表面固定FAM (羧基熒光素)標(biāo)記的雙鏈DNA時(shí)，當(dāng)DNA由雙鏈變?yōu)閱捂湑r(shí)，F(xiàn)AM與石墨烯氧化物表面的距離發(fā)生改變，石墨烯氧化物通過(guò)熒光諧振能量傳遞(FRET)能淬滅FAM熒光的程度不同，基于這個(gè)特點(diǎn)，通過(guò)FAM熒光強(qiáng)度的變化對(duì)DNA解旋酶活性進(jìn)行檢測(cè)。生物芯片是一種高通量的工具，利用石墨烯氧化物的特性，把生物芯片與石墨烯氧化物相結(jié)合，發(fā)展一種靈敏度較高的DNA解旋酶檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在不足，本發(fā)明提供了一種基于石墨烯氧化物芯片對(duì)DNA解旋酶的檢測(cè)方法，能低成本、高通量、高靈敏性對(duì)DNA解旋酶進(jìn)行檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的的。
[0007]一種基于石墨烯芯片的DNA解旋酶的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
(O制備具有氧化石墨烯點(diǎn)陣的玻片:
Iml石墨稀氧化物溶液(0.3 mg/ml)點(diǎn)在氨基修飾的玻片(長(zhǎng)76mm，寬25mm，厚Imm)上，干燥后，用超純水沖洗，在具有石墨烯氧化物點(diǎn)陣的玻片上，加入I ml含有0.6 nM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和6.0 nM的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)的混合物后在室溫下12h。
[0008](2)連接雙鏈DNA序列到具有石墨烯氧化物點(diǎn)陣的玻片:
一端氨基修飾另一端FAM標(biāo)記的單鏈DNA序列，與互補(bǔ)的單鏈DNA按照1:1的比例混合后，放置在雜交盒中和步驟(I)制備的玻片進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)12h，用PBS洗去多余的探針，掃描記錄玻片上DNA標(biāo)記的FAM熒光強(qiáng)度Fp
[0009](3) DNA解旋酶檢測(cè): ATP為10 mM時(shí)，將不同數(shù)量的DNA解旋酶加入到步驟(2)處理過(guò)的玻片上，作用30min以下，PBS沖洗，掃描記錄玻片上DNA標(biāo)記的FAM熒光強(qiáng)度F2。
[0010]本發(fā)明的機(jī)理為:加入不同數(shù)量的DNA解旋酶在不同作用時(shí)間通過(guò)對(duì)步驟(2)中雙鏈DNA的作用，在DNA解旋酶作用前后發(fā)生變化，引起FAM的熒光強(qiáng)度發(fā)生改變，通過(guò)FAM熒光強(qiáng)度的變化前后的比較，PBS沖洗后掃描和分析，從而對(duì)溶液中是否存在DNA解旋酶進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)DNA解旋酶作用后FAM熒光強(qiáng)度F2/DNA解旋酶作用前FAM熒光強(qiáng)度F1K值接近于O時(shí)，說(shuō)明溶液中存在DNA解旋酶。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明把石墨烯氧化物和微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合，能低成本、高通量、高靈敏性對(duì)DNA解旋酶進(jìn)行檢測(cè)。
[0012](2)本發(fā)明充分運(yùn)用生物芯片上互補(bǔ)雙鏈DNA與單鏈DNA上標(biāo)記的FAM，與石墨烯氧化物表面的距離不同，DNA解旋酶對(duì)雙鏈DNA作用后，F(xiàn)MA與石墨烯氧化物的距離發(fā)生改變，引起FAM的熒光強(qiáng)度變化，根據(jù)這個(gè)原理對(duì)DNA解旋酶進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)簡(jiǎn)單而且有效。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明的流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合附圖以及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0015](I)氨基修飾玻片的制備:在放有玻片的燒杯中加入5 ml過(guò)氧化氫(H2O2)，然后用移液管加入15 ml濃硫酸(H2SO4),在搖床上緩慢振蕩或靜置30 min使之
充分反應(yīng)，此反應(yīng)可使表面羥基化，倒掉上步反應(yīng)的液體，用去離子水清洗3次。先用無(wú)水乙醇清洗2次，然后倒入20 ml無(wú)水乙醇，反應(yīng)后的獲得的羥基化
硅片轉(zhuǎn)移到燒杯中，用無(wú)水乙醇清洗3次。清洗完成后倒掉乙醇，迅速加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和無(wú)水乙醇的混合液(體積比為1:15)，或者先加15ml無(wú)水乙醇，然后用移液管加I ml APTES，搖床上振搖反應(yīng)2 h。
[0016](2)石墨烯氧化物的制備:根據(jù)改進(jìn)的Hummer法，在三口燒瓶中，加入3g鱗片石墨粉、1.5 g NaN03與69 ml濃硫酸后放入恒溫水浴鍋中攪拌。反應(yīng)Ih后加入Ig KMnO4,35°C下反應(yīng)5個(gè)小時(shí)后加入150 ml去離子水。在溫度98°C下反應(yīng)30 min后，再加入50 ml的去離子水、5 ml H2O2以及250 ml的10%稀鹽酸，將溶液倒入1000 ml的大燒杯中，洗滌至PH值為5-6。
[0017](3)制備具有石墨烯氧化物點(diǎn)陣的玻片:1 ml石墨烯氧化物溶液(0.3 mg/ml)點(diǎn)在氨基修飾的玻片上，干燥后，用超純水沖洗。加入I ml EDCI (0.6 nM)和sulfo-NHS(6.0 nM)后在室溫下12ho
[0018](4)連接目標(biāo)雙鏈 DNA:合成 DNA 序列，5’-NH2-GAG CGG ATT ACTATA CTA CAT TAGMT TCC-FAM-3’，與 5’-GGA ATT CTA ATG TAG TAT AGT MT CCG CTC-3’，在濃度為 10 pmol下按照1:1比例的混合液，在含有50 mM三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)與50 mM氯化鈉(NaCl)的pH 8.0緩沖液中變性雜交2 h后，取0.6 ul液體滴加到I)制備的玻片表面，在雜交盒中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)12 h，并固定到石墨烯氧化物點(diǎn)陣上。
[0019](5) DNA解旋酶的檢測(cè):在含有0.5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)，10 mM三磷酸腺苷(ATP)，1.3 mM氯化鎂(MgCl2)及10%丙三醇溶液中加入10 nM的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒的DNA解旋酶進(jìn)行反應(yīng)30 min以下，一條單鏈DNA脫離具有氨基修飾的固定在石墨烯氧化物上的單鏈DNA，F(xiàn)MA與石墨烯氧化物的距離發(fā)生改變，引起FAM的熒光強(qiáng)度變化，從而使石墨烯氧化物對(duì)固定在表面單鏈DNA標(biāo)記的FAM的熒光發(fā)生淬滅，用PBS沖洗后，在掃描儀上于520 nm下掃描和分析，測(cè)量反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度F2/DNA解旋酶作用前FAM熒光強(qiáng)度F1比值接近于0，上述結(jié)果表明，DNA解旋酶能有效對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行解旋，進(jìn)一步測(cè)量對(duì)不同濃度DNA解旋酶在不同作用時(shí)間下FAM熒光強(qiáng)度減少的程度，可以反映DNA解旋酶的活性，從而對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒DNA解旋酶的進(jìn)行檢測(cè)。
[0020]所述實(shí)施例為本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，但本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠做出的任何顯而易見(jiàn)的改進(jìn)、替換或變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于石墨烯氧化物芯片DNA解旋酶的檢測(cè)方法，其特征在于:包括如下步驟: (O制備具有氧化石墨烯點(diǎn)陣的玻片； (2)—端氨基修飾另一端FAM標(biāo)記的單鏈DNA與互補(bǔ)的單鏈DNA變性雜交后，連接到具有石墨烯氧化物點(diǎn)陣的玻片上，反應(yīng)完成后洗滌，掃描記錄玻片上DNA標(biāo)記的FAM熒光強(qiáng)度F1; (3)DNA解旋酶檢測(cè): ATP為10 mM時(shí)，將不同數(shù)量的DNA解旋酶加入到步驟(2)處理過(guò)的玻片上，作用30min以下，PBS沖洗，掃描記錄玻片上DNA標(biāo)記的FAM熒光強(qiáng)度F2。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(I)是將Iml石墨烯氧化物溶液點(diǎn)在氨基修飾的玻片上，干燥后，用超純水沖洗，然后加入Iml EDCI和sulfo-NHS混合物后在室溫下12h。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述石墨烯氧化物溶液的濃度為0.3mg/ml ；EDCI溶液的濃度為0.6 nM ；sulfo-NHS溶液的濃度為6.0 nM。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(2)的具體方法為:一端氨基修飾另一端FAM標(biāo)記的單鏈DNA序列，與互補(bǔ)的單鏈DNA按照1:1的比例混合后，放置在雜交盒中和步驟(I)制備的玻片進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)12h，用PBS洗去多余的探針。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:當(dāng)DNA解旋酶作用后FAM熒光強(qiáng)度FJDNA解旋酶作用前FAM熒光強(qiáng)度F1比值接近于O時(shí)，說(shuō)明溶液中存在DNA解旋酶。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)檢測(cè)，尤其是一種基于石墨烯氧化物芯片的DNA解旋酶的檢測(cè)方法：本發(fā)明主要包括如下步驟：（1）制備具有氧化石墨烯點(diǎn)陣的玻片；（2）連接雙鏈DNA序列到具有石墨烯氧化物點(diǎn)陣的玻片：（3）DNA解旋酶的檢測(cè)：加入不同數(shù)量的DNA解旋酶在不同作用時(shí)間下，PBS沖洗后，進(jìn)行掃描和分析，通過(guò)FAM熒光強(qiáng)度的變化，進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明運(yùn)用石墨烯氧化物能淬滅單鏈DNA標(biāo)記的FAM上的熒光，DNA解旋酶對(duì)雙鏈DNA作用后，一條單鏈DNA脫離互補(bǔ)的固定在石墨烯氧化物上的單鏈DNA后，F(xiàn)AM與石墨烯氧化物表面的距離發(fā)生改變，引起FAM的熒光強(qiáng)度變化的特點(diǎn)，結(jié)合高通量的微陣列芯片技術(shù)，能低成本﹑高靈敏度地對(duì)DNA解旋酶進(jìn)行檢測(cè)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68, C12Q1-34
【公開(kāi)號(hào)】CN104611419
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410832817
【發(fā)明人】高力, 時(shí)海霞, 李琴, 李嬈祺, 周陽(yáng), 陳克平, 張春霞, 連超群
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2014年12月29日