植物油中動物源成分的lamp法檢測引物和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)中用LAMP法對動物DNA的檢測，特別涉及對多種動物所共有DNA序列檢測的引物和用這種引物對多種動物共有DNA序列檢測的方法。
[0002]
技術(shù)背景
[0003]檢測植物油中的動物源成分的意義在于我國是世界上食用植物油消費量最大國家，每年的消費總量大約是2500萬噸，廢棄油脂量逐年上升，有些不法商人在利益驅(qū)動下，將烹飪后的廢棄油(俗稱潲水油)經(jīng)加工后作為食用植物油銷售。據(jù)專家用年消費總量減去每年國內(nèi)食用植物油生產(chǎn)量和進口量推算，每年返回餐桌潲水油約有200-300萬噸之多，這還是比較保守的數(shù)字，因此不可低估潲水油重返餐桌的全國規(guī)模及其造成后果的嚴重性。對潲水油進行檢測鑒定是必須進行的一項公益性工作。目前，為進行此項工作，技術(shù)上的基本思路是:因純植物油理論上不含動物源性成分，而潲水油因已進行食品加工處理，理論上含有動物源成分，據(jù)此研究人員開發(fā)各種生物或理化檢測方法檢測植物油中的動物源性成分來判斷植物油中是否添加潲水油。
[0004]近年來，分子生物學(xué)先進檢驗技術(shù)開始應(yīng)用于潲水油鑒別判斷。潲水油通常是多種動、植物油脂的混合物，含有大量的動物油脂。因此可通過檢測植物油中動物DNA來推斷該植物油是否摻入潲水油。由于潲水油在精煉過程中，動物DNA會被嚴重降解，含量極低。研究表明，當肉加熱到100°C時DNA片段銳減到IlOObp左右，而加熱到120°C時減至600 bp以下。所以該法的關(guān)鍵之一在于開發(fā)高靈敏度的檢測技術(shù)方法。目前，研究人員主要采用PCR和熒光定量PCR技術(shù)進行植物油中動物源成分檢測，PCR技術(shù)方法的主要問題是:需較昂貴的檢測設(shè)備，熒光定量PCR儀市場價格40-50萬元；使用專用檢測設(shè)備熒光定量PCR儀的操作較復(fù)雜；PCR技術(shù)檢測的靈敏度稍顯不足，我們的實驗在10ml植物油中加入炒制的Ig動物肉，制成含動物源成分的植物油，使用熒光定量PCR方法無法檢出。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種能比PCR技術(shù)檢測動物源性成分費用更低、靈敏度更高的LAMP檢測方法所用的引物，以及用這個引物在含動物源成份的植物油中高靈敏度的檢測出動物源的檢測方法。
[0007]本發(fā)明所說的5種畜禽是牛、豬、羊、雞和兔。
[0008]本發(fā)明所說的動物肉含義是牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和兔肉的某一種，或者其混含物。
[0009]本發(fā)明所說的動物源含義是牛肉DNA、豬肉DNA、羊肉DNA、雞肉DNA和兔肉DNA的某一種，或者其混含物。本發(fā)明所說的動物源也可稱為動物源DNA。
[0010]用本發(fā)明的引物的作用是，使用分子生物學(xué)LAMP檢測方法，在植物油中如能檢測出動物源DNA，可以作為該植物油可能是潲水油的一個依據(jù)。
[0011]用本發(fā)明設(shè)計的LAMP引物與引物是同一個概念。
[0012]用本發(fā)明所述的DNA核苷酸序列與所述的DNA序列是同一個概念。
[0013]
本發(fā)明的引物設(shè)計思路是:選用5種畜禽DNA中都具有的、相同的DNA作為動物源DNA，該動物源DNA可代表所選用的5種畜禽DNA中的某一種，并還能代表這5種畜禽DNA的任意組合。該5種畜禽是牛、豬、羊、雞和兔。
[0014]本發(fā)明的LAMP技術(shù)也是LAMP法的含義，也就是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(loop-mediatedisothermal amplificat1n,)簡稱 LAMP 技術(shù)或 LAMP 法。
[0015]本發(fā)明的引物設(shè)計技術(shù)概述:選用5種畜禽DNA中都具有的、并且對于這5種畜禽是高度保守的16S rRNA DNA序列中的片段作為靶基因序列，即在5種畜禽的16S rRNA DNA序列中選取了保守性最好、引物用于LAMP法檢測操作誤差小、引物對靶基因檢測靈敏度高的16S rRNA DNA序列中的片段作為引物技術(shù)設(shè)計的靶基因序列。達到所設(shè)計的引物能代表5種畜禽中任何一個畜禽16S rRNA DNA存在，而16S rRNA DNA又能代表有5種畜禽肉的目的。
[0016]本發(fā)明的引物設(shè)計原理如下:
(I)選取16S rRNA DNA作為靶基因序列:因食用肉種和動物油脂來源大部分為畜禽，檢測的DNA祀基因序列應(yīng)在聞等動物中具有各種易于檢測的特點。線粒體DNA是聞等動物唯一的核外遺傳物質(zhì)，所有組織細胞中均含有大量的線粒體，因此可以獲得大量的線粒體DNA。本發(fā)明中，我們選擇了 5種畜禽線粒體DNA中都具有的、并且在這5種畜禽DNA序列中高度保守的16S rRNA DNA序列作為靶基因序列。
[0017](2)靶基因序列的獲取:按當前生物基因組數(shù)據(jù)的獲取通用方法，即通過NCBI(Nat1nal Center for B1technology Informat1n,美國國立生物技術(shù)信息中心)管理的GENEBANK數(shù)據(jù)庫進行查詢，所獲序列都是對全世界公開的，研究人員都可以無償獲取使用。在GENEBANK網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫選取了豬，牛，羊，雞和兔5種畜禽的16S rRNA DNA序列中共有的序列片段，作為靶基因序列。即可以選用5種畜禽中任何一個動物的16S rRNA DNA序列中我們確定的靶基因序列作為本發(fā)明引物設(shè)計之用，并且用任何一個動物的靶基因序列為基礎(chǔ)都可設(shè)計出本發(fā)明提供的引物。
[0018](3)選擇引物的基礎(chǔ)DNA核苷酸序列:由于16S rRNA DNA序列相當保守，我們選取豬，牛，羊，雞和兔任何一種動物的16S rRNA DNA序列作為引物設(shè)計之用。具體設(shè)計引物時，我們選取16S rRNA DNA序列中保守性最高的、并且LAMP法檢測效果最好的一段DNA作為設(shè)計引物的基礎(chǔ)DNA，本發(fā)明的引物的基礎(chǔ)DNA核苷酸序列如下:
Tgatccaaaattttgatcaacggaacaagttaccctagggataacagcgcaatcctgttctagagttcctatcgacaatagggtttacgacctcgatgttggatcaggacacccaaatggtgcaaccgctattaaaggttcgtttgttcaacgattaaagtcctacgtgatctgagttcagaccggagcaatccaggtcggtttctatctatttataatttctcccagtacgaaaggacaagagaaatgggo
[0019](4 )設(shè)計LAMP引物:用上述(3 )中引物的基礎(chǔ)DNA核苷酸序列為依據(jù)，用現(xiàn)有引物設(shè)計技術(shù)，設(shè)計出本發(fā)明的LAMP引物即本發(fā)明的引物。
[0020]按LAMP反應(yīng)原理，每次LAMP反應(yīng)需4個單獨引物同時反應(yīng)，這4個單獨引物作為一個引物組，即每組LAMP引物為4個單獨引物，本發(fā)明的引物組中4個單獨引物代號是:B3, F3, BIP, FIP0
[0021]設(shè)計引物時，B3, F3，BIP, FIP引物5’和3’最開始的一個堿基保證在5個物種中都是保守的；引物中5’ dG和3’ dG盡量小于-4.00。本發(fā)明的LAMP引物組中，4個單獨引物核苷酸序列如下:
F3: CCTATTCAAGAGTCCATATCGAB3:TTCTCTTGTCCTTTCGTACT
FIP:GAACCTTTGATAGCGGTTGCAC-ATAGGGTTTACGACCTCGABIP:GTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGA-CAGATAGAAACCGACCTGG。
[0022]
用本發(fā)明的LAMP引物組檢測植物油中是否含有動物源成分的檢測方法如下:
步驟1、樣品制備5種畜禽混合肉末:市場上購買新鮮的牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和兔肉各100g，用天平稱取豬肉20g，雞肉20g，牛肉20g，羊肉20g和兔肉20g混合裝入燒杯I中。將燒杯I中的肉全部倒入絞肉機中絞碎混勻，直至所有的肉絞成肉末狀并混合均勻，將絞肉機中的所有肉末裝入燒杯2中，燒杯2中的混合肉末即為5種畜禽混合肉末。
[0023]所述植物油是純玉米油、純花生油或純菜籽油的某一種。
[0024]步驟2、提取對照組植物油中的DNA (作為空白對照樣品之用):購買柱式植物油DNAout試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)；該柱式植物油DNAout試劑盒組成:溶液A，離心吸附柱，通用洗柱液(用于洗去非DNA物質(zhì))，通用洗脫液(用于獲得DNA);提取DNA的步驟如下:
A.在1.5mL離心管I中加入0.2mL購買的植物油；
B.在1.5mL離心管I中加入0.6mL溶化狀態(tài)的溶液A，植物油和溶液A在室溫條件下混合振蕩3-5min，獲得植物油和溶液A的混合液；
C.將B步驟的全部混合液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置2min，使離心吸附柱充分吸附混合液；
D.把收集管套在離心吸附柱的下面；將已充分吸附混合液的離心吸附柱放入離心機，用離心機轉(zhuǎn)速為12000g —15000g條件將其離心lmin，離心機停止后，植物油和溶液A的混合液被分離出穿透液，穿透液在收集管中，取下收集管，去掉收集管中的穿透液；
E.再把收集管套在離心吸附柱的下面；向離心吸附柱中加入0.SmL通用洗柱液，離心機轉(zhuǎn)速為12000g-15000g室溫離心lmin,去掉收集管中的穿透液；
F.再把收集管套在離心吸附柱的下面；離心機轉(zhuǎn)速為12000g-15000g室溫離心30秒，去掉收集管中的穿透液；
G.在離心吸附柱的濾膜中部加入30uL通用洗脫液，然后將離心吸附柱套在一個
1.5mL離心管2中，室溫放置2min，使通用洗脫液充分溶解吸附柱中的DNA ；
H.把裝有離心吸附柱的離心管2放入離心機，離心機轉(zhuǎn)速為12000g-15000g室溫離心lmin, 1.5mL離心管2中收集物為植物油的DNA樣品。
[0025]
步驟3、制作含動物源成分的植物油樣品