一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?br> 【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?，屬于生物傳感器制備領(lǐng)域。本發(fā)明第一步為多壁碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合材料及0.5%Nafion溶液的制備：以多壁碳、二氧化錫、殼聚糖為原料，利用多壁碳-二氧化錫-殼聚糖復(fù)合材料的良好電化學(xué)氧化還原活性、好的生物相溶性以及高度的化學(xué)穩(wěn)定性，修飾工作電極以促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移；第二步為乙酰膽堿酯酶和多壁碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合膜共同修飾電極的酶?jìng)鞲衅髦苽洹１景l(fā)明的乙酰膽堿酯酶生物傳感器，檢測(cè)時(shí)間較短，靈敏度高，選擇性、穩(wěn)定性好，再生能力好，回收率符合要求。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒ā炯夹g(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明提供一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?，屬于生物傳感器制?領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]近年來(lái)，農(nóng)藥殘留引起的中毒事件屢屢發(fā)生，果蔬中的有害、劇毒農(nóng)藥的殘留問(wèn)題 一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，也是現(xiàn)今中國(guó)加入WTO后，農(nóng)產(chǎn)品出口遭遇“綠色壁壘”的主要影 響因素之一。隨著我國(guó)人民生活水平不斷提高，農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注，尤 其果品、蔬菜中農(nóng)藥殘留問(wèn)題已經(jīng)成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。全國(guó)每年都有上百起因食用被農(nóng) 藥污染的農(nóng)產(chǎn)品而引起的急性中毒事件，嚴(yán)重影響廣大消費(fèi)者的身體健康，因此由農(nóng)藥殘 留超標(biāo)導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題，已越來(lái)越受到各國(guó)政府和公眾的重視。有機(jī)磷農(nóng)藥是我國(guó)應(yīng) 用最為廣泛的一類農(nóng)藥，其中毒死蜱是目前全世界生產(chǎn)和銷售量最大的殺蟲劑品種之一。 毒死蜱是高效中毒的廣譜殺蟲劑兼除草劑，具有一定的內(nèi)吸性，可以通過(guò)食物鏈的富集作 用轉(zhuǎn)移至人體，對(duì)人體具有潛在致癌作用?？梢?，加強(qiáng)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)對(duì)保護(hù)生 態(tài)環(huán)境，尤其是保障人類健康有著十分深遠(yuǎn)的意義，其中毒死蜱一直是環(huán)境和食品中農(nóng)藥 殘留檢測(cè)的重要項(xiàng)目。[0003]傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有:氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/ 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/LC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯(lián)免疫法(ELISA)。這些方法 雖然選擇性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢出限低，可同時(shí)檢測(cè)多種元素或化合物，但其需要昂 貴的儀器設(shè)備，樣品前處理過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)，并且對(duì)分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。常用的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法有酶抑制法(酶抑制試紙法和酶抑制分光光 度法)，可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有較好的實(shí)用價(jià)值。但是，速測(cè)卡是通過(guò)肉 眼觀察卡片的顏色變化，因此一般只能用于嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜樣品的定性測(cè)量。酶抑制分光 光度法的原理是基于吸光度的變化進(jìn)行檢測(cè)的，但蔬菜水果中大量的色素會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果 的準(zhǔn)確度。并且上述方法存在回收率低、錯(cuò)檢、漏檢比例較高、重復(fù)性差、難以滿足低殘留和 定量檢測(cè)的要求等缺點(diǎn)。酶?jìng)鞲衅魇抢糜袡C(jī)磷的毒理性原理所研制的傳感器，與傳統(tǒng)的 分析方法相比，它具有特異性強(qiáng)、分析速度快、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。酶?jìng)鞲衅鞯年P(guān)鍵 是酶的固定技術(shù)，酶的固定技術(shù)包括酶的固定方法和固定酶的載體材料。其直接影響生物 分子的固定化、酶?jìng)鞲衅鞯姆€(wěn)定性和靈敏度等主要性能。[0004]發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷以及操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢出限高的 檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?。[0005]其技術(shù)方案為:一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒ǎ涮卣髟谟? 電流型酶?jìng)鞲衅鞯拿舾薪缑娼M成包括由多壁碳、二氧化錫、殼聚糖制備的納米復(fù)合膜和0.5%Nafion保護(hù)膜，進(jìn)而固定酶的技術(shù)。[0006]所述的一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?，其特征在?金電極 (d=lmm)的清洗，酶?jìng)鞲衅髅舾薪缑娴臉?gòu)建及過(guò)程表征(制備多壁碳-二氧化錫納米復(fù)合材料并以殼聚糖作為分散劑進(jìn)行分散，利用多壁碳-二氧化錫的協(xié)同作用共同修飾電極)，酶 傳感器標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，酶?jìng)鞲衅餍阅艿臋z測(cè)，酶?jìng)鞲衅鲗?duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。[0007]所述的一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?，其特征在?實(shí)驗(yàn)條件的 優(yōu)化，主要包括酶滴加量、測(cè)試底液的PH以及農(nóng)藥抑制時(shí)間；酶?jìng)鞲衅餍阅軝z測(cè)包括重現(xiàn) 性、穩(wěn)定性、再生性以及酶?jìng)鞲衅鲗?duì)蔬菜樣品回收率的測(cè)定。[0008]其制備原理為:以乙酰膽堿酯酶的催化性為基礎(chǔ)的酶電化學(xué)傳感器是將乙酰膽堿 酯酶固定在金電極表面，催化底物乙酰硫代膽堿(ATCl)水解，產(chǎn)生具有電活性的巰基膽堿， 巰基膽堿可在金電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的電信號(hào)可轉(zhuǎn)化為電流，在一定條件下該電 流的大小可反映乙酰膽堿酯酶的活性。由于乙酰膽堿酯酶是一種以三個(gè)絲氨酸殘基聯(lián)體為 活性的酶，當(dāng)其中的任何一個(gè)氨基酸殘基遭到破壞時(shí)，將使酶喪失催化活性。有機(jī)磷農(nóng)藥與 乙酰膽堿酯酶作用能形成穩(wěn)定的磷?；憠A酯酶而破壞其氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，從而使乙酰膽 堿酯酶失去活性，降低催化乙酰硫代膽堿水解的能力。因此，在加入含有機(jī)磷農(nóng)藥的底物溶 液中，因部分酶活性被抑制導(dǎo)致其相應(yīng)電流減小。通過(guò)比較酶被抑制前后的電流信號(hào)的大 小，可對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行定性檢測(cè)。本發(fā)明采用以殼聚糖作為分散劑制備的多壁碳-二氧 化錫復(fù)合物和0.5%Naf ion溶液對(duì)金電極進(jìn)行修飾。多壁碳納米管(MWCNTs)擁有獨(dú)特的電 化學(xué)特性、較高的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，被廣泛用于酶?jìng)鞲衅髅舾薪缑娴闹谱?。殼聚?(CHIT)屬于多糖類，它具有優(yōu)異的成膜性、吸附性、透氣性和滲透性，成膜后具有很好的吸 附性、穩(wěn)定性和良好的生物相容性，其豐富的氨基、多孔性結(jié)構(gòu)使它被廣泛用于生物分子的 固定和修飾電極的制備。殼聚糖的氨基端連接二氧化錫，為酶在電極表面的固定提供了一 個(gè)良好的生物界面，保持了酶的生物活性以用來(lái)和農(nóng)藥進(jìn)行抑制反應(yīng)。此外，二氧化錫具有 較高的比表面積、穩(wěn)定性和導(dǎo)電性可以增大電極表面電子的傳導(dǎo)能力和生物相容性，進(jìn)而 增大酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)電流。采用本發(fā)明制成的電流型酶?jìng)鞲衅骺梢栽谑吖墒?、上市前，進(jìn) 行農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定，直接對(duì)農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，避免因食用含有殘留農(nóng)藥 的蔬果而引起中毒，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供殘留檢測(cè)的技術(shù)支撐。[0009]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅?制備方法，其特征在于:(1)酶?jìng)鞲衅髦苽淝奥憬痣姌O的清洗、活化和性能測(cè)試，如果測(cè)試 循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在120mV以下，氧化峰和還原峰對(duì)稱，則所述金電極可使用，否 則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求。(2)清洗好的裸金電極表面滴涂分散均勻的多 壁碳-二氧化錫-殼聚糖復(fù)合液，繼而修飾0.5%Nafion溶液，然后固定乙酰膽堿酯酶。酶 傳感器制備結(jié)束后，放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆?。[0010]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅?制備方法，其特征在于:(I)將上述制備好的酶?jìng)鞲衅髟诠ぷ鞯滓褐幸圆煌膾咚僮鲅h(huán) 伏安方法掃描，可以得到峰值和掃速的關(guān)系，得到是受擴(kuò)散控制的。(2)配置一系列的毒死 蜱標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到抑制率，進(jìn)一步得出上述制備的酶?jìng)鞲衅鞯臉?biāo)準(zhǔn)曲線、 檢測(cè)范圍和檢測(cè)限；(3)配置一系列經(jīng)?；旌鲜褂玫霓r(nóng)藥溶液，以檢測(cè)所制備酶?jìng)鞲衅鞯?選擇性；⑷通過(guò)循環(huán)伏安掃描多段驗(yàn)證上述酶?jìng)鞲衅鞯姆€(wěn)定性；(5)對(duì)實(shí)際果蔬樣品進(jìn)行 分析得出該酶?jìng)鞲衅鞯幕厥章?。[0011]本發(fā)明以具有良好的生物相容性和成膜性的殼聚糖作為分散劑分散多壁碳和二 氧化錫所制備成的多壁碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合物膜能夠促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)中電子的傳遞，提高電極上的響應(yīng)電流，改善電極表面的微環(huán)境，因而可以作為載體材料，用以制備 響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)和靈敏度高的酶?jìng)鞲衅鳎?.5%Nafion保護(hù)膜具有較高的穩(wěn)定性和高度有序性， 提高了傳感器表面酶的有效固定，從而增大了檢測(cè)精度。[0012]所述酶?jìng)鞲衅鞯闹苽涔に嚾缦?(I)取2.5 μ L制備好的多壁碳-二氧化錫-殼聚 糖納米復(fù)合膜滴涂在預(yù)處理好的金電極表面，常溫下靜置lh，用ΡΗ=7.5的PBS緩沖液沖洗 電極表面；(2)電極表面晾干后，取2.5μ L乙酰膽堿酯酶滴涂在電極表面，4°C下靜置2h， 然后用PH=7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈桑?3)取2.5 μ L0.5%Nafion保護(hù)膜滴涂 在電極表面，常溫下靜置1.5h，然后用PH=7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈桑?4)將上 述經(jīng)納米材料修飾好的電極沉浸在毒死蜱溶液中，常溫下下浸泡14min，取出后用PBS緩沖 液沖洗表面，晾干待用。[0013]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】附圖1生物傳感器修飾過(guò)程的循環(huán)伏安組裝圖。附圖2生物傳感器測(cè)試液pH值優(yōu)化。附圖3生物傳感器測(cè)試抑制時(shí)間優(yōu)化?！揪唧w實(shí)施方式】[0014]實(shí)施例:(I)多壁碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合膜的制備:在50mL乙酸溶液中 加入0.1g殼聚糖制備成0.2%殼聚糖溶液。在4mL 0.2%殼聚糖溶液中加入Img 二氧化錫、 3mg多壁碳納米管，25°C水中超聲震蕩30分鐘，則多壁碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合膜 制備成功；(3)金電極的清洗:金電極修飾前，首先浸入熱的“piranha”溶液(H2S04:30% H202 = 3:1)中浸泡15min，用水清洗干凈，接下來(lái)用0.3ym、30nm的A1203漿在麂皮上 拋光至鏡面，拋光后用蒸餾水洗去除表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次5min，重復(fù)二 次，然后依次用6mol/L的HN03、無(wú)水乙醇和去離子水超聲清洗，氮?dú)猸h(huán)境下干燥。(4)金 電極的活化:徹底清洗后，電極在0.5mol/L H2S04溶液中用循環(huán)伏安法活化，掃描范圍1.0V?-1.0V，反復(fù)掃描直至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。(5)預(yù)處理好的金電極的測(cè)試: 在含有1X10-3 mol/L K3Fe(CN)6的0.20 mo I/L KN03溶液中跑循環(huán)伏安曲線，以測(cè)試所述 金電極的性能，掃描速度50mV/S，掃描范圍為-0.1V?0.6V ;當(dāng)所述循環(huán)伏安曲線中的峰電 位差在SOmV以下，并盡可能接近64mV，所述金電極可使用，否則要重新返回步驟⑶中，處 理所述金電極，直到符合要求。(6)取2.5μ L分散均勻的多壁碳-二氧化錫-殼聚糖納米 復(fù)合液滴涂在電極表面，常溫下lh，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈伞?7) 電極表面晾干后，取2.5 μ L乙酰膽堿酯酶滴涂在電極表面，4°C下靜置2h，然后用PH=7.5的 磷酸鹽緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈伞?8)取2.5 μ L0.5%Naf ion保護(hù)膜滴涂在電極表面，常 溫下靜置1.5h，然后用PH=7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈伞?9)將上述經(jīng)納米材料 修飾的電極沉浸在毒死蜱溶液中，室溫下浸泡14min，取出后用PBS緩沖液沖洗表面，晾干 待用。(10)從毒死蜱溶液濃度、測(cè)試底液pH和孵育時(shí)間三方面對(duì)所制備的酶?jìng)鞲衅鞯膶?shí) 驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，毒死蜱溶液濃度的范圍為0.1-20μ g/mL，pH的范圍為6.0-8.0，孵育時(shí)間 的范圍為6-14min。(11)配置0.05-100000 ng/mL的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，將上述制備好的酶 傳感器分別浸入不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，在常溫下孵育14min，檢測(cè)反應(yīng)前后電流變化 得到其工作曲線。(12)選5根于相同條件下制備好的酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)其重現(xiàn)性；連續(xù)7天依次檢測(cè)相同濃度的毒死蜱溶液以檢測(cè)其穩(wěn)定性。(13)選取有代表性的蔬菜樣品，用潮濕的 抹布將蔬菜表面的泥土擦拭干凈，切碎成2cm左右的見方碎片，去樣品2g，放入提取瓶中， 加入IOml磷酸鹽緩沖液，放入超聲提取儀，超聲提取3分鐘，倒出提取液靜置2min，備用即可。[0015]此種酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法操作工藝簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間較短，檢 測(cè)農(nóng)藥濃度范圍廣，靈敏度高，穩(wěn)定性好，再生能力高以及對(duì)實(shí)際樣品分析有較好的回收率 和重現(xiàn)性，符合我國(guó)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展和國(guó)際化要求。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒ǎ涮卣髟谟?一種新型的多壁 碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合材料的制備，制備步驟為:在50mL乙酸溶液中加入0.1g殼聚糖制備成0.2%殼聚糖溶液，在4mL 0.2%殼聚糖溶 液中加入Img 二氧化錫、3mg多壁碳納米管，25°C水中超聲震蕩30分鐘，獲得均勻的多壁 碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合膜分散液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?，其特征在? 利用多壁碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合膜協(xié)同作用共同修飾電極的酶?jìng)鞲衅髦苽洳襟E 為:取2.5 μ L制備好的多壁碳-二氧化錫-殼聚糖納米復(fù)合膜滴涂在預(yù)處理好的φ=1πιπι 的金電極表面，常溫下靜置lh，用ρΗ7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面；電極表面晾干后， 取2.5μ L乙酰膽堿酯酶滴涂在電極表面，4°C下靜置2h，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖 洗表面，氮?dú)獯蹈桑蝗?.5μ L 0.5% Nafion保護(hù)膜滴涂在電極表面，常溫下靜置1.5h，然后 用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈?；將上述?jīng)納米材料修飾好的電極沉浸在毒 死蜱溶液中，常溫下浸泡14min，取出后用磷酸鹽緩沖液沖洗表面，晾干待用，酶?jìng)鞲衅髦谱?完成，保存在4° C條件下備用。
【文檔編號(hào)】B82Y5/00GK103558269SQ201310488105
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】孫霞, 郭業(yè)民, 王相友, 劉君峰, 陳棟菲 申請(qǐng)人:山東理工大學(xué)