抗rsv疫苗的制作方法
【專利說明】抗RSV疫苗
[0001]本發(fā)明是關(guān)于醫(yī)藥領(lǐng)域。更的具體地，本發(fā)明是關(guān)于抗RSV疫苗。
[醒]發(fā)明背景
[0003] 在1950年代發(fā)現(xiàn)呼吸道合胞病毒(RSV)之后，該病毒很快即成為公認(rèn)的與人類下 呼吸道感染及上呼吸道感染相關(guān)的病原體。據(jù)估計(jì)，全世界每年出現(xiàn)64,000，000例RSV感 染，導(dǎo)致160，000例死亡(WHO急性呼吸道感染，2009年9月更新）。最嚴(yán)重的疾病尤其在早產(chǎn) 兒、老年人及免疫功能降低的個體中出現(xiàn)。在2歲W下兒童中，RSV為最常見的呼吸道病原 體，占因呼吸道感染而住院治療的約50%，且住院治療的峰值出現(xiàn)在2-4月齡。據(jù)報(bào)道，幾乎 所有兒童至兩歲為止均受到RSV感染。終生反復(fù)感染歸結(jié)于無效的自然免疫。老年人中RSV 疾病負(fù)擔(dān)、死亡率及發(fā)病率的水平僅次于非泛流行性A型流感感染所引起的那些。
[0004] RSV為副黏液病毒，屬于肺病毒亞科。RSV的基因組編碼多種蛋白質(zhì)，包括稱為RSV 糖蛋白（G)及RSV融合(F)蛋白質(zhì)的膜蛋白，運(yùn)些膜蛋白為中和抗體的主要抗原標(biāo)祀。融合蛋 白質(zhì)前驅(qū)體(F0)的蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)生經(jīng)由二硫橋鍵連接的兩個多膚F1及F2?？笷1蛋白質(zhì)的融 合介導(dǎo)部分的抗體可阻止細(xì)胞中的病毒吸收且因此具有中和作用。除作為中和抗體的標(biāo)祀 外，RSVF含有細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原決定基（Pembedon等人，1987,J.Gen.Virol.68:2177-2182)。
[0005] RSV感染的治療選項(xiàng)包括抗RSV的F蛋白質(zhì)的單克隆抗體。與運(yùn)些單克隆抗體相關(guān) 的高成本及醫(yī)院配置中對投藥的要求排除了其大規(guī)模用于危險(xiǎn)群體預(yù)防的用途。因此，需 要一種RSV疫苗，其優(yōu)選地可用于小兒群體W及老年人。
[0006]盡管歷經(jīng)50年研究，但仍無獲準(zhǔn)的抗RSV疫苗。疫苗開發(fā)的一個主要障礙為在1960 年代使用福爾馬林不活化(formalin-inactivated，F(xiàn)I)RSV疫苗的臨床試驗(yàn)中遺留的疫苗 增強(qiáng)疾病。FI-RSV接種疫苗的兒童未受到保護(hù)W免于自然感染，且受感染兒童遭受比未接 種疫苗的兒童更嚴(yán)重的疾病，包括兩例死亡。此現(xiàn)象稱為'增強(qiáng)疾病'。
[0007] 自使用FI-RSV疫苗的試驗(yàn)W來，已實(shí)行多種方法來產(chǎn)生RSV疫苗。嘗試包括RSV的 傳統(tǒng)活減毒冷繼代病毒株或溫度敏感性突變病毒株、（嵌合)蛋白亞單位疫苗、膚疫苗及由 重組病毒載體表達(dá)的RSV蛋白質(zhì)。雖然此等疫苗中的一些疫苗展示具前途的臨床前數(shù)據(jù)，但 因安全性問題或缺乏功效而尚無疫苗獲準(zhǔn)供人類使用。
[000引腺病毒載體用于制備多種疾病的疫苗，包括與RSV感染相關(guān)的疾病。W下段落提供 已描述的基于腺病毒的RSV候選疫苗的實(shí)例。
[0009]在一種方法中，已將RSV.F插入4型、5型及7型復(fù)制勝任型腺病毒的非必需E3區(qū)中。 棉鼠鼻內(nèi)（i.η.)施用107p化的免疫接種具有適度免疫原性，且保護(hù)下呼吸道免受RSV攻擊， 但不保護(hù)上呼吸道免受RSV攻擊(Connors等人，1992，化ccine10:475-484;Col1ins，P丄.， Prince,G.A.,Camargo,E.,Purcell,R.Η.,Chanock,R.Μ.及Murphy,B.R.Evaluationof theprotectiveefficacyofrecombinantv曰ccini曰viruses曰nd曰denovirusesthat expressrespiratorysyncytialvirusglycoproteins.Vaccines90:Modern ApproachestoNewVaccinesincludingpreventionofAIDS(Brown,F.,Chanock, R.M.,Ginsberg,H.及Lerner,R.A.編）ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1990， 第79-84頁）。黑猩猩的后續(xù)經(jīng)口免疫接種具有不良免疫原性化su等人，1992,JInfect Dis.66:769-775)ο
[0010] 在其他研究中（Shao等人，2009，Vaccine27:5460-71;US2011/0014220)，帶有編 碼RSV-Bl病毒株的F蛋白質(zhì)的跨膜截短(rAd-FOATM)或全長(rAd-FO)型式的核酸的兩種重 組復(fù)制勝任不能型腺病毒5載體經(jīng)工程改造且經(jīng)由鼻內(nèi)途徑給予BALB/c小鼠。動物經(jīng)鼻內(nèi) 初打107P化且在28天后鼻內(nèi)加打相同劑量。雖然抗RSV-B1抗體中和RSV-Long及RSV-A2病毒 株且與其交叉反應(yīng)，但使用此等載體的免疫接種僅部分防止RSVB1攻擊復(fù)制。使用rAd-FO ATM的（部分)保護(hù)略高于使用rAd-FO。
[0011] 在另一研究中，觀測到使用表達(dá)野生型RSVF(FG-Ad-F)的復(fù)制缺陷型（基于Ad5) FG-Ad腺病毒的1〇11個病毒粒子對BALB/c小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)免疫接種與對照組相比肺病毒效價(jià) 僅減小 1.51og10(化等人，2009,Biochem.Bio地ys.Res.Commun. 381:528-532)。
[0012] 在其他研究中，觀測到鼻內(nèi)施用的表達(dá)RSVA2的F蛋白質(zhì)的密碼子優(yōu)化可溶性FI 片段(氨基酸155-524)的基于Ad5的復(fù)制缺陷型腺病毒載體（108PFU)與對照小鼠相比可減 少BALB/c小鼠肺中的RSV攻擊復(fù)制，但由肌肉內(nèi)（i.m.)途徑免疫接種的小鼠未展現(xiàn)出抗攻 擊的任何保護(hù)化im等人，2010,化ccine28:3801-3808)。
[OOK]在其他研究中，使用基于Ad5且?guī)в忻艽a子優(yōu)化全長RSVF(AdV-F)或可溶性形式 的RSFF基因（AdV-Fsol)的腺病毒載體Xl〇w〇PU(光學(xué)粒子單位：1Xl〇w〇PU的劑量相 當(dāng)于2X108GTU(基因轉(zhuǎn)導(dǎo)單位））的劑量對BALB/c小鼠免疫接種兩次。在鼻內(nèi)免疫接種之 后，此等載體大大減少肺內(nèi)病毒負(fù)荷，但在皮下（S.C.)或肌肉內(nèi)施用后僅部分減少肺內(nèi)病 毒負(fù)荷化ohlmann等人，2009,JVirol83:12601-12610;US2010/0111989)。
[0014]在其他研究中，觀測到肌肉內(nèi)施用的表達(dá)RSVA2病毒株的定序F蛋白質(zhì)cDNA的基 于Ad5的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(l〇w個粒子單位)與對照小鼠相比可僅部分減少BALB/ C小鼠肺中的RSV攻擊復(fù)制化rause等人，2011，VirologyJournal8:375-386)。
[001引除了在許多情況下并不完全有效W外，在臨床評估下供小兒使用的RSV疫苗及在 臨床前評估下的大多數(shù)疫苗為鼻內(nèi)疫苗。鼻內(nèi)策略的最重要優(yōu)勢在于直接刺激局部呼吸道 免疫性且不存在相關(guān)的疾病增強(qiáng)。實(shí)際上，一般用于鼻內(nèi)投藥的例如基于腺病毒的RSV候選 疫苗的功效與肌肉內(nèi)投藥相比似乎較佳。然而，鼻內(nèi)接種疫苗亦在不到6個月大的嬰兒中引 起安全性問題。在所有年齡層中，鼻內(nèi)疫苗最常見的不良反應(yīng)為流鼻涕或鼻充血。新生兒為 強(qiáng)制型鼻腔呼吸者且因此必須經(jīng)鼻呼吸。因此，頭幾個月大的嬰兒鼻充血可干擾哺乳，且在 極少情況下可導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸問題。
[0016]已鑒別超過50種不同人類腺病毒血清型。其中，過去已研究最廣泛地用作基因載 運(yùn)體的血清型5腺病毒(Ad5)。然而，不同血清型的重組腺病毒載體可產(chǎn)生關(guān)于誘導(dǎo)免疫反 應(yīng)及保護(hù)的不同結(jié)果。舉例而言，W02012/021730描述編碼F蛋白質(zhì)的血清型7猴腺病毒載體 及血清型5人類腺病毒載體與血清型28人類腺病毒載體相比提供較佳抗RSV保護(hù)。此外，觀 測到基于人類或非人類腺病毒血清型的載體的差異免疫原性(A化ink等人，2007,JVirol 81:4654-4663;Colloca等人，2012，SciTranslMed4,11 虹a2)nAbbink等人得出結(jié)論：在 不存在抗Ad5免疫性的情況下，所研究的所有稀少血清型人類rAd載體不如rAd5載體有效。 另外，近來已描述，雖然具有埃博拉病毒巧bolavirus，邸0V)糖蛋白（gp)轉(zhuǎn)基因的rAd5保護(hù) 100 %非人類靈長類動物，但具有邸0V即轉(zhuǎn)基因的rAd35及rAd26僅提供部分保護(hù)，且此等 載體需要異源初打-加打策略來獲得抗埃博拉病毒攻擊的完全保護(hù)(Geisbert等人，2011，J Virol85:4222-4233)。因此，事前不可能僅基于另一腺病毒血清型的數(shù)據(jù)預(yù)測重組腺病毒 疫苗的功效。
[0017]此外，對于RSV疫苗，需要在適當(dāng)疾病模型(諸如棉鼠）中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)W判定疫苗候選 物是否足W有效防止RSV在鼻道及肺中復(fù)制且同時(shí)為安全的，亦即不導(dǎo)致增強(qiáng)疾病。運(yùn)些候 選疫苗優(yōu)選地應(yīng)在運(yùn)些模型中極其有效，甚至在肌肉內(nèi)投藥時(shí)仍如此。
[0018]因此，仍需要不導(dǎo)致增強(qiáng)疾病的有效疫苗及接種抗RSV疫苗的方法。本發(fā)明旨在提 供此類疫苗及W安全且有效的方式接種抗RSV疫苗的方法。
[0019] 發(fā)明概述
[0020] 本發(fā)明的發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)包含編碼RSVF蛋白質(zhì)的核巧酸序列的血清型35重組 腺病毒(Ad35)為明確建立的棉鼠模型中極有效的抗RSV疫苗，且與先前關(guān)于編碼RSVF的 Ad5所述的數(shù)據(jù)相比具有改良的功效。據(jù)證實(shí)，即使單次投與、甚至肌肉內(nèi)投與編碼RSVF的 Ad35仍足W提供抗攻擊性RSV復(fù)制的完全保護(hù)。
[0021] 本發(fā)明提供一種抗呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，該疫苗包含血清型35重組人類腺 病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸。
[0022] 在某些實(shí)施例中，重組腺病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)的核酸，該RSVF蛋白質(zhì)包含 SEQIDN0:1的氨基酸序列。
[0023]在某些實(shí)施例中，編碼RSVF蛋白質(zhì)的核酸是針對在人類細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行密碼 子優(yōu)化。
[0024] 在某些實(shí)施例中，編碼RSVF蛋白質(zhì)的核酸包含SEQIDN0:2的核酸序列。
[0025]在某些實(shí)施例中，重組人類腺病毒的腺病毒基因組的E1區(qū)中具有缺失、E3區(qū)中具 有缺失或E1區(qū)與E3區(qū)中均具有缺失。
[00%] 在某些實(shí)施例中，重組腺病毒具有在5'末端包含序列CTATCTAT的基因組。
[0027]本發(fā)明另外提供一種對受試者接種抗RSV疫苗的方法，該方法包含向該受試者投 與本發(fā)明的疫苗。
[002引在某些實(shí)施例中，疫苗經(jīng)肌肉內(nèi)投與。
[0029]在某些實(shí)施例中，將本發(fā)明的疫苗投與受試者一次W上。
[0030]在某些實(shí)施例中，接種疫苗的方法由向受試者單次投與疫苗組成。
[0031]在某些實(shí)施例中，對受試者接種抗RSV疫苗的方法另外包含向該受試者投與包含 血清型26重組人類腺病毒的疫苗，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核 酸。
[0032]在某些實(shí)施例中，對受試者接種抗RSV疫苗的方法另外包含向該受試者投與RSVF 蛋白質(zhì)(優(yōu)選地調(diào)配成醫(yī)藥組合物，因此為蛋白質(zhì)疫苗）。
[0033]本發(fā)明亦提供一種減少例如受試者鼻道及肺中RSV感染和/或復(fù)制的方法，其包含 通過肌肉內(nèi)注射向該受試者投與包含血清型35重組人類腺病毒的組合物，該重組人類腺病 毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸。在投與疫苗時(shí)，此方法將減少由受試者中的RSV 感染引起的不良影響，且因此有助于保護(hù)受試者免受運(yùn)些不良影響。在某些實(shí)施例中，可基 本上預(yù)防RSV感染的不良影響，亦即降至使其臨床上不相關(guān)的低水平。重組腺病毒可呈本發(fā) 明的疫苗形式，包括上文所述的實(shí)施例。
[0034] 本發(fā)明亦提供一種包含血清型35重組人類腺病毒的經(jīng)分離的宿主細(xì)胞，該重組人 類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸。
[0035] 本發(fā)明另外提供一種制造抗呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的方法，其包含提供包含 編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸的血清型35重組人類腺病毒，使所述重組腺病毒在宿主 細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖，分離并純化該重組腺病毒，并將該重組腺病毒調(diào)配于醫(yī)藥學(xué)上可接受 的組合物中。運(yùn)方面的重組人類腺病毒亦可為上述實(shí)施例中所述的任何腺病毒。
[0036] 本發(fā)明亦提供一種形成血清型35重組人類腺病毒的基因組的經(jīng)分離的重組核酸， 該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質(zhì)或其片段的核酸。腺病毒亦可為如上述實(shí)施例中 所述的任何腺病毒。
[0037]附圖簡要說明
[0038] 圖1展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基于rAd26(A)及rAd35(B)的載體免 疫接種時(shí)，在免疫接種后2周及8周，小鼠的抗重迭F的氨基酸1-252的F膚及抗重迭F的氨基 酸241-574的F膚的細(xì)胞免疫反應(yīng)
[0039] 圖2展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基于rAd26及rAd35的載體免疫接種 時(shí)，在免疫接種后2周及8周，小鼠的抗RSV抗體反應(yīng)。
[0040] 圖3展示在使用1〇ι\ρ的具有RSVF基因的基于rAd26及rAd35的載體免疫接種時(shí)， 在免疫接種后8周，小鼠的抗RSVIgG2a抗體反應(yīng)與抗RSVIgGl抗體反應(yīng)的比率的結(jié)果。
[0041] 圖4展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基于rAd26(A)及rAd35(B)的載體免 疫接種時(shí)，在免疫接種后2周及8周，小鼠的抗RSVLong的病毒中和能力。
[0042] 圖5展示在使用具有RSVF基因的基于rAd26及rAd35的載體進(jìn)行初打-加打免疫接 種時(shí)，在初次免疫接種后6周及12周，小鼠的抗(A)重迭F的氨基酸1-252的F膚及抗(B)重迭F 的氨基酸241-574的F膚的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
[0043] 圖6展示在使用具有RSVF基因的基于rAd2