10339)由于產(chǎn)beta葡聚糖酶，對(duì)白刺植株纖維有良好分解作用，為堆 肥發(fā)酵過(guò)程所必須，因此，枯草芽抱桿菌（CICC 10339)能夠充分融入到堆肥菌群中穩(wěn)定持 久地增殖。堆肥過(guò)程處理簡(jiǎn)便，無(wú)廢水排放，投資少、能耗低、易操作，易于工業(yè)化大規(guī)模生 產(chǎn)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】 [0026] 實(shí)施例1
[0027] 1)產(chǎn)beta葡聚糖酶的枯草芽抱桿菌（CICC 10339)的高密度培養(yǎng)，枯草芽抱桿 菌（CICC 10339)的出發(fā)密度為1. 18 X106個(gè)/mU接種至液體培養(yǎng)基（葡萄糖14g/L、牛肉 膏25g/L、磯酸二氨鐘2. 45g/L、花生餅粉10g/l，pH = 7. 0,121°C滅菌20min)中，接種量為 2%，37°C振蕩培養(yǎng)2化，菌液密度為2. 65X 109c化/mU得到高密度菌懸液。
[002引 2)將白刺健康枝條共100kg剪成小節(jié)進(jìn)行自然堆肥，在堆肥內(nèi)部溫度達(dá)到32°C時(shí) 噴施1)中制備得到的高密度菌懸液化，繼續(xù)堆肥，待堆肥內(nèi)部溫度超過(guò)43°C時(shí)堆肥結(jié)束， 攬拌攤涼，自然狀態(tài)下后發(fā)酵，成為富含產(chǎn)beta葡聚糖酶的枯草芽抱桿菌的生物肥，即能 有效抑制殺滅白刺病理真菌的生物肥。
[0029] 3)步驟1)中制備得到的高密度菌懸液及步驟2)中制備得到的生物肥顯著具有 Beta葡聚糖酶活力，對(duì)白刺病理真菌具有顯著抑制殺滅作用，具體見(jiàn)下表1。
[0030] 白刺莖腐病病原菌尖抱鑲刀菌化sarium oxysporum F. Sp.購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物 菌種保藏管理中屯、（CICC)，菌種編號(hào)為2532。
[0031] Beta葡聚糖酶活力測(cè)定；采用還原糖測(cè)定法，Beta葡聚糖酶能夠?qū)eta葡聚糖降 解成寡糖和單糖，其具有的還原基團(tuán)在沸水浴條件下可與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色深 淺與還原糖生成量成正比，而還原糖生成量又與反應(yīng)液Beta葡聚酶活力成正比，從而利用 比色測(cè)定反應(yīng)液的吸光值計(jì)算還原糖生成量，得到Beta葡聚糖酶活力。Beta葡聚酶活力單 位定義；在測(cè)定條件下，每分鐘水解Beta葡聚糖產(chǎn)生1 y mol還原糖（W葡萄糖計(jì)）所需的 酶量，定義為一個(gè)酶活單位（IU)。
[0032] 平板抑制抑菌寬帶；采用平板噴霧法，待測(cè)菌株點(diǎn)接在NA平板，每平板2株，各3 個(gè)重復(fù)，28°C培養(yǎng)2化，把薩有氯仿的濾紙片放進(jìn)倒置的培養(yǎng)皿底部熏蒸20min，重復(fù)一次， 殺死待測(cè)菌；將病原真菌配成1〇 8菌懸液，用無(wú)菌喉頭噴霧器迅速將其噴在接有待測(cè)菌的平 板上化1ml/皿），28°C繼續(xù)培養(yǎng)48-6化后，記錄形成抑菌圈大小。
[0033] 平板括抗：將NA培養(yǎng)基倒入平板，凝固后在培養(yǎng)基上成S角放置牛津杯，向牛津 杯內(nèi)加入發(fā)酵液100 y^28°C溫箱培養(yǎng)，待病原真菌生長(zhǎng)后記錄抑菌圈大小。
[0034] 表 1
[0035]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將枯草芽孢桿菌CICC 10339進(jìn)行培養(yǎng)，制成密度IO9~10 ltlCfVmL的高密度菌懸 液； 2) 將白刺健康枝條剪成小段進(jìn)行堆肥，堆肥過(guò)程中噴施步驟1)中的高密度菌懸液，堆 肥結(jié)束后進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)發(fā)酵后得到能有效抑制殺滅白刺病理真菌的生物肥，將該生物肥用 在生物防治抗白刺莖腐病及促生上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，步驟1) 中，將枯草芽孢桿菌CICC 10339進(jìn)行培養(yǎng)，包括：枯草芽孢桿菌CICC 10339的出發(fā)密度為 IO6~107個(gè)/mL，接種至液體培養(yǎng)基中接種量為1 %~5%，33°C~39°C振蕩培養(yǎng)20~28h， 至菌液密度為IO9~10 1(lcfu/mL的高密度菌懸液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，步驟1) 中，將枯草芽孢桿菌CICC 10339進(jìn)行培養(yǎng)，包括：枯草芽孢桿菌CICC 10339的出發(fā)密度為 IO6~107個(gè)/mL，接種至液體培養(yǎng)基中接種量為2 %~3 %，36°C~37°C振蕩培養(yǎng)22~26h， 至菌液密度為IO9~10 1(lcfu/mL的高密度菌懸液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，所述 的液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，包括以下組分： 葡萄糖 11~17g; 牛肉膏 20~30g; 磷酸二氫鉀 1.5~3.5g; 花生餅粉 7~Ug; 調(diào)節(jié) pH=6.5~7.5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，所述的 液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，包括以下組分： 葡萄糖 Mg; 牛肉膏 25g; 磷酸二氫鉀 2 45g; 花生餅粉 l〇g, 調(diào)節(jié) pH=7.0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，步驟2) 中，堆肥過(guò)程中噴施步驟1)中的高密度菌懸液，包括：在堆肥內(nèi)部溫度達(dá)到30°C~34°C時(shí)， 噴施步驟1)中的高密度菌懸液，繼續(xù)堆肥，待堆肥內(nèi)部溫度達(dá)到41°C~45°C時(shí)堆肥結(jié)束。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，步驟2) 中，堆肥過(guò)程中噴施步驟1)中的高密度菌懸液，包括：在堆肥內(nèi)部溫度達(dá)到32°C時(shí)，噴施步 驟1)中的高密度菌懸液，繼續(xù)堆肥，待堆肥內(nèi)部溫度達(dá)到43°C時(shí)堆肥結(jié)束。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，步驟2) 中，堆肥結(jié)束后，將堆肥攪拌攤涼。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，其特征在于，步驟2) 中，所述的發(fā)酵采用自然狀態(tài)下發(fā)酵。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種生物防治抗白刺莖腐病及促生的方法，包括：將枯草芽孢桿菌制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌懸液；將白刺健康枝條剪成小段進(jìn)行堆肥，堆肥過(guò)程中噴施枯草芽孢桿菌高密度菌懸液，經(jīng)發(fā)酵后得到能有效抑制殺滅白刺病理真菌的生物肥，將該生物肥用在生物防治抗白刺莖腐病及促生上。本發(fā)明中，產(chǎn)beta葡聚糖酶的枯草芽孢桿菌是對(duì)白刺起抗病促生作用的植物益生菌，將其加入堆肥中，顯著加強(qiáng)對(duì)白刺病害真菌的生物防治和促生作用。堆肥過(guò)程處理簡(jiǎn)便，無(wú)廢水排放，投資少、能耗低、易操作，易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】C12N1-20, A01P3-00, C05F11-08, C12R1-125, A01P21-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104630107
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510058590
【發(fā)明人】吳淵, 胡慧雯, 徐薇薇, 阮暉, 梁瑩, 許麗珍, 吳孔華, 莫建平, 史金昕波, 繆丹, 俞雨, 吳盛彬, 徐騰洋
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日