用于檢測釀膿鏈球菌的lamp試劑盒及其專用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及細(xì)菌的分子生物學(xué)，特別是設(shè)及一種釀脈鏈球菌 的LAMP試劑盒及其專用引物與其在檢測釀脈鏈球菌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 釀脈鏈球菌臨床感染及治療現(xiàn)狀
[0003] 釀脈鏈球菌（Streptococ州S pyogenes)，即 A群鏈球菌（Group A streptococ州S， GAS,是根據(jù)抗原構(gòu)造不同定義為A群），e溶血（是指能夠完全使綿羊血細(xì)胞瓊脂溶血）， 是人體的重要致病菌之一，可W引起很多種疾病，引起的感染性疾病主要有急性咽炎、急性 扁桃體炎，也可致肺部感染、猩紅熱、皮膚軟組織感染，并可致全身性感染。釀脈鏈球菌也是 引起變態(tài)反應(yīng)性疾病風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎的間接原因。近年來，A群鏈球菌常引起嚴(yán) 重的感染，由侵襲性A群鏈球菌（invasive group A str巧tococ州S infections)引發(fā)的 疾病的發(fā)病率增長，使人們對該類細(xì)菌感染更加關(guān)注。
[0004] 釀脈鏈球菌可侵襲任何年齡的人，但發(fā)病者多為兒童。正常人鼻咽部、皮膚可帶 菌，并有由肛n、陰道帶菌引起暴發(fā)流行的報告。呼吸道與直接接觸均可傳播。亦有進食被 污染食物引起咽峽炎暴發(fā)的報道。生活貧困、衛(wèi)生條件差、居住擁擠、密切接觸等均有助于 釀脈鏈球菌感染的發(fā)生。
[0005] 目前，釀脈鏈球菌感染的治療藥物首選青霉素，但應(yīng)考慮到可能有耐藥菌株，應(yīng)加 大劑量或改用它藥，如紅霉素、克林霉素、第一代、二代頭抱類抗生素等。最好參照當(dāng)?shù)厮幟?結(jié)果選用。
[0006] 檢測釀脈鏈球菌的方法主要是傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定、血清學(xué)分析等，存在耗時和結(jié)果 不易判定等缺點。因此，快速、準(zhǔn)確檢測病原菌，予W規(guī)范合理的抗生素治療，是控制釀脈鏈 球菌感染的有效措施。
[0007] LAMP技術(shù)介紹
[0008] 環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 由 Notomi(Notomi T，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000:28(12) :63.)發(fā)明的一種新型基因擴增技術(shù)。具體方法是針對祀基因 值NA或者cDNA)的6個區(qū)域，設(shè)計4-6種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下 可W高效、快速、高特異地擴增祀序列，結(jié)果直接靠擴增副產(chǎn)物焦磯酸儀的沉淀濁度進行判 斷。LAMP技術(shù)具有快速高效、特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測直觀和設(shè)備要求低等特 點。
[0009] 自2000年發(fā)明W來，LAMP技術(shù)已被迅速用于病原微生物檢測、遺傳病診斷、 食品安全等領(lǐng)域的分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域。近年來，國外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體 檢測J。Masaki Imai 等人（Imai M，Ninomiya A, Minekawa H，et al. Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza HShemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ; 141(2) : 173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體 系；Nobuyuki Hayashi 等人化ayashi N，Arai R，Tada S，Taguchi H, Ogawa Y. Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp. yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method.化〇(1 Microbiol. 2007 ;24(7-8):778-85.)針對四種 香酒酵母的ITS序列設(shè)計了 LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP還可W 檢測其它與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血?。╒服)、巨細(xì)胞病毒（CMV)、埃博拉病 毒巧B0V)、慢性伯基特淋己瘤病毒巧BV)、虹彩病毒、人類瘡疹病毒8型、造血組織壞死病毒 (工HHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黃化曲葉病毒等。目前，國內(nèi)外均未見有用于檢測釀脈鏈球 菌的LAMP試劑盒及其專用引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了用于對釀脈鏈球菌進行LAMP檢測的引物，W實現(xiàn)釀脈鏈球菌的批 量檢測，提高檢測的特異性和靈敏度。
[0011] 本發(fā)明所提供的用于檢測釀脈鏈球菌的LAMP引物，是根據(jù)釀脈鏈球菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控 基因（the putative transcriptional regulator gene) spyl258 的特異性保守勒1序列設(shè) 計的，用W定性檢測純菌、疲液、腦脊液及其它分泌物等樣品中的釀脈鏈球菌，所述LAMP引 物由五條引物組成，包括外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP、化及環(huán)引物L(fēng)F的組合；所述釀 脈鏈球菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因spyl258的特異性保守祀序列如序列表中SEQ ID NO ;1所示。
[0012] 具體來講，所述用于對釀脈鏈球菌進行LAMP檢測的五條引物的核巧酸序列如序 列表中 SEQ ID N0;2(F3)、SEQ ID N0;3 炬3)、SEQ ID N0;4(FIP)、SEQ ID N0;5 炬I巧和 SEQ ID NO ;6 (L巧所示。
[0013] 所述的LAMP引物，為FIP和BIP、F3和B3、W及LF按摩爾比 40:5:20 的組合物。
[0014] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于對釀脈鏈球菌進行LAMP檢測的試劑盒。
[0015] 本發(fā)明所提供的試劑盒，包括上述用于對釀脈鏈球菌進行LAMP檢測的引物。
[0016] 具體來講，所述試劑盒包括W下用于25 y 1反應(yīng)體系的試劑；20mM Tris ?肥1(抑8. 8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,〇. 1% Tween20,0. 8M 甜菜堿（betaine)，8mM M拆〇4，1.4mM dNTP each, 8U Bst DM polymerase,引物加入量為；40pmol 引物 FIP 和 BIP， 5pmol 引物 F3 和 B3,20pmol 引物 LF。
[0017] 為方便檢測，所述試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為釀脈 鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系，如雙蒸水。
[001引上述LAMP引物或試劑盒在釀脈鏈球菌LAMP檢測中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范 圍。
[0019] 本發(fā)明的第S個目的是提供一種釀脈鏈球菌的LAMP檢測方法。
[0020] 本發(fā)明所提供檢測方法，可包括W下步驟：
[002U 1) W待測樣品基因組DM為模板，在上述引物的引導(dǎo)下進行LAMP擴增，25 LAMP反應(yīng)體系包括：待測樣品基因組DM 2yl，20mM Tris ?肥1(抑8. 8)，10mM KC1， 10mM(NH4)2S04,0. l%Tween20,0. 8M 甜菜堿化etaine)，8mM MgS04，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase,引物加入量為；40pmol 引物 FIP 和 BIP，5pmol 引物 F3 和 B3,20pmol 引物 LF ;LAMP擴增條件為；置60-65°C恒溫45-55min ;
[0022] 2)反應(yīng)結(jié)束后進行結(jié)果判定；在反應(yīng)液中添加巧黃綠素指示劑，根據(jù)反應(yīng)液的顏 色變化判斷結(jié)果，綠色表示待測樣品中存在釀脈鏈球菌，澄色表示待測樣品中不存在釀脈 鏈球菌；或者不添加巧黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應(yīng)前后反應(yīng)液的濁度變化來判斷 結(jié)果，濁度上升表示待測樣品中存在釀脈鏈球菌，濁度無變化表示待測樣品中不存在釀脈 鏈球菌。
[0023] 在上述檢測方法中，所述步驟1)中的LAMP反應(yīng)體系中還設(shè)有陽性對照和陰性對 照，所述陽性對照為釀脈鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體 系，如雙蒸水；所述LAMP擴增條件優(yōu)選為：置63°C恒溫50min。
[0024] 所述步驟2)中巧黃綠素指示劑的添加量可為1 y 1 (終反應(yīng)體系為26 y 1)，含有 0. 5mM巧黃綠素和lOmM氯化車孟。
[0025] 本發(fā)明提供了一種釀脈鏈球菌的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。本發(fā)明 檢測的釀脈鏈球菌原理是采用LAMP技術(shù)，對釀脈鏈球菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因spyl258的特異性保 守祀序列進行檢測。spy