專利名稱：鏈球菌毒素a突變體及其使用方法
背景技術(shù)：
化膿鏈球菌也稱為β-溶血性A族鏈球菌(GAS)，它是一種人病原，它可引起輕度感染，如咽炎和膿皰病。感染后可發(fā)生自身免疫并發(fā)癥，即風(fēng)濕熱和急性腎小球性腎炎。GAS還引起嚴(yán)重的急性病，如猩紅熱和鏈球菌中毒性休克綜合征(STSS)。在本世紀(jì)初，在美國和全世界，嚴(yán)重的GAS感染是一個很大的問題。在四十年代中期，病例數(shù)及其嚴(yán)重程度穩(wěn)定下降，其原因還未完全明白。然而，最近，再次出現(xiàn)了GAS引起的嚴(yán)重疾病，在美國每年可能有10-20,000件STSS病例。這些患者中多達50-60％將患壞死性筋膜炎和肌炎；30-60％的人將死亡，而幸存者有多達一半的人將截肢。
在1986和1987年，兩份報道描述了在洛基山區(qū)域爆發(fā)了嚴(yán)重的GAS感染。在其后的幾年里，其它一些報道描述了一種具有類似臨床表現(xiàn)的疾病。對該疾病描述的癥狀與中毒性休克綜合征(TSS)所描述的癥狀非常相似，在1992年，科學(xué)家委員會將這一臨床表現(xiàn)正式命名為STSS，并設(shè)定了其診斷的標(biāo)準(zhǔn)。STSS被定義為存在下列情況1.低血壓和休克；2.分離到A族鏈球菌；3.具有以下癥狀的兩種或多種發(fā)燒38.5℃或更高、猩紅熱皮疹、嘔吐和腹瀉、肝腎功能紊亂、成年人呼吸窘迫綜合征、彌漫性血管內(nèi)凝血、壞死性筋膜炎和/或肌炎、細(xì)菌血癥。
從STSS患者所得鏈球菌分離物主要是M1和M3型，其余主要是M18型和不能分型的細(xì)菌。大多數(shù)與STSS相關(guān)的不可分型細(xì)菌以及M1、M3、M18產(chǎn)生A型致熱性外毒素(SPE-A，即猩紅熱毒素A)。與之相反，一般的鏈球菌分離株中僅15％產(chǎn)生該毒素。此外，給兔動物模型施用SPE-A以及在兩次偶然性人接種時，再現(xiàn)了STSS癥狀。
SPE-A是一個分子量等于25,787道爾頓的單肽，其編碼序列被攜帶于溫和噬菌體T12中。SPE-A的基因speA已經(jīng)被克隆并在大腸桿菌中成功地表達。SPE-A是鏈球菌和葡萄球菌產(chǎn)生的外毒素大家族中的一個成員，根據(jù)其能誘導(dǎo)發(fā)熱并且使宿主對內(nèi)毒素的易感性提高達100,000倍的能力，而稱為致熱性毒素。
最近這些毒素已經(jīng)被稱為超抗原，因為它們能以依賴于T細(xì)胞受體β鏈可變區(qū)的組成成分的方式，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞大量增殖(而不管T細(xì)胞的抗原特異性)。這些毒素還刺激IFN-γ、IL-1、TNF-α和TNF-β的大量釋放。這一家族的其它成員是B型和C型鏈球菌致熱性外毒素，葡萄球菌中毒性休克綜合征毒素1，葡萄球菌腸毒素A、B、Cn、D、E、G和H，以及非A族鏈球菌的致熱性外毒素。這些毒素有相似的生物化學(xué)性能、生物活性和各種程度的序列相似性。
STSS最嚴(yán)重的表現(xiàn)是低血壓和休克，這些表現(xiàn)可導(dǎo)致死亡。通常認(rèn)為，體液從血管內(nèi)滲漏到組織間隙是造成低血壓的最終原因，這得到了如下觀察結(jié)果的支持，即在上述STSS家兔模型中進行體液替換治療成功地防止了休克。已經(jīng)提出假設(shè)，SPE-A可能以幾種方式作用于宿主從而誘發(fā)該病。
已經(jīng)表明，SPE-A通過危害肝枯否氏細(xì)胞(Kuppfer cell)的活力，來阻斷肝臟清除內(nèi)源菌群所產(chǎn)生的內(nèi)毒素。這看來引起了循環(huán)內(nèi)毒素的顯著增加，內(nèi)毒素通過結(jié)合于脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)(LBP)和CD14信號傳導(dǎo)而導(dǎo)致激活巨噬細(xì)胞，隨后釋放出TNF-α和其它細(xì)胞因子。通過給動物施用多粘菌素B或是使用無病原的兔，至少可部分中和SPE-A的致死作用，這一發(fā)現(xiàn)對內(nèi)毒素在疾病中的作用提供了支持。
誘導(dǎo)休克的另一種方式可能是該毒素對于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有直接活性。這種假設(shè)基于這樣的發(fā)現(xiàn)即葡萄球菌致熱性毒素TSST-1直接結(jié)合人臍帶靜脈細(xì)胞并對分離的豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞有細(xì)胞毒性。
該毒素的另一種作用方式是其超抗原性，即毒素與高達50％的宿主T淋巴細(xì)胞反應(yīng)并將其激活。這一T細(xì)胞大量刺激導(dǎo)致產(chǎn)生異常高水平的循環(huán)細(xì)胞因子TNF-β和IFN-γ，它們對巨噬細(xì)胞有直接作用，從而誘導(dǎo)釋放TNF-α和IL-1。這些細(xì)胞因子也可在沒有T細(xì)胞存在下，由SPE-A通過MHC II類結(jié)合和信號傳導(dǎo)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞直接釋放出來。TNF-α和-β水平的升高引起了通常在革蘭陰性菌誘導(dǎo)性休克中所見的幾種效應(yīng)，其中有對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和毛細(xì)血管滲漏。然而，給SPE-A處理過的兔施用環(huán)孢菌素A(環(huán)孢菌素A可阻斷IL-2的上調(diào)和T細(xì)胞增殖)，不能保護動物免遭休克，這提示在引起毛細(xì)血管滲漏中還有其它更重要的作用機理。
因此，需要確定SPE-A分子上擔(dān)負(fù)不同生物活性的部位。需要發(fā)展生物活性(如毒性和促細(xì)胞有絲分裂性)改變的SPE-A突變體。需要發(fā)展用于預(yù)防或緩和鏈球菌中毒性休克綜合征的疫苗用組分。還需要開發(fā)出治療鏈球菌中毒性休克綜合征和其它疾病的治療劑。
發(fā)明概述本發(fā)明包括突變的SPE-A毒素及其片段，疫苗和藥物組合物，以及該疫苗和藥物組合物的使用方法。
突變的SPE-A毒素至少有一個氨基酸變化，并且與基本對應(yīng)于野生型SPE-A毒素的蛋白質(zhì)相比，它基本上不致死。用于疫苗組合物時，毒素突變體還激發(fā)針對野生型SPE-A毒素的至少一種生物活性的保護性免疫應(yīng)答。疫苗組合物用的毒素突變體還進一步被任意選擇，使其與野生型SPE-A相比內(nèi)毒素休克增強作用和促T細(xì)胞有絲分裂性均有所減弱。一種特別優(yōu)選的用于疫苗組合物的突變體，是在相當(dāng)于野生型SPE-A毒素的20位氨基酸處發(fā)生氨基酸改變的突變體。用于藥物組合物時，較佳的毒素突變體基本上不致死，同時保持了與野生型SPE-C毒素相當(dāng)?shù)拇賂細(xì)胞有絲分裂性。
本發(fā)明還包括野生型speA毒素和speA毒素突變體的片段。衍生自野生型SPE-A的片段和肽是SPE-A毒素突變體。這些片段可包括不同的毒素分子的結(jié)構(gòu)域或分子區(qū)域，它們可聯(lián)合在一起。與野生型SPE-A毒素相比，此種片段基本上是不致死的。對于毒素突變體，與野生型SPE-A氨基酸序列相比，該片段至少有一個氨基酸不同。片段也可用于疫苗和藥物組合物。
本發(fā)明還包括表達盒、載體和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。表達盒包括編碼SPE-A毒素突變體或其片段的DNA序列，該DNA序列與在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子可操作地相連。DNA盒宜插入載體中。載體包括質(zhì)?；虿《?。載體可用來提供模板DNA，以產(chǎn)生編碼SPE-A毒素突變體的DNA。DNA盒和載體也可用于疫苗組合物。編碼SPE-A毒素突變體或其片段的核酸可直接輸送，從而在哺乳動物細(xì)胞中進行表達。啟動子宜為在哺乳動物細(xì)胞中起作用的啟動子。直接輸送給細(xì)胞的核酸可在個體中表達SPE-A毒素突變體，從而產(chǎn)生了針對野生型SPE-A毒素的至少一種生物活性的保護性免疫應(yīng)答反應(yīng)。
其它的疫苗組分包括包含編碼SPE-A毒素突變體或其片段的表達盒且穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或病毒載體。病毒載體如牛痘可用來對人免疫接種，以產(chǎn)生抗野生型SPE-A毒素至少一種生物活性的保護性免疫應(yīng)答反應(yīng)。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞宜為微生物，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或沙門氏菌屬。轉(zhuǎn)化的微生物或者在其表面上有SPE-A毒素突變體或其片段，或能分泌毒素突變體。轉(zhuǎn)化的微生物可作為活疫苗、減毒疫苗或熱殺滅疫苗來施用。
本發(fā)明還包括疫苗和藥物組合物的使用方法。給予動物的疫苗量可有效地產(chǎn)生針對野生型SPE-A毒素至少一種生物活性的保護性免疫應(yīng)答反應(yīng)。較佳地，是將疫苗組合物給予人體，以起防止STSS發(fā)作的保護作用。藥物組合物也用于刺激T細(xì)胞增殖的方法中。在治療那些用白細(xì)胞介素、干擾素或其他免疫調(diào)制劑治療的癌癥，以及T細(xì)胞淋巴瘤，卵巢癌和子宮癌時，該藥物組合物特別有用。該組合物可施用于癌癥病人。
SPE-A毒素突變體和/或其片段以及其它疫苗組合物，可用來產(chǎn)生被動免疫血清。SPE-A毒素突變體或其片段、DNA表達盒或載體、或轉(zhuǎn)化的微生物，可用來對動物免疫接種，以產(chǎn)生針對野生型SPE-A至少一種生物活性的中和抗體。該中和抗體能與SPE-A毒素突變體和/或其片段以及野生型SPE-A毒素發(fā)生免疫反應(yīng)。被動免疫血清可施用于有鏈球菌A感染和STSS癥狀的動物。
附圖簡述

圖1是鏈球菌致熱性外毒素A的模型化三維結(jié)構(gòu)的帶狀圖。標(biāo)明了結(jié)構(gòu)域A和B。
圖2是對于圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)圖，從背面觀看時的SPE-A圖。被編號的殘基是那些與TSST-1評估的降低全身性致死率的殘基同源的殘基。
圖3顯示了克隆的來自T12的SPE-A毒素的DNA序列(SEQ ID NO12)和預(yù)計的氨基酸序列(SEQ ID NO13)。
圖4為T細(xì)胞增殖分析。在96孔微量滴定板中，將兔脾細(xì)胞與SPE-A、K16N-SPE-A和N20D-SPE-A一起孵育72小時(每種重復(fù)4次)。細(xì)胞用[3H]胸苷脈沖處理18-24小時，通過濾膜收集，然后在閃爍計數(shù)器上測定[3H]胸苷的摻入量。結(jié)果表示為以每分鐘的計數(shù)(CPM)對以微克/毫升(μg/ml)表示的毒素濃度。所示的數(shù)據(jù)來自3次獨立試驗中最具代表性的試驗。
圖5為T細(xì)胞增殖分析。在96孔微量滴定板中，將兔脾細(xì)胞與SPE-A、C87S-SPE-A、C98S-SPE-A和C90S-SPE-A一起孵育72小時(每種重復(fù)4次)。細(xì)胞用[3H]胸苷脈沖處理18-24小時，通過濾膜收集，然后在閃爍計數(shù)器上測定[3H]胸苷的摻入量。結(jié)果表示為每分鐘的計數(shù)(CPM)對以微克/毫升(μg/ml)表示的毒素濃度。所示的數(shù)據(jù)來自3次獨立試驗中最具代表性的試驗。
圖6為T細(xì)胞增殖分析。在96孔微量滴定板中，將兔脾細(xì)胞與SPE-A、K157E-SPE-A和S195A-SPE-A一起孵育72小時(每種重復(fù)4次)。細(xì)胞用[3H]胸苷脈沖處理18-24小時，通過濾膜收集，然后在閃爍計數(shù)器上測定[3H]胸苷的摻入量。結(jié)果表示為每分鐘的計數(shù)(CPM)對以微克/毫升(μg/ml)表示的毒素濃度。所示的數(shù)據(jù)來自3次獨立試驗中較具代表性的試驗。
圖7是與單突變體相比時野生型SPE-A的超抗原性。將兔脾細(xì)胞與所示劑量的SPE-A或突變體一起孵育4天。對于每個劑量的SPE-A和突變體，使用4個重復(fù)的孔。在第3天，將1μCI3H胸苷加至各孔。超抗原性指數(shù)＝＝在SPE-A或突變體存在時3H胸苷在脾細(xì)胞中的摻入量除以在無SPE-A或突變體存在時3H胸苷的摻入量。
圖8是與雙突變體相比時野生型SPE-A的超抗原性。使用圖7中所述的方法。
圖9顯示了免疫的兔血清對SPE-A的抑制作用。來自用單突變體或雙突變體免疫的兔子的兔血清，被用于顯示在SPE-A存在下該血清中和脾細(xì)胞的促細(xì)胞分裂的能力。
圖10顯示了SPE-A帶狀結(jié)構(gòu)的前視圖，其中SPE-A取向顯示了在復(fù)合體中與II型主要組織相容性復(fù)合體接觸的位點。
圖11顯示了SPE-A帶狀結(jié)構(gòu)的前視圖，其中SPE-A取向顯示了在復(fù)合體中與T細(xì)胞受體接觸的位點。
圖12顯示了SPE-A帶狀結(jié)構(gòu)的后視圖，其中SPE-A取向顯示了構(gòu)成凹溝表面的中央α螺旋的殘基，在與肝臟腎小管細(xì)胞受體形成的復(fù)合物中該凹溝與該受體接觸。
圖13顯示了模型化的SPE-A三維結(jié)構(gòu)的帶狀立體圖的前視(標(biāo)準(zhǔn))圖。給出了已編排的結(jié)構(gòu)如β-鏈和α-螺旋。標(biāo)出了結(jié)構(gòu)域A和B。突變殘基和某些其他殘基的α碳原子用球形表示。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及SPE-A毒素突變體及其片段、包含SPE-A毒素突變體或其片段的疫苗和藥物組合物、制備SPE-A毒素突變體及其片段的方法，以及SPE-A毒素及其片段的使用方法。
SPE-A毒素突變體是與基本上對應(yīng)的野生型SPE-A毒素的蛋白質(zhì)相比，至少有一個氨基酸變化并且其生物功能至少有一個變化的蛋白質(zhì)。較佳地，在相同劑量下與野生型SPE-A毒素相比，SPE-A毒素突變體基本上不致死。SPE-A毒素突變體可用各種方法生產(chǎn)，這些方法包括定點誘變、隨機誘變、常規(guī)誘變、體外誘變、自發(fā)突變和化學(xué)合成。SPE-A毒素突變體宜選擇成1)確保氨基酸中至少有一個變化；和2)分子生物功能至少有一個變化，較佳的是全身致死率的下降或消除。毒素突變體可用于疫苗組合物，以抵抗SPE-A毒素的至少一種生物活性(如防止或緩和STSS)；可用于治療具STSS癥狀的動物的方法；可用于刺激T細(xì)胞增殖的方法；以及用于治療腫瘤。測試了單突變、雙突變或三突變的SPE-A突變體，而針對突變體的抗體可抑制細(xì)胞對SPE-A的應(yīng)答。
A.SPE-A毒素突變體或其片段、疫苗和藥物組合物本發(fā)明包括SPE-A毒素突變體，與基本上對應(yīng)于野生型SPE-A并有野生型SPE-A相同生物活性的蛋白質(zhì)相比，它具有至少一個氨基酸變化，并且其生物活性上至少有一個變化。
野生型SPE-A毒素由噬菌體T12上的基因speA編碼。根據(jù)成熟蛋白質(zhì)的推導(dǎo)氨基酸序列計算，野生型SPE-A毒素的分子量為25,787道爾頓。編碼野生型SPE-A毒素的DNA序列和預(yù)計的野生型SPE-A毒素氨基酸序列示于圖3。編碼野生型SPE-A毒素的DNA序列已被克隆到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中。本申請中的氨基酸編號是根據(jù)圖3的序列，并以31位谷氨酰胺為第一個氨基酸。前30個氨基酸是不存在于成熟蛋白質(zhì)中的前導(dǎo)序列。
野生型SPE-A毒素的結(jié)構(gòu)模型示于圖1。該結(jié)構(gòu)模型是用Insight/Homology程序(BioSym Corp.，San Diego，CA)，通過同源模型建立法構(gòu)建的。該模型表明，野生型SPE-A毒素有數(shù)個清晰的結(jié)構(gòu)特征。這些結(jié)構(gòu)特征包括螺旋2(氨基酸11-15)；N末端α螺旋3(氨基酸18-26)；螺旋4(氨基酸64-72)；中央-α螺旋5(氨基酸142-158)；螺旋6(氨基酸193-202)；結(jié)構(gòu)域Bβ鏈包括鏈1(氨基酸30-36)、鏈2(氨基酸44-52)、鏈3(氨基酸55-62)、鏈4(氨基酸75-83)、鏈5(氨基酸95-106)；結(jié)構(gòu)域Aβ鏈包括鏈6(氨基酸117-126)、鏈7(129-135)、鏈8(氨基酸169-175)、鏈9(氨基酸180-186)和鏈10(氨基酸213-220)。此外，位于87、90和98處的半胱氨酸對于形成假定的二硫鍵或維持局部三維結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。
野生型SPE-A毒素有幾種生物活性。這些生物活性包括1)發(fā)熱；2)STSS；3)由于STSS發(fā)展或內(nèi)毒素休克增強而引起的全身性致死；4)增強內(nèi)毒素休克；5)誘導(dǎo)毛細(xì)血管滲漏和低血壓；6)誘導(dǎo)細(xì)胞因子(如IFN-γ、IL-1、TNF-α和TNF-β)的釋放；7)與豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合；8)與MHC II類分子結(jié)合；9)與T細(xì)胞受體結(jié)合；和10)促T細(xì)胞有絲分裂性(超抗原性)。這些活性可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來分析和定性研究。
如本文所用，定義“野生型SPE-A毒素”包括生物活性與野生型SPE-A毒素相同的野生型SPE-A毒素的變異體。這些SPE-A毒素的氨基酸或其基因的核苷酸序列可能與圖3所示的不同，但是卻沒有不同的生物活性。氨基酸序列的改變在表型上是沉默的。較佳的，這些毒素分子的全身致死性和增強內(nèi)毒素休克的活性與圖3所示野生型SPE-A毒素的程度相同。較佳的，這些毒素與圖3所示野生型SPE-A毒素氨基酸序列有至少60-99％的同源性(經(jīng)Altschul，S.F.，Bull.Math.Bio.48603(1986)所述的SS2序列對比算法加以確定)。有這些性質(zhì)的蛋白質(zhì)基本上對應(yīng)于野生型SPE-A。
SPE-A毒素突變體是與基本上對應(yīng)于野生型SPE-A毒素蛋白質(zhì)相比，至少有一個氨基酸變化的毒素。該變化可以是氨基酸取代、缺失或插入。在氨基酸序列中可以有一個以上的變化，較佳的有1至6個變化。較佳地，氨基酸序列中宜有一個以上的變化，從而最大程度地減少SPE-A毒素突變體回復(fù)成具有全身致死性或毒性的野生型SPE-A毒素的可能。對于疫苗中所用的SPE-A毒素突變體，較佳的是，毒素氨基酸序列的改變不會改變毒素刺激產(chǎn)生中和野生型SPE-A毒素的抗體的應(yīng)答的能力。對于疫苗中所用的SPE-A毒素突變體，尤其優(yōu)選的是毒素突變體可被針對SPE-A毒素的多克隆中和抗體(如來自Toxin Technologies，BocaRaton，F(xiàn)la.或Dr.Schlivert(University of Minnesota，Minneapolis，MN)的抗體)所識別，并且與野生型SPE-A相比，其蛋白質(zhì)水解圖譜沒有改變。
氨基酸序列的改變可以是在野生型SPE-A毒素一個或多個選定氨基酸殘基上的位點特異性改變。通過鑒定分子特定結(jié)構(gòu)域中的殘基(如前所述)或半胱氨酸殘基所處位置，可選擇位點特異性變化。還可通過比較一級序列同源性或三維結(jié)構(gòu)，來確定某位置或結(jié)構(gòu)域中的氨基酸與其它同源分子的等價殘基是否相同或有相似性質(zhì)，從而進一步任意選擇特定位置處的位點特異性變化。同源分子是指可通過上述Altschul等的SS2序列對比算法(同上)、或同源性模型程序(如BioSym，San Diego，CA的Insight/Homology程序)比較一級序列的同源性而被鑒定的分子。同源分子是指，當(dāng)與野生型SPE-A毒素比較時，顯示出明顯數(shù)量的氨基酸(通常為30-99％)相同或保守性變化，或有相似的三維結(jié)構(gòu)(通常保守區(qū)域的RMS誤差小于2埃)的分子。
可在特定位點處隨機改變氨基酸序列，或者可選擇特異性變化。一旦選擇了特異性位點，就用其氨基酸編號和圖3所示野生型SPE-A中該位點處的氨基酸表示。在本申請中，氨基酸編號以圖3中31位的谷氨酰胺為第一個氨基酸進行編號。與基本上對應(yīng)的野生型SPE-A毒素蛋白質(zhì)中特定位點所鑒定的那些氨基酸對應(yīng)的等價氨基酸，可以有不同的氨基酸編號，這取決于參照序列或者它們是否是片段。通過比較一級氨基酸結(jié)構(gòu)、或與圖1所示模型結(jié)構(gòu)比較、或與同源分子的已知晶體結(jié)構(gòu)比較，在同源分子中也可發(fā)現(xiàn)等價殘基，它們可被鑒定成與基本對應(yīng)的野生型SPE-A毒素蛋白質(zhì)中的氨基酸等價。本發(fā)明覆蓋了相同或相似位置處的等價氨基酸變化，不論其氨基酸編號是否相同。
如果選擇對特異性位點處的氨基酸作特異性取代，則在該位置作取代的氨基酸應(yīng)包括一個可影響生物活性(與野生型SPE-A該位置處的氨基酸相比)的結(jié)構(gòu)變化。取代可以是保守性的或非保守性的。導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化影響生物活性的取代包括1)從一種類型電荷變成另一種；2)從帶電荷變成不帶電荷；3)半胱氨酸殘基和形成二硫鍵方面的變化；4)疏水性殘基變成親水性殘基，或親水性殘基變成疏水性殘基；5)氨基酸大小改變；6)變成構(gòu)象上限制性氨基酸或類似物；和7)變成非天然存在的氨基酸或類似物。所選特異性取代還可取決于所選位點的位置。例如，N端α螺旋中的氨基酸宜有與外露的酰胺氮原子相互作用的羥基，或者它們帶有能與N端α螺旋中的部分正電荷相互作用的負(fù)電荷。
毒素突變體還可包括針對一個或多個特異性位點的隨機突變。一旦選出位點，就可用例如Aiyar等，Biotechniques 14366(1993)或He等，Gene 7751-54(1984)中所述的方法產(chǎn)生在該位點由其它19種氨基酸的每一種取代的突變體。利用Anthony-Cahill等Trends Biochem.Sci.14400(1989)所述的方法，也可通過體外誘變在特定位置用其它19種氨基酸的每一種或非天然存在的氨基酸或類似物來取代。
毒素突變體還包括在非特異性選定的、分子的一個或多個位點處有變化的毒素，以及在氨基酸中有變化的毒素，該氨基酸不是特異性選定的，但可以是其它19種氨基酸的任一種或非天然存在的氨基酸。
特異性位點處的取代還可包括(但不局限于)非天然存在的氨基酸的取代，該氨基酸例如是3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、同型半胱氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、鳥氨酸、同型精氨酸、N-甲基賴氨酸、二甲基賴氨酸、三甲基賴氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、羥基賴氨酸、取代的苯丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、γ-纈氨酸和鹵代的酪氨酸。特異性位點處的取代還可包括采用非肽類化學(xué)物質(zhì)的類似物，其包括(但不局限于)酯、醚和磷?；团疰I。
毒素突變體可用各種方法來產(chǎn)生。那些方法包括定點誘變、采用化學(xué)物質(zhì)(如EMS、亞硫酸氫鈉或UV照射)誘變、自發(fā)突變、體外誘變和化學(xué)合成。誘變方法可在Sambrook等，A Guide to Molecular Cloning，Cold Spring Harvard，NewYork(1989)中找到。定點誘變的特別佳的方法是用三個引物的不對稱PCR，如Perrin和Gilliland，1990.Nucleic Acid Res.187433所述。
一旦產(chǎn)生了一個SPE-A毒素突變體，該突變體與基本對應(yīng)的野生型SPE-A毒素蛋白質(zhì)相比至少有一個氨基酸變化，則篩選非致死性的SPE-A毒素突變體。較佳的是，當(dāng)用微型滲透泵(如實施例2所述)以相同或高于野生型SPE-A毒素的劑量給藥時，從該篩選中選出的SPE-A毒素突變體在家兔中是基本上不致死的。如果以相同于野生型毒素的劑量給藥時，少于大約10-20％的家兔死亡，則稱SPE-A毒素突變體或其片段是基本上不致死的。不致死的毒素突變體可用于疫苗和藥物組合物。盡管不意味著限制本發(fā)明，據(jù)信影響全身致死性的一些氨基酸殘基或結(jié)構(gòu)域可與其它生物活性(尤其是促T細(xì)胞有絲分裂性)分開。
對于可用于疫苗組合物的毒素突變體，更優(yōu)選的是選出那些可刺激產(chǎn)生抗體應(yīng)答的SPE-A毒素突變體，其中該抗體應(yīng)答能中和野生型SPE-A毒素活性。選擇能刺激中和野生型SPE-A毒素活性的抗體應(yīng)答的毒素突變體的方法是，測定毒素突變體是否能與野生型SPE-A的多克隆中和抗體(如可從Toxin Technologies，Boca Raton，F(xiàn)la.或Dr.Schlievert獲得)發(fā)生免疫反應(yīng)。測定SPE-A毒素突變體是否與野生型SPE-A毒素抗體起免疫反應(yīng)的方法包括ELISA、Western印跡法、雙重免疫擴散試驗等。
還可任選地篩選毒素突變體，以確定毒素突變體的蛋白質(zhì)水解圖譜是否與野生型SPE-A毒素相同。在一些情況下，較佳的是，與野生型SPE-A毒素相比，產(chǎn)生的突變體在整體三維結(jié)構(gòu)上沒有顯著改變。檢查整體結(jié)構(gòu)是否改變的一種方式是，觀察與野生型SPE-A毒素抗體的免疫反應(yīng)性和/或測定SPE-毒素突變體的蛋白質(zhì)水解圖譜。該蛋白質(zhì)水解圖譜可用酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和V8蛋白酶，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測定。具有圖3所示序列的野生型SPE-A的蛋白質(zhì)水解圖譜是已知的?？蛇x出曲線與該野生型SPE-A相似的突變體。
任選地，還可篩選和選出生物活性有其它變化的毒素突變體。如上所述，野生型SPE-A毒素有幾種生物活性。這些生物活性包括1)發(fā)熱；2)STSS；4)增強的內(nèi)毒素休克；5)毛細(xì)血管滲漏和低血壓；6)誘導(dǎo)細(xì)胞因子(如IFN-γ、IL-1、TNF-α和TNF-β)的釋放；7)與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合；8)與MHC II類分子結(jié)合；9)與T細(xì)胞受體結(jié)合；和10)促T細(xì)胞有絲分裂性(超抗原性)。這些生物活性可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測定。
對于用于疫苗組合物的SPE-A毒素突變體或其片段，較佳的是它們基本上沒有毒性，并能與野生型SPE-A的中和抗體起免疫反應(yīng)。中和抗體包括在動物中測試時抑制野生型毒素致死性的那些抗體。任選地，SPE-A毒素突變體在前述野生型SPE-A毒素其它生物活性方面還可有一種或多種變化。
任選地，還可對較佳的疫苗組合物用毒素突變體作進一步篩選，選出不增強內(nèi)毒素休克的突變體。檢查不增強內(nèi)毒素休克的較佳的試驗在實施例4中有所描述。在測試前，家兔最好沒有可證明的細(xì)菌或病毒感染。當(dāng)將SPE毒素突變體與內(nèi)毒素共同給藥時，與相同劑量的野生型SPE-A活性相比，少于大約25％的動物發(fā)生休克時，則表明不增強內(nèi)毒素休克或基本上不增強內(nèi)毒素休克。更佳的是，沒有動物發(fā)生休克。
任選地，還可對較佳的疫苗組合物用突變體進行進一步篩選，選出促T細(xì)胞有絲分裂性改變的突變體。通過下列方法可測定促T細(xì)胞有絲分裂性的變化測定家兔淋巴細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)3H胸苷試驗中T細(xì)胞增殖(如實施例4所述)；測定細(xì)胞因子(如IFNγ或TNF-β)的產(chǎn)生水平；測定Vβ型T細(xì)胞反應(yīng)；或測定分子與II類MHC受體的相互作用。檢測促T細(xì)胞有絲分裂性減少的較佳方法是在毒素突變體存在和不存在下測定家兔淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞增殖。T細(xì)胞對野生型SPE-A毒素的反應(yīng)大大超過對抗原的正常體外反應(yīng)。當(dāng)SPE-A毒素突變體刺激的T細(xì)胞增殖反應(yīng)不高于抗原或陰性對照刺激的反應(yīng)，則可視為促T細(xì)胞有絲分裂性有顯著降低。較佳地，當(dāng)用家兔淋巴細(xì)胞以與野生型SPE-A毒素相同的劑量進行測定時，可觀察到對SPE-A毒素突變體的T細(xì)胞增殖反應(yīng)降低，而且降低至不超過背景的兩倍。
任選地，還可對用于疫苗組合物用的SPE-A毒素突變體進行進一步篩選，選出內(nèi)皮細(xì)胞中毛細(xì)血管滲漏減少的突變體。較佳的方法是如Lee等J.Infect.Dis.164711(1991)所述的采用豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。通過測定放射性標(biāo)記過的化合物的釋放減少或放射性標(biāo)記過的化合物轉(zhuǎn)運的變化，就可在SPE-A毒素突變體存在下確定毛細(xì)血管滲漏的減少。與野生型毒素活性相比，當(dāng)放射性標(biāo)記過的化合物釋放或轉(zhuǎn)運減少至低于背景的兩倍時，則視為毛細(xì)血管滲漏減少。
尤其佳的疫苗組合物用SPE-A毒素突變體在與具有野生型SPE-A毒素活性的蛋白質(zhì)相比時沒有生物活性。沒有生物活性是指毒素突變體有很少或沒有全身致死性、內(nèi)毒素休克增強和促T細(xì)胞有絲分裂性。較佳的是，選用作疫苗組合物的SPE-A毒素突變體基本上沒有這些生物活性，即，它們象陰性對照那樣反應(yīng)或它們刺激出的反應(yīng)不超過背景的兩倍。
其它生物活性變化可如下測得。用Jardetzky，Nature 368711(1994)所述的方法可檢測與II類MHC分子的結(jié)合。給予SPE-A毒素突變體后監(jiān)測溫度隨時間的變化來檢測發(fā)熱的改變。采用商業(yè)上可獲得的方法可測定在SPE-A毒素突變體的存在下細(xì)胞因子產(chǎn)生水平的變化，這些方法在目前的免疫技術(shù)文獻中有所描述(Ed.Coligan，Kruisbeck，Margulies，Shevach，和Stroker.National Institutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.)。
現(xiàn)在描述具有至少一個氨基酸改變而且基本上無毒性的SPE-A毒素突變體的具體例子。
尤其優(yōu)選的疫苗組合物用突變體，是與野生型SPE-A毒素的多克隆中和抗體起免疫反應(yīng)、無毒的SPE-A毒素突變體，其還可任選地具有減少的內(nèi)毒素休克能力和減少的促T細(xì)胞有絲分裂性。特別優(yōu)選的突變體在20位氨基酸的天冬酰胺處有改變，例如突變體N20D，它在成熟的毒素的20位殘基處用天冬氨酸替換天冬酰胺(N20D)。已表明，N20D突變體是無毒性的，沒有增強的內(nèi)毒素休克而且促T細(xì)胞有絲分裂性下降5倍。此外，在98位氨基酸的改變，即導(dǎo)致該位置上缺少半胱氨酸，會形成內(nèi)毒素休克增強的下降且促有絲分裂性下降4倍的突變毒素。在該位置的特別優(yōu)選的突變體是用絲氨酸替換半胱氨酸(C98S)。
用于刺激T細(xì)胞增殖和用于治療癌癥的優(yōu)選突變體，是基本上不致死的毒素突變體。較佳地，這些毒素突變體保留至少野生型SPE-A水平的促T細(xì)胞有絲分裂性。特別優(yōu)選的突變體在野生型SPE-A的157位殘基上有氨基酸改變，例如在該殘基處用谷氨酸替換賴氨酸(K157E)。已表明，K157E突變體是不致死的，但是保留了與野生型SPE-A毒素相當(dāng)?shù)拇儆薪z分裂性。
如下通過改變分子的特定結(jié)構(gòu)域中的氨基酸，可以產(chǎn)生實現(xiàn)功能改變的突變體。野生型SPE-A毒素的分子模型示于圖1。特別優(yōu)選的結(jié)構(gòu)域包括N-端α螺旋3(氨基酸18-26)、中央α螺旋5(氨基酸142-158)、結(jié)構(gòu)域B的β鏈(氨基酸33-36；44-52；55-62；75-83；和95-106)、結(jié)構(gòu)域A的β鏈(氨基酸117-126；129-135；169-175；180-186；和213-220)。87、90和98位的半胱氨酸殘基也至關(guān)重要。
在不對本發(fā)明進行限制的情況下，據(jù)信這些結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了對野生型SPE-A的生物學(xué)活性至關(guān)重要的特異的三維結(jié)構(gòu)。如圖2所示，N-端α螺旋和中央α螺旋相互靠近，因而此處的殘基對于野生型SPE-A分子的毒性可能特別重要。此外，在緊靠中央α螺旋的相鄰B鏈中的氨基酸，可能對毒性也至關(guān)重要。圖1和2所示的分子模型有助于鑒別結(jié)構(gòu)域的表面殘基和包埋殘基。
對于疫苗組合物，改變宜發(fā)生在N末端α螺旋3(殘基18-26)，然后進行篩選和選擇，從而降低全身致死性或內(nèi)毒素增強或促T細(xì)胞有絲分裂性，或者同時降低三者。
在N末端α螺旋3發(fā)生改變的一個具體例子，是在20位氨基酸殘基處的改變。在該殘基處將天冬酰胺改為天冬氨酸可導(dǎo)致內(nèi)毒素休克增強的下降、全身致死性的下降以及促有絲分裂性下降5倍。在20位殘基處的其他變化較佳地可改變表面殘基電荷分布，或者可改變N末端α螺旋與中央α螺旋的相互作用。在20位氨基酸處用帶電荷的氨基酸(如谷氨酸、賴氨酸、精氨酸)進行取代，會具有相同的效果。在該區(qū)域的改變，較佳地可降低因STSS而導(dǎo)致的全身致死性。
較佳地，還可在中央α螺旋5的殘基142-158中進行改變。為了降低STSS所導(dǎo)致的全身致死性，宜選擇在該區(qū)域有至少一個氨基酸改變的突變體。已表明，在其他毒素分子中所鑒別的類似中央α螺旋與毒性相關(guān)。一個具體的例子是在157殘基處的改變。在該殘基處將賴氨酸改為谷氨酸，可導(dǎo)致內(nèi)毒素休克增強的下降以及由STSS所導(dǎo)致的全身致死性的下降。
然而，促T細(xì)胞有絲分裂性并不受該殘基處改變的影響。這些結(jié)果表明，毒性和內(nèi)毒素休克增強是與促T細(xì)胞有絲分裂性相互分離的活性。對于疫苗組合物，為了減低促T細(xì)胞有絲分裂性，可任選地對該區(qū)域有改變的其他突變毒素進行篩選和選擇。在157位氨基酸處電荷類型的改變表明，用天冬氨酸替換賴氨酸可能有類似效果。
為了非致死性，以及任選地為了內(nèi)毒素休克增強的下降和/或促T細(xì)胞有絲分裂性的下降，宜篩選和選擇在結(jié)構(gòu)域Bβ鏈中的改變，其中包括殘基30-36(β鏈1)、殘基44-52(β鏈2)、殘基55-62(β鏈3)、殘基75-83(β鏈4)、殘基95-106(β鏈5)(結(jié)構(gòu)域5)。已表明，在數(shù)種毒素(如SEB、SEA、TSST-1)中構(gòu)成N端β-折疊桶的多個殘基，對于與II類MHC分子發(fā)生結(jié)合是至關(guān)重要的。突變毒素與II類MHC的結(jié)合力的下降，還可通過測試方法(例如Jardetzky等人的方法(同上))來選擇。選擇在這些殘基處的改變，使其可破壞β折疊結(jié)構(gòu)、或改變與II類MHC分子相接觸的殘基(尤其是位于β折疊桶的凹表面的殘基)。參見圖1。對于疫苗組合物，這些改變局部結(jié)構(gòu)的變化，宜不改變突變毒素與抗野生型SPE-A毒素的多克隆中和抗體之間的免疫反應(yīng)性。
較佳地，可選擇結(jié)構(gòu)域Aβ鏈的改變以使其不致死、內(nèi)毒素休克下降和/或促T細(xì)胞有絲分裂性下降，其中包括殘基117-126(結(jié)構(gòu)域β鏈6)、殘基129-135(結(jié)構(gòu)域7)、殘基169-175(結(jié)構(gòu)域8)、殘基180-186(結(jié)構(gòu)域9)和殘基213-220(結(jié)構(gòu)域10)。較佳地，所選擇的殘基變化可改變β折疊結(jié)構(gòu)而不改變SPE-A突變毒素與抗野生型SPE-A毒素的多克隆中和抗體之間的免疫反應(yīng)性。
疊加四個葡萄球菌超抗原(TSST-1、SEA、SEB和SEC-3)以及SPE-A的三維結(jié)構(gòu)后，表明這些蛋白質(zhì)共享18個結(jié)構(gòu)上保守的氨基酸(表A)。用這18個結(jié)構(gòu)上保守的氨基酸殘基作為參照點，能使這5個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重疊的RMS(均方根)差小于等于2埃，這對于有最小氨基酸序列保守的蛋白質(zhì)是明顯的。這種根據(jù)18個結(jié)構(gòu)上保守的氨基酸進行的重疊使得能夠詳細(xì)比較SPE-A與葡萄球菌超抗原的結(jié)構(gòu)。
葡萄球菌超抗原SEB和II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC-II)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)表明，與MHC-II接觸的SEB上的氨基酸，它們包括列在表B中的那些殘基。將SPE-A結(jié)構(gòu)的加以疊加后，顯示了在這兩種蛋白質(zhì)的復(fù)合物中與MHC-II接觸(與殘基接觸或與區(qū)域接觸)的SPE-A氨基酸的位置。這些位置在圖10中以小球表示。
具體地，圖10顯示了帶有B結(jié)構(gòu)域2的SPE-A1，它是由多種鏈(strand)和環(huán)(loop)所構(gòu)成的，其中B結(jié)構(gòu)域2含有β-桶3。位置4-7在鏈8上。位置4所處的距離相當(dāng)于距鏈8羧基端約3個氨基酸，該羧基端是鏈8和環(huán)9的接頭；位置4正好位于鏈8轉(zhuǎn)角的下方(按圖10所示的方向)。位置4可被極性氨基酸占據(jù)，較佳地是SPE-A的Asn-49。位置5靠近鏈4的中央，可以被疏水氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Ile-47。在位置5和6之間有約1個氨基酸的間隔。位置6可以被疏水氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Leu-41。位置7是鏈8的氨基端。位置7可以被疏水氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Leu-42。
位置10-12位于鏈13的β桶3上。位置10距離環(huán)9和鏈13的接頭處約3個氨基酸，并且在位置10和該接頭之間有一轉(zhuǎn)角。位置10可以被帶電荷的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Lys-57。位置11靠近鏈13的中央，它可以被帶電荷的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Lys-58。位置11靠近位置5。位置12最接近環(huán)14和鏈13之間的接頭但位于鏈13上，它可以被帶電荷的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Glu-61。位置53位于鏈13和環(huán)14的接頭處。位置13可以被疏水氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Leu-62。
位置15、16和17位于環(huán)18上。位置15在環(huán)18上，所處的位置是環(huán)18穿過鏈8和13所確定的平面的地方。位置15靠近α螺旋25的中央轉(zhuǎn)角26。位置15可以被不帶電荷或極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Ser-43。位置16位于環(huán)18上，所處位置是環(huán)18從鏈8上升起的地方，如圖10所示。位置16可以被極性氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的His-44。位置17在環(huán)18上并靠近位置6和5。位置17可以被極性氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Gln-40。
位置19-21在環(huán)22上。這些位置被約一個氨基酸所隔開。位置19和20約在環(huán)22長度的中間。位置19可以被中性或極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Cys-90。位置20可以被中性或極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Tyr-88。位置21可以被疏水氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Leu-86。
位置23位于α-螺旋24上，在最靠近螺旋24和環(huán)18的接頭處的轉(zhuǎn)角中。位置23可以被極性氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的His-44。
葡萄球菌SEC-與T細(xì)胞受體的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)顯示了SEC-3上與T細(xì)胞受體接觸的氨基酸，其中包括表C中列出的殘基。將SPE-A結(jié)構(gòu)疊加后，表明了SEC-3上與這兩種蛋白質(zhì)的復(fù)合物中T細(xì)胞受體接觸的氨基酸。這些位置在圖11中以球狀表示。
具體參照圖11，其中包括上面描述過的位置10-12。位置27-30位于環(huán)22上。每個位置都與前一位置相鄰。位置30位于環(huán)22和鏈31的接頭處。位置27可以被極性氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Asn-92。位置28可以被中性氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Ala-93。位置29可以被帶電荷的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Glu-94。位置30可以被帶電荷的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Arg-95。
位置32位于鏈9上，約處于鏈9的中間。位置32可以被極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Asn-54。位置33位于環(huán)22和鏈34的接頭處。位置33可以被極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Tyr-84。位置35位于環(huán)22上，與位置33相鄰。位置35可以被極性氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的His-85。
位置36-40處于N末端α-螺旋41中。位置36在N末端α-螺旋41的環(huán)42上。位置36距離N末端α-螺旋41與環(huán)44之間的接頭1個殘基。位置37-40在N末端α-螺旋41的環(huán)43上的位置是相鄰的。位置36可以被疏水氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Phe-23。位置37可以被極性氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Asn-20。位置38可以被極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Gln-19。位置39可以被疏水氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Leu-18。位置40可以被極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Asn-17。
位置45和46在靠N末端α-螺旋41轉(zhuǎn)角43的環(huán)47區(qū)域中。位置45可以被極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Tyr-160。位置46可以被極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Asn-162。位置45和46被約1個氨基酸殘基所隔開。
SPE-A與肝腎小管受體之間的相互作用，包括圖12所示的與中央α螺旋48的相互作用。對于與肝受體的相互作用至關(guān)重要的中央α螺旋48上位置，包括位置49-54。位置49-55界定了構(gòu)成SPE-A結(jié)構(gòu)中的凹溝基底的中央α螺旋45表面。位置49-54是該表面上優(yōu)選的位置。位置49和51可以被極性的氨基酸所占據(jù)。位置50和52-54可以被帶電荷的殘基所占據(jù)。較佳地，位置49是Asn-156，位置50是氨基酸Asp-55，位置51是氨基酸Tyr-152，位置5是氨基酸Lys-151，位置53是氨基酸Lys-148，或位置54是氨基酸Glu-144。更佳的位置是50、51、53和54，它們在由位置49-55所界定的表面上占有最大比例的位置。位置55靠近環(huán)56和中央α螺旋45的接頭處。位置55可以被中性或極性的氨基酸所占據(jù)，較佳地是SPE-A的Thr-141。
表B列出了在SEB和II類MHC這兩個蛋白質(zhì)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，與II類MHC相互作用的SEB殘基。將SEC-3、SEA和TSST-1的結(jié)構(gòu)與SEBMHC-II復(fù)合物的結(jié)構(gòu)疊加后，顯示了這些蛋白質(zhì)中的，與和MHC-II相作用的SEB氨基酸殘基相對應(yīng)的殘基，其中包括表B中所示的這些蛋白質(zhì)的殘基。較佳的SPE-A突變體包括SPE-A殘基的取代，而該殘基對應(yīng)于SEB、SEC-3、SEA或TSST-1中與MHC-II相互作用的殘基。這些較佳的SPE-A殘基包括表B中所列出的SPE-A殘基。該表的列中列出了不同蛋白質(zhì)的對應(yīng)殘基。
表C列出了在T細(xì)胞受體和SEC-3這兩個蛋白質(zhì)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，與T細(xì)胞受體作用的SEC-3殘基。將SEC-3、SEA和TSST-1的結(jié)構(gòu)與SEBT細(xì)胞受體復(fù)合體的結(jié)構(gòu)疊加，其結(jié)果表明了這些蛋白質(zhì)中的，和與T細(xì)胞受體相互作用的SEB的殘基相對應(yīng)的氨基酸，其中包括了表C中所示的殘基。較佳的SPE-A突變體包括SPE-A殘基的取代，而該殘基對應(yīng)于SEB、SEC-3、SEA或TSST-1中與T細(xì)胞受體相互作用的殘基。這些較佳的SPE-A殘基包括表C所列出的SPE-A殘基。該表的各行中列出了不同蛋白質(zhì)的對應(yīng)殘基。
較佳的SPE-A突變體，在與T細(xì)胞受體、MHC-II或肝腎小管細(xì)胞受體作用的至少一個位置或至少一個氨基酸殘基上有氨基酸取代、這些氨基酸取代可如上所述進行選擇，以破壞相互作用。
表APTSAG保守殘基
<p>表B在II類MHC相互作用中所涉及的殘基
可以選擇改變半胱氨酸殘基或引入二硫鍵的SPE-A毒素突變體，它們的致死性下降，或者可任選地存在內(nèi)毒素休克增強的下降和/或促T細(xì)胞有絲分裂性的下降。一種具體的例子是在98位半胱氨酸處的改變。在該殘基處將半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸，所形成的毒素突變體其促有絲分裂性下降約4倍，且內(nèi)毒素休克增強下降以及因STSS致死性也下降。在98位殘基處消除半胱氨酸基團，這一改變會與用絲氨酸替換相類似的方式影響生物活性。在98位殘基處還可進行的其他變化包括用其他小脂族殘基如丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸進行替換。改變位于90和97位氨基酸殘基處的其他半胱氨酸殘基，會導(dǎo)致促有絲分裂性的下降。
有利的是，用于治療方法的SPE-A毒素突變體可制成其氨基酸序列中有一個以上的變化。希望在一個以上的位置有變化，以使回復(fù)成具有毒性或致死性分子的可能性最小。對于疫苗組合物，希望具有多個變化的突變體仍能產(chǎn)生抗野生型SPE-A的保護性免疫應(yīng)答和/或與野生型SPE-A的多克隆中和抗體起免疫反應(yīng)。對于藥物組合物，較佳的是，具有多個變化的突變體基本上是不致死的，并同時維持了T細(xì)胞的促細(xì)胞有絲分裂性。尤其佳的是具有大約2至6處變化。這樣的突變體的例子包括具有N20D突變的突變體，其中包括雙突變體例如N20D/K157E、N20D/C98S，三重突變體如N20D/D45N/C98S等。雙突變體N20D/C98S已保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為No.55821。雙突變體N20D/C98S已保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為No.55822。三重突變體N20D/D45N/C98S已保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為No.55993。
雙突變體SPE-A可提供優(yōu)于單突變體的優(yōu)勢。這在實施例6中詳細(xì)描述的3個試驗中加以評估。結(jié)果示于圖7-9。數(shù)據(jù)顯示，N20D/C98S突變體的毒性比N20D單突變體更低，而N20D/K157E雙突變體介于其他兩種蛋白中間。所有3種突變體的毒性都明顯低于野生型SPE-A。來自用單或雙突變體免疫的兔的血清，可抑制對應(yīng)于非突變SPE-A毒素的淋巴細(xì)胞增殖。淋巴細(xì)胞增殖與毒素的全毒性相關(guān)并且是全毒性所必需的。
如實施例7所述，對動物進行抗N20D、N20D/C98S或N20D/K157E免疫。結(jié)果示于表9。用任一種雙突變體免疫的動物得到了完全的保護，從而避免發(fā)熱和對內(nèi)毒素休克的易感性的增強。
三重突變體也在本申請的構(gòu)思之中，在一個例子中，用此處所公開的引物和實施例1-7的方法和測試手段，測試了SPE-A突變體N20D/C98S/D45N。
還可優(yōu)選地在特定的位點缺失殘基，例如缺失氨基酸殘基20位處的天冬酰胺和/或缺失氨基酸157位的賴氨酸或98位的半胱氨酸。對于疫苗組合物，可以選擇缺失突變體，而這些缺失突變體可與針對野生型SPE-A毒素的多克隆中和抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，和/或能夠激發(fā)針對野生型SPE-A活性的保護性免疫應(yīng)答。
SPE-A突變毒素可用于制備疫苗組合物。較佳的疫苗組合物突變體具有至少一個氨基酸變化，沒有全身毒性，并且能與針對野生型SPE-A的多克隆中和抗體起免疫反應(yīng)。特別優(yōu)選的突變體包括在20位氨基酸處有改變的SPE-A毒素突變體，例如N20D、N20D/K157E、N20D/C98S，以及在殘基20位處缺失天冬酰胺的突變體。
毒素突變體可與生理上可接受的載體相混合。生理上可接受的稀釋劑包括生理鹽溶液和在中性pH下的緩沖鹽溶液，如磷酸緩沖溶液。其它類型的生理性載體包括脂質(zhì)體或聚合物等。任選地，突變體毒素可以與佐劑(如Freund′s不完全佐劑、Freund′s完全佐劑、明礬、單磷酰類脂A、磷酸鋁或氫氧化鋁、QS-21等)相混合。任選地，毒素突變體或其片段可以與免疫調(diào)節(jié)劑如白細(xì)胞介素、干擾素等混合。許多疫苗配方是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在疫苗配方中加入有效量的SPE-A毒素突變體或其片段，以在動物體內(nèi)刺激出針對野生型SPE-A毒素至少一種生物活性的保護性免疫應(yīng)答。保護性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生可通過抗體(較佳的是中和野生型SPE-A毒素的抗體)的產(chǎn)生來測定。野生型SPE-A毒素的中和可用包括抑制野生型SPE-A在動物體內(nèi)致死性的方法來測定。此外，通過測定至少一種野生型SPE-A毒素生物活性的減少(如內(nèi)毒素休克增強的癥狀或STSS的改善或消除)，可測知有無保護性免疫反應(yīng)。可形成保護性免疫應(yīng)答的毒素突變體的量約為每千克體重0.1微克至100毫克，更佳的每千克體重約為1微克至100微克。約25微克/千克體重的野生型SPE-A毒素用量可有效地誘導(dǎo)家兔中的保護性免疫力。
疫苗組合物可給予動物如家兔、嚙齒類動物、馬和人。較佳的動物是人。
SPE-A毒素突變體還可制成藥物組合物。藥物組合物可用于需要刺激T細(xì)胞增殖的治療場合，例如在腫瘤治療中。較佳的SPE-A毒素突變體，是不致死但維持了與野生型SPE-A毒素相當(dāng)?shù)拇賂細(xì)胞有絲分裂性的那些突變體。優(yōu)選的突變體是那些在野生型SPE-A毒素的殘基157位的賴氨酸處發(fā)生改變的突變體。例如K157E。
藥物組合物可通過混合SPE-A毒素突變體和生理上可接受的載體(如生理鹽溶液、中性pH緩沖鹽溶液，如磷酸緩沖鹽溶液)來制得。SPE-A毒素突變體構(gòu)成組合物時的用量，應(yīng)有效刺激出與相同劑量野生型SPE-A毒素相當(dāng)?shù)腡細(xì)胞增殖。通過家兔淋巴細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)3H胸苷試驗、和熒光激活T細(xì)胞分選儀測定體內(nèi)T細(xì)胞種群或用諸如ELISPOT的試驗，可測定T細(xì)胞應(yīng)答性的增強。有效量還可以是能夠有效緩和/或減緩癌細(xì)胞生長的量。這可以通過測量SPE-A突變毒素對體內(nèi)癌細(xì)胞生長的影響，或者通過測量癌癥-特異性T細(xì)胞的刺激作用而加以確定。有效量的范圍為每千克體重100納克至100毫克，更佳的每千克體重1微克至1毫克。約10-6微克野生型SPE-A毒素可刺激增強的T細(xì)胞反應(yīng)性。例如，這些SPE-A毒素突變體可單獨使用或與白細(xì)胞介素或干擾素治療結(jié)合。
本發(fā)明還包括SPE-A毒素片段和SPE-A毒素突變體的片段。對于疫苗組合物，這些片段宜足夠大以刺激產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答。B細(xì)胞表位的大小最小約為4-7個氨基酸，對于T細(xì)胞表位，最小約為8-12個氨基酸。野生型SPE-A總共有大約251個氨基酸(包括前導(dǎo)序列在內(nèi))。這些片段是約有4至250個氨基酸的肽，更佳的約有10-50個氨基酸。
片段可以是單個肽，或包括不同位置連接在一起的肽。較佳的，片段包括圖1所示和上面所述的一個或多個結(jié)構(gòu)域。另外，當(dāng)與基本上對應(yīng)的野生型SPE-A毒素蛋白質(zhì)比較時，較佳的SPE-A毒素突變體片段的氨基酸序列中有至少一個變化，更佳的，氨基酸序列中有1至6個變化。
較佳的，這些片段基本上沒有全身致死性。對片段進行篩選，選出在劑量相同或高于具有野生型SPE-A毒素活性的蛋白質(zhì)時、用微型滲透泵模型在家兔中有很少或沒有毒性的突變體(如上所述)。當(dāng)給予相當(dāng)于野生型SPE-A毒素的劑量時，在人體內(nèi)沒有毒性的片段也是較佳的。
對于疫苗組合物，片段宜包括中央α螺旋和/或N端α螺旋的殘基。特別優(yōu)選的是，該片段在相當(dāng)于野生型SPE-A毒素的20位殘基處有氨基酸殘基的變化(例如N20D)，或者在相當(dāng)于野生型SPE-A毒素的98位殘基處有氨基酸殘基的變化。
對于疫苗組合物，較佳的是片段刺激產(chǎn)生了抗具有野生型SPE-A毒素活性的蛋白質(zhì)的中和抗體反應(yīng)?？蓪ζ芜M行篩選，選出與針對野生型SPE-A毒素的多克隆中和抗體起免疫反應(yīng)的片段。片段還可用來對動物免疫接種，形成的抗體經(jīng)測試應(yīng)能中和野生型SPE-A毒素。
對于疫苗組合物，還可篩選出尤其佳的沒有生物活性的片段。沒有生物活性是指該片段沒有全身致死性、引起的內(nèi)毒素休克增強很少或沒有、以及引起的T細(xì)胞刺激很少或沒有。任選地，可對片段進行篩選，選出對豬內(nèi)皮細(xì)胞有毛細(xì)血管滲漏作用減少的片段。
篩選和選擇用于疫苗組合物的片段可以結(jié)合入疫苗組合物中并如上所述那樣使用。任選地，片段可以與載體分子(如牛血清白蛋白質(zhì)、人血清白蛋白質(zhì)、匙孔血藍(lán)蛋白質(zhì)、破傷風(fēng)類毒素等)結(jié)合。
對于藥物組合物，該片段宜包括單獨的N-端B結(jié)構(gòu)域β鏈1-5中的氨基酸殘基或與中央α螺旋組合的殘基。特別優(yōu)選的是，該片段在相當(dāng)于野生型SPE-A毒素的157位氨基酸賴氨酸處有氨基酸殘基的變化，如K157E。
對于藥物組合物，宜對這些片段篩選，選出沒有全身致死性，以及任選地內(nèi)毒素休克增強很少或沒有(如上所述)的片段。片段宜保留類似于野生型SPE-A毒素的促T細(xì)胞有絲分裂性。SPE-A毒素突變體的片段可如上所述那樣制成藥物組合物。
SPE-A毒素突變體的片段可用PCR、限制性酶消化和/或連接、體外誘變和化學(xué)合成來制得。對于較小的片段來說，化學(xué)合成也許是理想的。
SPE-A毒素突變體片段可用于關(guān)于SPE-A毒素突變體所描述的相同的組合物和方法中。
B.SPE-A毒素突變體、疫苗組合物或藥物組合物的使用方法SPE-A毒素突變體和/或其片段可用來保護動物抵抗野生型SPE-A毒素的作用、改善或治療患STSS的動物、誘導(dǎo)增強的T細(xì)胞增殖和應(yīng)答、以及治療或改善癌癥癥狀。
一種保護動物抗野生型SPE-A毒素的至少一種生物活性的方法，該方法涉及步驟向動物給予疫苗組合物以建立抗SPE-A毒素至少一種生物活性的保護性免疫應(yīng)答。保護性免疫應(yīng)答宜為中和與保護以抗致死性或STSS癥狀。疫苗組合物宜包括具有至少一個氨基酸變化的SPE-A毒素突變體或其片段，該突變體或其片段可與野生型SPE-A的多克隆中和抗體起免疫反應(yīng)，并且不致死。特別優(yōu)選的突變體在20位氨基酸殘基天冬酰胺處發(fā)生改變，例如突變體N20D、或N20D/K157E或N20D/C98S。
疫苗組合物可以各種方式給予動物，包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、口服、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)等方式。較佳的給藥途徑是肌內(nèi)給予。
疫苗組合物可給予各種動物，包括家兔、嚙齒類動物、馬和人。較佳的動物是人。
疫苗組合物可單劑量或多劑量給藥直至建立起抗野生型SPE-A的至少一種生物活性的保護性免疫力。保護性免疫力可通過用標(biāo)準(zhǔn)方法測定野生型SPE-A的中和抗體的存在來檢測。給予有效量，以建立起保護性免疫力而不產(chǎn)生顯著的毒性。
SPE-A毒素突變體或其片段也可用來產(chǎn)生與SPE-A毒素突變體和野生型SPE毒素發(fā)生免疫反應(yīng)的中和抗體。這些抗體可用作被動免疫血清來治療或改善患有STSS癥狀的患者體內(nèi)的癥狀。上述疫苗組合物可給予動物(如馬或人)，直至產(chǎn)生抗野生型SPE-A的中和抗體。然后可收獲這些中和抗體、純化，并用來治療具有STSS癥狀的患者。抗野生型SPE-A毒素的中和抗體還可用野生型SPE-A制成。然而，給予野生型SPE-A的劑量必須大大低于誘導(dǎo)出毒性的劑量，例如為野生型SPE-A在家兔中的LD50的1/50至1/100。
向表現(xiàn)出STSS癥狀(例如發(fā)熱、低血壓、A族鏈球菌感染、肌炎、筋膜炎和肝臟損傷)的患者給予有效量的中和抗體，以中和SPE-A毒素的作用。中和抗體可通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮、皮下等方式給藥。較佳的途徑是靜脈內(nèi)給藥，或?qū)τ诰植炕腥臼窃诮M織損傷部位局部進行清創(chuàng)。中和抗體也宜與抗生素治療結(jié)合給藥。中和抗體可單劑量或多劑量給予直至使休克或組織損傷減少。通常給予的中和抗體較佳的量約為1至1000毫克/千克(體重)，更佳的約為50-200毫克/千克體重。
SPE-A毒素突變體和/或其片段還可用于刺激T細(xì)胞增殖的藥物組合物中，尤其在腫瘤治療中。特別優(yōu)選的是，這些藥物組合物可替換目前的使用白細(xì)胞介素、干擾素或腫瘤壞死因子的腫瘤療法，或者與目前的療法聯(lián)合使用。SPE-A毒素突變體還可用于治療T細(xì)胞淋巴瘤、卵巢癌和子宮癌。在不限制本發(fā)明的情況下，據(jù)信SPE-A毒素突變體對T淋巴瘤有選擇性的毒性。
藥物組合物含有不致死同時又保留促T細(xì)胞有絲分裂性的SPE-A毒素突變體和/或其片段。優(yōu)選的SPE-A毒素突變體是在157位氨基酸殘基賴氨酸處有變化(例如K157E)的突變體。
藥物組合物可通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮、口服、腹腔內(nèi)或皮下等方式向癌癥病人給藥。較佳的途徑是靜脈內(nèi)給藥，藥物組合物可以單劑量或多劑量地施用。藥物組合物的施用量可有效地刺激更強的T細(xì)胞增殖應(yīng)答和/或減緩癌癥的生長，但基本上沒有毒性。優(yōu)選的量為100納克至100毫克/千克(體重)，更佳的約為1微克-1毫克/千克體重。特別優(yōu)選的是SPE-A突變體的藥物組合物與使用白細(xì)胞介素、干擾素或腫瘤壞死因子的腫瘤療法聯(lián)合使用，或者替換使用。
C.編碼SPE-A毒素突變體的DNA表達盒和該DNA表達盒的制備方法本發(fā)明還包括用于表達SPE-A毒素突變體和/或其片段的DNA序列和表達盒。表達盒包括編碼SPE-A毒素突變體或其片段的DNA序列，以及與其操作性相連的在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，其中所述突變體或其片段與基本對應(yīng)野生型SPE-A毒素的蛋白質(zhì)相比至少有一個氨基酸變化和至少一種生物功能變化。將表達盒插入轉(zhuǎn)化載體中并在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中生產(chǎn)SPE-A毒素突變體。然后可從宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞上清液中純化獲得毒素突變體。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞也可用作疫苗組合物。
SPE-A毒素突變體或其片段也可通過類似定點或隨機誘變的方式篩選和選擇自發(fā)突變體來制得。SPE-A毒素突變體可用體外誘變或從某步驟產(chǎn)生的片段以半合成法來制得。最后，SPE-A毒素突變體可用化學(xué)合成方法來制得。
生產(chǎn)SPE-A毒素突變體或其片段的方法包括，用包括該表達盒的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在允許宿主細(xì)胞表達該SPE-A毒素突變體或其片段的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
編碼SPE-A毒素突變體的DNA序列根據(jù)所選的變化類型，可用各種方法來制得編碼氨基酸序列至少有一個變化的SPE-A毒素突變體的突變型DNA序列。將編碼基本對應(yīng)野生型SPE-A毒素功能的蛋白質(zhì)的DNA序列作為模板DNA來制得編碼SPE-A毒素突變體的DNA序列。編碼野生型SPE-A毒素的DNA序列如圖3所示，并且已保藏在ATCC保藏號69830的微生物中。
為了作特定變化或在一個或數(shù)個特定位置變化，較佳的是根據(jù)Perrin等(前述)的方法采用PCR。為了使變化靶向特定的位置，混合物中包括了編碼該氨基酸變化的改變的核苷酸的內(nèi)部引物以及5′和3′側(cè)接引物。5′側(cè)接引物與野生型SPE-A編碼序列翻譯起始位點上游DNA區(qū)域同源或雜交。較佳的，5′側(cè)接區(qū)域在speA啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)域的上游。例如，5′側(cè)接引物可以與翻譯起始位點上游約760堿基處的區(qū)域同源或雜交，如圖2所示。一種包含上游調(diào)控區(qū)域中的SPE-A啟動子的5′側(cè)引物具有如下序列5′GGT GGA TTC TTG AAA CAGBamH1GTG-3′(SEQ ID NO1)。
下游側(cè)接引物與野生型SPE-A編碼序列終止密碼子下游的DNA區(qū)域同源或雜交。下游側(cè)接引物宜提供轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。例如，3′側(cè)接引物可以與SPE-A編碼序列終止密碼子下游200堿基對的區(qū)域雜交或同源。一種3′側(cè)引物例子具有如下序列5′CCC CCC GTC GAC GAT AAA ATA GTT GCTSalIAAG CTA CAA GCT-3′(SEQ ID NO2)每次PCR反應(yīng)中均存在上游和下游側(cè)接引物，以確保所得PCR產(chǎn)物包括speA啟動子和上游調(diào)節(jié)區(qū)、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本領(lǐng)域技術(shù)人員也很容易構(gòu)建出其它上游和下游引物。天然的speA啟動子和上游調(diào)節(jié)區(qū)沒有絕對必要被包括在PCR產(chǎn)物內(nèi)，盡管這是較佳的。
每種在特定位點處的突變是通過使用內(nèi)部引物而產(chǎn)生的，該內(nèi)部引物含有編碼特定殘基變化的DNA序列。例如，在特定位點的氨基酸取代可用下列內(nèi)部引物來產(chǎn)生突變體 內(nèi)部引物N20D5′AAA AAC CTT CAA GAT ATA TAT TTT CTT-3′(SEQ ID NO3)C87S5′-TCC-ACA-TAA-ATA GCT GAG ATG GTA ATA-TCC-3′(SEQ ID NO4)C90S5′-CTC TGT TAT TTA TCT GAA AAT GCA GAA-3′(SEQ ID NO5)C98S5′CCC TCC GTA GAT CGA TGC ACT CCT TTC TGC-3′(SEQ ID NO6)K157E 5′-CTT ACA GAT AAT GAG CAA CTA TAT ACT-3′(SEQ ID NO7)S195A 5′-CCA GGA TTT ACT CAA GCT AAA TAT CTT ATG-3′(SEQ ID NO8)K16N5′-CAA CTT CAC AGA TCT AGT TTAGTT AAC AAC CTT-3′(SEQ ID NO9)(正向引物)和5′-TTTG AAG GTT GTT AAC TAAACT AGA TCT GTG AAG TTG-3′(反向引物)(SEQ ID NO10)帶下劃線的核苷酸表示，與圖3所示的野生型speA基因相比，核苷酸序列的變化。
內(nèi)部引物可設(shè)計成利用編碼野生型SPE-A的DNA序列(如圖3所示的序列)在某特定位置產(chǎn)生變化。引物可被設(shè)計成在某特定位置(例如上面所示的)處編碼一個特定的氨基酸取代。引物可設(shè)計成使得在特定位點產(chǎn)生隨機取代，如Rennell等，J.Mol.biol.2267(1991)中所述。引物可被設(shè)計成在特定位點處產(chǎn)生氨基酸缺失。引物還可被設(shè)計成使特定位點中加入一個額外氨基酸的編碼序列。
引物宜約為15至50個核苷酸長，更佳的約15至30個核苷酸長。引物宜用自動化合成制得。5′和3′側(cè)接引物宜與編碼野生型SPE-A毒素編碼序列的側(cè)接DNA序列雜交。這些側(cè)接引物宜包括約10個與側(cè)接DNA序列100％同源或互補的核苷酸。內(nèi)部引物并不與編碼該位置氨基酸的DNA序列100％互補，因為它們編碼了該位置的變化。內(nèi)部引物在約15至30個核苷酸長的引物內(nèi)可以有與野生型SPE-A序列不同的1至4個不匹配。此二側(cè)接引物和內(nèi)部引物還包括編碼限制性位點和夾子位點的其它核苷酸，最好靠近引物的末端。根據(jù)已知的原理(如Sambrook等，Molecular Clonging-A Laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989中所述的)，可結(jié)合考慮引物中的不匹配數(shù)目來改變雜交條件。
如果希望在多個位點上變化，則可采用多個內(nèi)部引物。例如，為了產(chǎn)生在改變氨基酸20位天冬酰胺和改變氨基酸157位處的賴氨酸，可以如實施例5中所示的那樣在兩個獨立的反應(yīng)中使用上述的內(nèi)部引物。在Aiyar等人的文獻(同上)中描述了在多個位點上產(chǎn)生位點特異性變化的PCR方法。另一種方法在實施例5中有所描述。
在一種方法中，獲得在一個特定位點有一個變化的編碼SPE-A毒素突變體的DNA序列，然后將其作為模板，以產(chǎn)生在第二個位點有改變的突變型DNA序列。在PCR的第一輪中，采用第一內(nèi)部引物來產(chǎn)生具有第一個變化的突變型DNA序列。然后將具有第一個變化的突變型DNA序列作為模板DNA，用編碼不同位點有變化的第二內(nèi)部引物，形成編碼氨基酸序列中兩個位置有改變的突變型毒素的DNA序列。可用PRC方法來產(chǎn)生編碼氨基酸中有大約2至6個變化的DNA序列。
Perrin等(同上)描述了一種較佳的PCR方法。簡言之，PCR反應(yīng)條件是PCR在100微升反應(yīng)混合物中進行，該混合物含有10mM Tris-HCl(pH＝8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、dNTP各200μM、2ng模板質(zhì)粒DNA、100微微摩爾側(cè)接引物、5微微摩爾內(nèi)部引物、2.5單位Ampli Taq DNA聚合酶(PerkinElmer Cetus)。在第二次擴增步驟中，反應(yīng)混合物的組成如上所述，只是采用了等摩爾濃度(每種5微微摩爾)的側(cè)接引物和巨引物(megaprimer)和1μg模板。PCR進行30次循環(huán)，每次循環(huán)為94℃變性1分鐘、37℃或44℃退火2分鐘和72℃延伸3分鐘。
分離出PCR產(chǎn)物，然后克隆到穿梭載體(如Murray等J.Immunology15287(1994)的方法中構(gòu)建的pMIN 164，可從Dr.Schlievert，University ofMinnesota，Mpls，MN獲得)中。該載體是攜帶氨芐青霉素抗性的大腸桿菌質(zhì)粒pBR328與賦予紅霉素抗性的葡萄球菌質(zhì)粒pE194的嵌合體。用抗野生型SPE-A的多克隆中和抗體(Toxin Technologies，Boca Raton，F(xiàn)la或來自Dr.Schlievert)在大腸桿菌中篩選生產(chǎn)毒素的連接的質(zhì)粒混合物。用Hsiao等，Nucleic Acid Res.192787(1991)的方法對SPE-A毒素突變體進行測序，以確認(rèn)存在所需的突變和不存在其它突變。
用這種方式產(chǎn)生的具體的DNA序列包括編碼N20D型突變體的DNA序列，該序列具有與圖3所示相同的編碼序列，不同點在于939位的腺嘌呤變?yōu)轼B嘌呤。編碼C87S型突變體的DNA序列具有圖3相同的編碼序列，不同點在于1152位的胸腺嘧啶變?yōu)橄汆堰是?154位的胸腺嘧啶變?yōu)榘奏?。編碼C98S型SPE-A突變毒素的DNA序列具有圖3相同的編碼序列，不同點在于1185位的鳥嘌呤變?yōu)榘奏で?186位的胸腺嘧啶變?yōu)轼B嘌呤。編碼C90S型SPE-A毒素突變體的DNA序列具有圖3相同的編碼序列，不同點在于1161位的鳥嘌呤變?yōu)榘奏ぁ＞幋aK157E型SPE-A毒素突變體的DNA序列具有圖3相同的編碼序列，不同點在于1351位的腺嘌呤變?yōu)轼B嘌呤。編碼S195A型SPE-A毒素突變體的DNA序列具有與圖3的編碼序列相同的DNA序列，不同點在于1464位的胸腺嘧啶變?yōu)轼B嘌呤。編碼K16N型SPE-A毒素突變體的DNA序列具有圖3相同的序列，不同點在于941位的腺嘌呤變?yōu)榘奏ぁ?br> 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡并性，許多DNA序列可編碼氨基酸中的相同變化。本發(fā)明包括具有不同核苷酸序列但編碼氨基酸序列中相同變化的DNA序列。
為了在其特定位點產(chǎn)生隨機誘變，可設(shè)計一系列引物，使得該特定位點被取代成其它19種氨基酸的一種或非天然存在的氨基酸或類似物。以上述相似方式或Rennell等(同上)描述的方法進行PCR。亞克隆PCR產(chǎn)物，然后通過與抗野生型SPE-A多克隆中和抗體的免疫反應(yīng)性來監(jiān)測毒素的產(chǎn)生。通過對編碼SPE-A毒素突變體的DNA序列進行測序，可以確認(rèn)氨基酸序列中存在的變化。較佳的，篩選這些毒素突變體，選出了非致死性突變體。
可用其它誘變方法以在編碼野生型SPE-A毒素的DNA序列中產(chǎn)生隨機突變。文中所用的隨機突變或隨機誘變指并非在所選定位點的突變和/或并非是選定的改變。含有編碼野生型SPE-A毒素的DNA序列(較佳地在pMIN 164上)的細(xì)菌宿主細(xì)胞，可用其它各種標(biāo)準(zhǔn)方法(如化學(xué)誘變和UV輻射)來誘變。這種方式產(chǎn)生的突變體，可用抗野生型SPE-A的多克隆中和抗體來篩選以確定有無毒素產(chǎn)生。然而，還需進一步篩選以鑒定毒素突變體在生物活性上是否至少有一種變化，較佳的是非致死性變化。還可篩選自發(fā)產(chǎn)生的突變體中是否有野生型SPE-A生物活性的至少一種變化的突變體。
采用如Anthony-Cahill等，Trends Biochem.Sci.14400(1989)中所述的體外誘變，也可進行隨機誘變。
此外，SPE-A毒素突變體可通過化學(xué)合成來制得。化學(xué)合成蛋白質(zhì)的方法在Wallace，F(xiàn)ASEB J.7505(1993)中有所描述。可合成部分蛋白質(zhì)，然后用酶連接在一起，或直接化學(xué)縮合。采用化學(xué)合成尤其適用于本領(lǐng)域技術(shù)人員在所需位置插入非天然存在的氨基酸。此外，化學(xué)合成尤其適用于制備SPE-A毒素突變體的片段。
本文所述的任何方法均可用來形成SPE-A毒素突變體的片段。另外，片段也很容易通過限制性酶消化和/或連接來產(chǎn)生。產(chǎn)生片段的較佳的方法是通過直接化學(xué)合成(對于20個氨基酸或更少的片段來說)或通過基因克隆(對于較大片段來說)。
編碼突變型毒素的DNA序列無論是定點突變還是隨機突變，均可作進一步篩選，以選出與野生型SPE-A毒素生物活性不同的其它變化。這種篩選至少一種生物活性變化的篩選方法如上所述。一旦選出的DNA序列編碼的SPE-A毒素突變體在生物活性上至少有一種變化，它們就可用來形成表達盒。
表達盒的形成涉及使編碼SPE-A毒素突變體的DNA序列與提供SPE-A毒素突變體在宿主細(xì)胞中表達的啟動子結(jié)合。對于用本文所述的PCR方法產(chǎn)生的那些SPE-A毒素突變體來說，存在天然的speA啟動子可提供在宿主細(xì)胞中表達。
任選地，DNA序列可以與不同的啟動子結(jié)合以在特定類型的宿主細(xì)胞中表達或增強在宿主細(xì)胞中的表達水平。較佳的，啟動子所提供的SPE-A毒素突變體表達水平可被抗SPE-A的抗體檢測到。在原核細(xì)胞中可用的其它啟動子包括PLAC、PTAC、T7等。
一旦將編碼SPE-A毒素突變體的DNA序列與合適的啟動子結(jié)合成表達盒，就將該表達盒亞克隆到合適的轉(zhuǎn)化載體中。合適的轉(zhuǎn)化載體包括至少一種可檢測的標(biāo)記物基因，它最好是能在大腸桿菌和革蘭陽性微生物中擴增的穿梭載體。合適的穿梭載體例子包括pMIN164和pCE104。其它類型的載體包括病毒載體如桿狀病毒載體，SV40，痘病毒如牛痘、腺病毒和巨細(xì)胞病毒。較佳的載體是pMIN164載體，一種可在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中擴增的穿梭載體。
一旦形成了攜帶編碼SPE-A毒素突變體表達盒的轉(zhuǎn)化載體，就將其引入供表達SPE-A毒素突變體的合適宿主細(xì)胞中。合適的宿主細(xì)胞是那些能高水平表達突變型毒素并使其它不需要的分子(如內(nèi)毒素和M蛋白質(zhì))污染可能性最少的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌屬、酵母細(xì)胞以及昆蟲細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣沉淀和電穿孔。較佳的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。
優(yōu)選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞所攜帶的表達盒，編碼在20位氨基酸天冬酰胺處有變化的SPE-A毒素突變體。這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)。被保藏的微生物的特征是攜帶pMIN 164的金黃色葡萄球菌，該pMIN164含有編碼N20D突變的DNA序列，該DNA序列與天然speA啟動子和其他調(diào)控區(qū)域可操作地相連。該微生物是根據(jù)布達佩斯條約進行保藏，其保藏號為69831。
另一種微生物也保藏在ATCC。該微生物是是金黃色葡萄球菌，它攜帶與天然speA啟動子和調(diào)控區(qū)域可操作地相連的野生型SPE-A毒素的DNA編碼序列。該微生物是根據(jù)布達佩斯條約保藏于ATCC，其保藏號為69830。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞可用來大量產(chǎn)生可用于疫苗組合物的突變型SPE-A毒素。轉(zhuǎn)化的微生物可用于活疫苗、減毒疫苗或熱滅活疫苗。轉(zhuǎn)化的微生物包括突變型SPE-A毒素，其用量足以刺激產(chǎn)生抗野生型SPE-A的保護性免疫應(yīng)答。SPE-A毒素突變體宜是分泌的。該微生物最好是對人是不致病的，其包括的突變型毒素具有多個氨基酸變化，以使回復(fù)成毒性形式的可能性最小。根據(jù)已知的原理，微生物可作為活的或熱滅活的疫苗來給藥。作為活疫苗的較佳的微生物是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞如沙門氏菌屬細(xì)菌。
病毒載體也可用于如上所述的疫苗組合物中，該載體包括的表達盒的DNA序列編碼了SPE-A毒素突變體或其片段，其與在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子操作性相連。較佳的，啟動子可在哺乳動物細(xì)胞中起作用。合適的病毒載體例子包括痘病毒如牛痘病毒、腺病毒、巨細(xì)胞病毒等。牛痘病毒載體可用來對人免疫接種以抵抗野生型SPE-A毒素的至少一種生物活性。
本發(fā)明還包括一種疫苗組合物，該組合物包含編碼SPE-A毒素突變體或其片段的核酸序列，該核酸序列與在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子操作性相連。啟動子宜在哺乳動物宿主細(xì)胞中起作用。核酸序列可以是DNA或RNA。將疫苗組合物遞送到宿主細(xì)胞或個體中，使SPE-A毒素突變體或其片段在個體自己的細(xì)胞中表達。SPE-A毒素突變體或其片段的核酸序列在個體中表達提供了抗野生型SPE-A毒素的保護性免疫應(yīng)答。任選地，可將表達盒插入載體中。核酸分子可直接給藥或在病毒載體中給藥。疫苗組合物還可任選地包括將疫苗遞送到細(xì)胞內(nèi)的遞送劑，如脂質(zhì)體等。疫苗組合物還可任選地包括佐劑或其它免疫調(diào)節(jié)性化合物，以及增強細(xì)胞吸收核酸的附加化合物。疫苗組合物可通過各種途徑給藥，包括腸胃外途徑如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或與粘膜表面接觸。
大規(guī)模生長和生產(chǎn)SPE-A毒素突變體的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。從微生物來源純化SPE-A毒素突變體的方法如下。使在pMIN164中攜帶的野生型speA或突變體的金黃色葡萄球菌在37℃、通氣下在可透析牛心培養(yǎng)基(含5微克/毫升紅霉素)中生長至靜止階段。用四倍體積乙醇使培養(yǎng)物沉淀，將蛋白質(zhì)重新溶解在無熱原水中。使粗制品在3.5至10和4至6的pH梯度中進行連續(xù)平臺等電點聚焦分離。用無熱原水對經(jīng)抗體反應(yīng)性試驗具有毒性的陽性級分進行充分透析，在15％(重量/體積)膠中通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來測試每一部分取樣的純度?？筍PE-A的多克隆中和抗體購自Toxin Technologies，Boca Raton，F(xiàn)la或Dr.Schlievert?？刹捎闷渌兓椒?，包括柱層析或HPLC。
通過下列實施例可更好地了解本發(fā)明，它們代表了較佳的實例，但不應(yīng)被理解成限制了本發(fā)明的范圍。
實施例1野生型SPE-A的克隆和表達按Johnson等人，Mol.Gen.Genet.19452-56(1984)所述的方法，從大腸桿菌中克隆編碼野生型SPE-A毒素的基因(speA)。簡而言之，通過對E.Coli RR1中pBR322中的噬菌體T12 DNA的Hind III消化片段進行克隆，鑒別出speA基因。用針對A毒素的多克隆中和抗血清，通過鑒別產(chǎn)生毒素的陽性轉(zhuǎn)化子而挑選出轉(zhuǎn)化子。A毒素的核苷酸序列由Weeks等人，Inf.Imm.52144(1986)所報道。
含有speA基因的DNA序列被亞克隆，然后在金黃色葡萄球菌中表達。攜帶在大腸桿菌質(zhì)粒上的speA，用限制性內(nèi)切酶Hind III和SalI消化。片段被純化并連于pMIN164(可如前所述獲得)的Hind III-SalI位點。載體pMIN164是葡萄球菌質(zhì)粒pE194(攜帶紅霉素抗性)和大腸桿菌載體pBR328(攜帶Amp和Tet抗性)構(gòu)成的嵌合載體。將speA克隆入該載體的Hind III-SalI時，會破壞Tet抗性。在該質(zhì)粒中直接位于克隆基因上游的啟動子是天然的speA啟動子。
通過雙免疫擴散分析，用本發(fā)明人實驗室制備的針對SPE-A毒素的多克隆中和抗體檢測毒素來證實speA基因的表達。
實施例2將重組產(chǎn)生的野生型SPE-A給兔進行施用和免疫將重組產(chǎn)生的SPE-A給動物施用，可誘發(fā)STSS。用重組產(chǎn)生的SPE-A免疫動物，可減少動物在被M3或M1鏈球菌侵襲時的死亡率，并且可保護動物免患STSS。
施用SPE-A可在兔中誘發(fā)STSS。通過將用微型滲透泵將SPE-A皮下植入，已建立了STSS的兔模型動物。Lee等人，Infect Immun.59879(1991)。這些泵被設(shè)計成在7天時間內(nèi)釋放恒定數(shù)量的毒素，從而使動物持續(xù)暴露于毒素。將重組產(chǎn)生的SPE-A給予家兔，7天內(nèi)總劑量為0.2毫升內(nèi)的200μg。結(jié)果表明，用SPE-A處理過的動物產(chǎn)生STSS癥狀，幾乎所有動物均在7天內(nèi)死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。家兔STSS癥狀包括體重下降、腹瀉、臉部出現(xiàn)花斑、發(fā)熱、結(jié)膜和粘膜變紅、透明棕色尿液。如所預(yù)計的那樣，未用毒素處理過的對照動物保持健康。主要作了以下其它兩項觀察1)如預(yù)計的那樣，體液替換可完全保護動物；和2)沒有一只經(jīng)毒素處理過的動物發(fā)生壞死性筋膜炎和肌炎，這表明軟組織損傷還需要其他因素，或者在SPE-A之外的其他因素。
STSS臨床特征的發(fā)生與施用SPE-A是相關(guān)的。注射SPE-A陽性鏈球菌的兔子會患STSS，而注射SPE-A陰性鏈球菌的兔子不顯示STSS的癥狀。
眾所周知，SPE-A是某些A類鏈球菌產(chǎn)生的可變性狀。SPE-A基因是由噬菌體T12編碼的，并且特性已很清楚的鏈球菌菌株已表明，差別僅在于是否存在被稱為“T12噬菌體”的SPE-A噬菌體。鏈球菌菌株T253 T12自愈型(cured T12)可產(chǎn)生SPE-A(陽性)，而T253自愈型是SPE-A陰性。
按Scott等人，Infect Immunity 39383(1983)所述的方法，用SPE-A陽性鏈球菌T253 T12自愈型或用SPE-A陰性T253自愈型對兔子進行皮下注射(注入移植的Wiffle高爾夫球中)。結(jié)果示于表1。結(jié)果表明，用SPE-A陽性鏈球菌注射的動物患有STSS臨床特征，并且8只動物中6只死亡。2只存活的動物產(chǎn)生了抗SPE-A的抗體。與之相反，毒素陰性菌株(即T253自愈型)僅引起發(fā)熱，而且沒有觀察到死亡，即使是在高得多的細(xì)菌細(xì)胞濃度下。與以前的動物模型試驗一致，沒有觀察到軟組織壞死。此外，鏈球菌仍維持在高爾夫球中，這暗示這些鏈球菌菌株不是高度侵襲性的。
表1在Wiffle球兔模型中，speA對STSS的引發(fā)作用處理方式最高溫度平均值(℃)死亡數(shù)/總數(shù)無 39.10/4T253 T12自愈型*41.26/8IT253 自愈型*40.70/6T253 自愈型+41.00/6* 約1×108細(xì)胞+ 約1×1011細(xì)胞I 2只存活動物產(chǎn)生了抗SPE-A的抗體用重組產(chǎn)生的SPE-A來免疫動物，可減少兔子在用M3或M1鏈球菌侵襲時的死亡率。用衍生自金黃色葡萄球菌的克隆SPE-A來免疫兔子，以防止動物被污染性的鏈球菌產(chǎn)物(如M蛋白)免疫的可能性。對照動物沒有對SPE-A進行免疫。兔子皮下接受乳化于不完全Freund氏佐劑中的50微克重組產(chǎn)生的SPE-A。在9天之后，皮下注射25毫升生長于透析的牛心培養(yǎng)基中的M3(1.4×109總CFU)或M1(4.2×109總CFU)鏈球菌，對兔子進行侵襲。M1和M3鏈球菌分離株是臨床分離株。M1分離株被命名為MNST，M3分離株被命名為MNBY。這些分離株可從Dr.Schlievert，University of Minnesota，Mpls.MN獲得。
表2的數(shù)據(jù)顯示了這些試驗的驚人結(jié)果。
表2事先進行抗SPE-A免疫，可保護兔子免受M3或M1鏈球菌所引發(fā)的 STSS(壞死性筋膜炎和肌炎)動物數(shù)目免疫劑*侵襲劑+存活數(shù)目I/總數(shù)20 -- M34/20P＜＜0.001′20 SPE-AM3 16/1917 -- M19/17P＜0.04′15 SPE-AM1 13/15*動物的免疫針對從金黃色葡萄球菌制備的克隆SPE-A；針對SPE-A的ELISA效價大于10,000。
+皮下注射生長于透析的牛心培養(yǎng)基中的M3(1.4×109總CFU)或M1(4.2×109總CFU)鏈球菌，對動物進行侵襲I根據(jù)University of Minnesota Animal Care Committee的指南，使用M3鏈球菌的試驗在24小時后終止，使用M1鏈球菌的試驗在48小時后終止。
′用Fisher精確概率測試法確定P值。
如所示的那樣，在用M3鏈球菌侵襲下，19只SPE-A免疫的兔子中的16只存活下來，而20只未免疫動物中僅4只存活。存活的免疫動物顯示出明顯的形成內(nèi)含的軟組織膿腫，對膿腫進行液體檢查，發(fā)現(xiàn)充滿了PMN。類似的結(jié)果在M1鏈球菌的研究中也獲得，不同點在于M1菌的毒性沒有M3菌的毒性強(表2)。使用了較高數(shù)目的M1鏈球菌，并觀察到兔子死亡率的下降，即使在未免疫的對照動物中。這可能反映了，與M3菌株相比，M1菌株的SPE-A產(chǎn)量要低約50倍。
與之相反，未免疫動物中都不顯示膿腫，對2/2動物進行液體檢查揭示，沒有PMN浸潤液。這些結(jié)果表明，SPE-A免疫動物和未免疫動物之間的一個主要差別，似乎是是否會引起炎癥反應(yīng)。以前的工作表明，SPE-A以及其他致熱的毒素超抗原會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的TNF-α。TNF-α大大降低了PMN趨化性，這表觀上是通過對趨化受體的下調(diào)作用。因此，據(jù)信試驗結(jié)果顯示了，在SPE-A免疫動物中抗體通過中和SPE-A而阻斷了巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，從而產(chǎn)生了保護性的炎癥反應(yīng)。在未免疫的動物中，SPE-A造成TNF-α的大量釋放，這又防止了產(chǎn)生保護性的趨化反應(yīng)。
至關(guān)重要的是，應(yīng)注意所有死亡的動物(除了一只動物)都表現(xiàn)出廣泛的軟組織損傷，其證據(jù)是整側(cè)變?yōu)樽虾谏以谠S多情況下出現(xiàn)腐肉。免疫組中有一只動物在免疫后死亡。在這些動物的組織中缺乏可檢測的炎癥，這暗示是鏈球菌因子而不是宿主的免疫應(yīng)答造成了壞死性筋膜炎和肌炎。其他胞外因子可能也造成軟組織損傷，例如SPE B和鏈球菌溶血素O和S。
所有上述數(shù)據(jù)構(gòu)成了一個有力的例子，它說明了存在的致熱毒素超抗原(尤其是SPE-A)，在患STSS的過程中起著致病作用。
實施例3對編碼SPE-A的DNA序列進行定點誘變用定點誘變法鑒別出SPE-A分子中對生物活性至關(guān)重要的位置。如下所述，在分子的各區(qū)域引入單氨基酸變化。
SPE-A的三維結(jié)構(gòu)模型示于圖1。該模型結(jié)構(gòu)是用Insight/Homology程序(BioSym Corp.，San Diego，CA)，通過同源法構(gòu)建的。該分子已鑒別出下列結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域 對應(yīng)的氨基酸螺旋2 11-15N端α-螺旋，螺旋3 18-26結(jié)構(gòu)域B-β鏈鏈1 30-36鏈2 44-52鏈3 55-62鏈4 75-83鏈5 95-106中央α-螺旋，螺旋5142-158結(jié)構(gòu)域A-β鏈鏈6 117-126鏈7 129-135鏈8 169-175鏈9 180-186鏈10 213-220螺旋4 64-72螺旋6 193-202
氨基酸編號根據(jù)圖3的序列給出。
在每個結(jié)構(gòu)域中挑選氨基酸，并改變分子中的半胱氨酸殘基。特別優(yōu)選的區(qū)域是N端α-螺旋(18-26)；中央α-螺旋(142-158)；結(jié)構(gòu)域Aβ鏈和結(jié)構(gòu)域Bβ鏈。
如前所述，用計算機程序通過比較一級氨基酸序列和/或三維結(jié)構(gòu)相似性或同源性，在致熱毒素家族里保守氨基酸中挑選誘變靶殘基。挑選每個氨基酸的改變形式，使得在具體位點處改變殘基的氨基酸側(cè)鏈的特性。例如，在3個殘基(87、90和98)處，用絲氨酸替換半胱氨酸，從而改變分子的巰基(sulphydryl)。在另三個氨基酸殘基處，改變所述位點處存在的電荷。例如，將賴氨酸改為谷氨酸(157)，將賴氨酸改為天冬酰胺(16)，以及將天冬酰胺改為天冬氨酸(20)。
其他氨基酸可影響毒素與II類MHC分子的相互作用。在另一分子中，TSST-1的N端β桶鏈，對于與II類MHC分子的α和β鏈接觸是至關(guān)重要的。因此，在結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域B的β鏈處的改變，對于控制這些分子與II類MHC分子的相互作用可能是重要的。此外，還可用隨機誘變和在特定位置處用其他19種氨基酸中的每一種來進行替換，從而得到殘基的改變，然后再選擇生物活性(例如致死性)改變的突變體。
突變的SPE-A分子是通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定點誘變法制備的，其中模板DNA是來自噬菌體T12的克隆SPE-A基因。對于每個產(chǎn)生的突變，使用引物。每個突變的產(chǎn)生涉及使用如下三種引物上游5′側(cè)引物，包含編碼氨基酸變化的改變的DNA序列的內(nèi)部引物，和下游一側(cè)的引物。上游一側(cè)的引物在每個PCR反應(yīng)中都被包括，而且該引物與翻譯起始位點上游約760堿基處的DNA區(qū)域同源，其序列如下5′GGT GGA TCC TTG AAA CAG GTG CA-3′(SEQ ID NO11)BamH1形成的PCR產(chǎn)物包含speA啟動子和可能的上游調(diào)控區(qū)域。下游一側(cè)引物與終止密碼子下游約270堿基處的區(qū)域互補，其序列如下5′CCC CCC GTC GAC GAT AAA ATA GTT GCT AAGSalICTA CAA GCT-3′(SEQ ID NO2)
每次PCR反應(yīng)中均存在下游側(cè)接引物，并且因為引物所處的位置所以PCR產(chǎn)物含有假定的轉(zhuǎn)錄終止序列。
每種在特定位點處的突變是通過使用內(nèi)部引物而產(chǎn)生的，該內(nèi)部引物含有編碼特定殘基變化的DNA序列。例如，用于產(chǎn)生各突變的內(nèi)部引物如下突變體 內(nèi)部引物N20D5′AAA AAC CTT CAA GAT ATA TAT TIT CTT-3′(SEQID NO3)C87S5′-TCC-ACA-TAA-ATA GCT GAG ATG GTA ATA-TCC-3′(SEQ ID NO4)C90S5′-CTC TGT TAT TTA TCT GAA AAT GCA GAA-3′(SEQID NO5)C98S5′CCC TCC GTA GAT CGA TGC ACT CCT TTC TGC-3′(SEQ ID NO6)K157E 5′-CTT ACA GAT AAT GAG CAA CTA TAT ACT-3′(SEQID NO7)S195A 5′-CCA GGA TTT ACT CAA GCT AAA TAT CTT ATG-3′(SEQ ID NO8)K16N5′-CAA CTT CAC AGA TCT AGT TTAGTT AAC AAC CTT-3′(SEQ IDNO9)(正向引物)和5′-T TTG AAG GTT GTT AAC TAAACT AGA TCT GTG AAG TTG-3′(SEQ ID NO10)(反向引物)帶下劃線的核苷酸表示，與編碼野生型SPE-A的DNA序列相比，編碼序列有變化。
PCR如下進行簡而言之，在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，混合不同摩爾的下游側(cè)接引物和正向引物，該正向引物橫跨突變位點并且含有產(chǎn)生氨基酸變化所需的核苷酸取代。獲得的DNA產(chǎn)物在鏈中普遍含有突變。該產(chǎn)物(即巨引物)可以長數(shù)百堿基，通過1％瓊脂糖凝膠電泳將其分離出來，然后用Geneclean試劑盒按制造商的建議(Bio 101，La Jolla，California)進行洗脫。
簡言之，PCR反應(yīng)條件是PCR在100微升反應(yīng)混合物中進行，該混合物含有10mM Tris-HCl(pH＝8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、dNTP各200μM、2ng模板質(zhì)粒DNA、100微微摩爾側(cè)接引物、5微微摩爾內(nèi)部引物、2.5單位Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)。在第二次擴增步驟中，反應(yīng)混合物的組成如上所述，只是采用了等摩爾濃度(5微微摩爾)的側(cè)接引物和巨引物(megaprimer)和1μg模板。PCR進行30次循環(huán)，每次循環(huán)為94℃變性1分鐘、37℃或44℃退火2分鐘和72℃延伸3分鐘。雜交條件可按照已知的原則根據(jù)引物大小、錯配和GC含量而加以改變。
含有speA克隆基因和側(cè)翼序列的質(zhì)粒被用作模板。在第二步驟中，巨引物和上游側(cè)接引物被等摩爾地合并入反應(yīng)混合物中，從而產(chǎn)生全長的突變speA。
突變的speA用合適的限制性酶消化，然后克隆入穿梭載體pMIN164中。該載體是攜帶氨芐青霉素抗性的大腸桿菌質(zhì)粒pBR328與賦予紅霉素抗性的葡萄球菌質(zhì)粒pE194的嵌合體。連接的質(zhì)粒混合物被轉(zhuǎn)化，并在大腸桿菌中選擇和篩選。用雙免疫擴散分析所確定的產(chǎn)生毒素的陽性克隆，用Hsiao(同上)的方法進行測序，以證實存在所需的突變并且沒有其他突變。然后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌RN4220(可從Richard Novick，Skirball Institute，New York，NY獲得)，以便表達和生產(chǎn)突變毒素。
在pMIN164中攜帶突變型或野生型speA的金黃色葡萄球菌，在含5微克/毫升紅霉素的透析牛心培養(yǎng)基中，于37℃通氣生長至穩(wěn)定期。用4倍體積的乙醇沉淀培養(yǎng)物，蛋白質(zhì)重溶解于無熱原的水中。對粗制品在3.5-10和4-10的pH梯度下，進行連續(xù)的平板等電聚焦分離。對于通過抗體反應(yīng)而確定的毒素陽性組份，用無熱原的水充分進行透析。然后各取一份樣品，在15％(重量/體積)凝膠上用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定純度(數(shù)據(jù)未給出)。制備的所有突變體都與天然毒素一樣能夠耐60分鐘的胰蛋白酶(2微克/微克SPE-A)處理，這一現(xiàn)象以及保留與針對天然SPE-A的多克隆抗體的反應(yīng)性，都表明引入的突變沒有造成毒素總體結(jié)構(gòu)的改變。用這些方法，產(chǎn)生了7種在氨基酸序列中有單氨基酸取代的突變體。
實施例4SPE-A突變體的生物活性情況對突變毒素的生物活性進行評估，并與野生型SPE-A的生物活性進行比較。測試了突變毒素的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力(超抗原性)、增強宿主對內(nèi)毒素休克易感性的能力、以及患毒素休克綜合癥的能力和致死性。
測量刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，以兔脾細(xì)胞DNA中[3H]胸苷的摻入量表示。在96孔微量滴定板中進行標(biāo)準(zhǔn)的4天促有絲分裂性測試。每個孔含有2×105個懸浮于200微升RPMI 1640(Gibco，Grand Island，NY)(其中補充有25mMHEPES，2.0mM L-谷氨酰胺，100U青霉素，100微克/毫升鏈霉素和2％熱滅活的FCS)中的兔脾細(xì)胞。一式四份地加入20微升外毒素樣品，最終數(shù)量是1微克至10-5微克/孔。一式四份地將20微升RPMI加至脾細(xì)胞，以測定細(xì)胞增殖背景。在增濕箱中于37℃和7％二氧化碳中孵育3天之后，將1.0μCi(20微升體積的5-[甲基-3H]-胸苷(46Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL))加至各孔中，并孵育18小時。在玻璃纖維過濾器中收集細(xì)胞DNA，用液閃計數(shù)法測定[甲基-3H]-胸苷的摻入量。用3個不同的兔供體進行了3次獨立的分析。在3次分析中，每次都一式四份地測試外蛋白(exoprotein)的濃度。結(jié)果以CPM表示。
在American Dutch Belted兔中，測試增強宿主對內(nèi)毒素休克易感性的能力。重量1-2千克的動物，在其耳邊緣靜脈中注射5微克/千克體重的SPE-A(等于1/50的LD50)，然后在4小時后IV注射1或10微克/千克體重的來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的內(nèi)毒素(約為LD50的1/100)。對照兔子接受PBS注射。在48小時后監(jiān)測動物的死亡情況。
還用微型滲透泵測量了致死性，其中將含有200微克毒素的微型滲透泵皮下植入American Dutch Belted兔中。將各種蛋白(200微克)注入微型滲透泵(Alzet，AlzaCo，Palo Alto，CA)的0.2毫升PBS中。泵被設(shè)計成能在7天時間內(nèi)輸送恒定數(shù)量的毒素。在8天之內(nèi)，每天3次觀察兔子是否有毒素休克綜合癥例如腹瀉、結(jié)膜和耳的紅斑、休克和死亡。
促T細(xì)胞有絲分裂性研究的結(jié)果示于圖4、5和6。結(jié)果表明，N20D突變蛋白的超抗原性(即促T細(xì)胞有絲分裂性活性)下降了5倍。C87S和C98S突變體的促T細(xì)胞有絲分裂性也下降了4倍。因此，幾種突變都影響了超抗原性(即促T細(xì)胞有絲分裂性)這一生物活性。
內(nèi)毒素休克增強和致死性的結(jié)果示于下表3、4和5中。表3 分析當(dāng)SPE-A-K16N和SPE-A-N20D以皮下微型滲透泵形式輸送時，所造成的內(nèi)毒素增強能力或致死性。數(shù)據(jù)表示為死亡數(shù)與全部測試兔子數(shù)目之比蛋白質(zhì)SPE-A K16N N20D內(nèi)毒素增強 3/36/7 0/31μg/kg內(nèi)毒素)微型滲透泵輸送時的致死性3/4ND0/4表4 分析當(dāng)突變體SPE-A-C87S、SPE-A-C90S和SPE-A-C98S以皮下微型滲透泵形式輸送時，誘發(fā)內(nèi)毒素增強的能力或致死性。數(shù)據(jù)表示為死亡數(shù)與測試兔子總數(shù)之比蛋白質(zhì)SPE-A C87S C98S C90S內(nèi)毒素增強1μg/kg體重 2/31/3 0/3ND內(nèi)毒素增強10μg/kg體重 2/33/3 1/3ND微型滲透泵輸送時的致死性3/4NDND3/3表5 分析當(dāng)突變體SPE-A-K157E和SPE-A-S195A以皮下微型滲透泵形式輸送時，誘發(fā)致死的能力。數(shù)據(jù)表示為死亡數(shù)與測試兔子總數(shù)之比蛋白質(zhì)SPE-A K157E S195A微型滲透泵輸送時的致死性6/80/43/3結(jié)果表明，當(dāng)用任一種STSS模型測試時，用N20D突變體處理的動物都不患STSS。N20D突變位于靠近毒素背部深溝的結(jié)構(gòu)化的α螺旋中(圖1)。該殘基對于分子的超抗原性和致死性功能都至關(guān)重要。
消除巰基因而干擾可能存在的二硫鍵的突變，對于SPE-A的生物活性有多種效應(yīng)，這取決于突變哪個半胱氨酸殘基。C90S突變體完整地保留了致死性(表4)，而且T細(xì)胞刺激活性也沒有明顯下降(圖5a)。與之相反，C87S和C98S突變使毒素的促有絲分裂性下降了約4倍(圖5b)。然而，這兩種突變對導(dǎo)致內(nèi)毒素休克的能力的影響是不同，C98S僅有弱毒性，但C87S是強毒性的(表4)。對于這些結(jié)果的解釋基于這3個半胱氨酸在一級序列和三維結(jié)構(gòu)中的相對位置(圖1)。缺少C98的巰基可防止形成葡萄球菌內(nèi)毒素中所見的二硫鍵，因而環(huán)的結(jié)構(gòu)會喪失。如果在該環(huán)中的氨基酸，負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體的接觸或者具有該分子生物活性的某種其他功能，那么這對活性有不利影響。在C87S突變情況下，假定的二硫鍵仍可在C90和C98之間形成，從而保留了大多數(shù)結(jié)構(gòu)并因而保留了活性。
K157E突變體(突變位于長的中央α-螺旋中)，保留了完整的超抗原性(圖6a)，但是用微型滲透泵輸送給兔子時卻是不致死的(表6)。
殘基S195A是α-5螺旋的一部分，它可能對于所測試的生物活性是不重要的，因為該突變對所測試的活性的影響并不大。該殘基可能并不暴露于外部環(huán)境，或者可能對結(jié)合不作出貢獻。
這些結(jié)果顯示，通過在數(shù)個位點上的突變，可以影響致死性和超抗原性。在N端α-螺旋的殘基(N20D)和中央α-螺旋的殘基(K157E)發(fā)生突變，可影響致死性。在N端α-螺旋處的突變以及改變巰基都可影響促有絲分裂性。
這些結(jié)果還顯示，促有絲分裂性和致死性是相互獨立的活性，因為可產(chǎn)生影響致死性但不影響促有絲分裂性的突變體(K157E)，以及影響促有絲分裂性但不影響致死性的突變體(C87S)。
實施例5用PCR制備雙突變體和三突變體有多種方法可用于產(chǎn)生雙或三突變SPE-A毒素或片段。
在氨基酸序列中有2個或多個變化的SPE-A毒素突變體，可以如前所述用PCR法進行制備。在第一次PCR反應(yīng)中，將第一個內(nèi)部引物(編碼選定位點處第一個變化)與5′和3′側(cè)接引物聯(lián)合使用，以產(chǎn)生第一PCR產(chǎn)物。第一PCR產(chǎn)物是一DNA序列，它編碼氨基酸序列中有一個變化的SPE-A毒素突變體。然后，將該第一PCR產(chǎn)物作為模板DNA，以產(chǎn)生與具有野生型SPE-A活性的蛋白質(zhì)相比氨基酸序列中有2個變化的第二PCR產(chǎn)物。第一PCR產(chǎn)物是與第二內(nèi)部引物(編碼第二位點處的氨基酸變化)相結(jié)合的模板DNA。第二內(nèi)部引物還與5′和3′側(cè)翼引物聯(lián)合使用，從而形成第二PCR產(chǎn)物。第二PCR產(chǎn)物是一DNA序列，它編碼氨基酸序列中有二個位點變化的SPE-A毒素突變體。接著，將第二PCR產(chǎn)物用作第三次反應(yīng)中的模板，從而形成編碼氨基酸序列中有3個位點變化的SPE-A毒素突變體的產(chǎn)物DNA序列。這種方法可用于產(chǎn)生編碼氨基酸序列中有一個以上位點變化的突變毒素的DNA序列。
另一種制備編碼多個變化的DNA序列的方法，是通過自動化合成來制得編碼氨基酸序列中變化的DNA序列片段。然后用幾種獨特的限制性位點將片段亞克隆到野生型SPE-A編碼序列中。限制性位點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，且很容易根據(jù)野生型SPE-A毒素的DNA序列來確定。用Revi等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)161030(1988)中所述的三片段連接方法，在一個步驟中實現(xiàn)克隆。
突變體D45N是用體外定點誘變系統(tǒng)Altered Sites II(Promega，Madison，WI)獲得的。經(jīng)speA的1.75kb BamHI-SalI片段亞克隆入誘變試劑盒(Promega)所提供的載體pAlter中。誘變寡核苷酸是CTT TTA TCT CAC AAT TTA ATA TAT AAT G。誘變反應(yīng)按制造商的建議進行。
產(chǎn)生三突變體用單氨基酸突變體(例如剛在上面論述過的D45N)來產(chǎn)生雙突變體和三突變體，這是通過將攜帶所需的新突變speA片段亞克隆入具有單或雙speA突變的質(zhì)粒中。表10描述了用于交換DNA片段的獨特限制性位點以及用于各亞克隆程序的接受質(zhì)粒。對突變體在新引入突變的區(qū)域內(nèi)進行測序，以證實亞克隆是成功的。
表10 引入SPE-A的多重突變以及用于發(fā)生交換以便從單突變體產(chǎn)生多突變體的限制性片段的清單突變體 限制性片段 供體 受體N20D/D45N/C98S步驟1 SalI-BstEII D45N N20D步驟2 BamHI-BfrI N20D/D45N C98S實施例6與單突變體和雙突變體相關(guān)的毒性研究根據(jù)刺激兔脾細(xì)胞增殖的能力，來評估野生型SPE-A、SPE-A N20D、SPE-AK157E、SPE-A N20/C98S和SPE-A N20D/K157E的超抗原性(見圖7和8)。
雙突變體SPE-A(N20D/C98S，N20D/K157E)是用上述的技術(shù)通過PCR誘變法制得的。將突變的SPE-A基因speA N20D作為模板DNA來引入第二個突變。如上對雙突變基因進行測序，以保證僅存在所指出的變化。只存在所需的變化。
在SPE-A和SPE-A突變體存在下，體外培養(yǎng)兔脾細(xì)胞3天，接著在加入1μCi/孔3H胸苷后再培養(yǎng)一天。摻入淋巴細(xì)胞DNA的3H胸苷摻入量，被用作T細(xì)胞增殖的測量值。超抗原性指數(shù)的計算是在刺激細(xì)胞中3H胸苷摻入的平均計數(shù)/分鐘除以在無SPE-A或突變體下培養(yǎng)的細(xì)胞的平均計數(shù)/分鐘。
野生型SPE-A在1至0.001微克/孔的劑量下有顯著的超抗原性(圖7)。SPE-AK157E在0.01和0.001微克/孔的劑量下有顯著的促有絲分裂性(圖7)。三種其他的SPE-A突變體(SPE-A N20D、SPE-A N20D/C98S、SPE-A N20D/K157E)在1至0.001微克的劑量下有明顯低于野生型SPE-A的超抗原性(p＜0.001)。有趣的是，在1和0.1微克的劑量下，N20D的超抗原性明顯高于SPE-A N20D/C98S(圖8)(分別為p＜0.0005、p＜0.001)。此外，在1微克/孔劑量下，SPE-A N20D的促有絲分裂性高于SPE-A N20D/K157E(P＜0.01)。因此，數(shù)據(jù)表明N20D/C98S突變體的毒性小于N20D單突變體，而N20D/K157E雙突變體的毒性介于其他兩種蛋白質(zhì)之間。所有3種突變體的毒性都明顯低于野生型SPE-A。
在第二個試驗中，先用10微克/千克的SPE-A或突變體，然后在4小時后用內(nèi)毒素(5微克/千克)通過靜脈注射方式侵襲兔子(3只/組)。監(jiān)測動物48小時，以觀察是否有因施用SPE和內(nèi)毒素而導(dǎo)致致死性上升。該分析是體內(nèi)測定SPE-A致死活性最靈敏的方法。如表6所示，在3只用野生型SPE-A和內(nèi)毒素侵襲的動物中沒有一只存活。與之相反，用SPE-A N20D侵襲的動物中除了一只以外都存活，而且用SPE-AN20D/C98S或SPE-A N20D/K157E侵襲的所有動物都存活。
表6 SPE-A(10μg/kg)或突變體(10μg/kg)在增強兔子對內(nèi)毒素致死性的易感性方面的能力SPE A或突變體死亡數(shù)/總數(shù)野生型SPE A 3/3SPE A N20D 1/3SPE A N20D/C98S 0/3SPE A N20D/K157E0/3注SPE-A或突變體是在0小時時靜脈注射的，而內(nèi)毒素是在4小時時靜脈注射的。對動物監(jiān)測48小時，以觀察致死性。
在第三個試驗中，兔子用SPE-A N20D、SPE-A N20D/C98S、或SPE-AN20D/K157E免疫，然后用野生型SPE-A(10微克/千克)和內(nèi)毒素(5微克/千克或25微克/千克)如前面實施例那樣進行侵襲。對照動物沒有被免疫，但用野生型SPE-A加內(nèi)毒素進行侵襲。兔子是通過每隔一周共注射2次而進行免疫，其中所用的突變蛋白(50微克/每次注射)被乳化于不完全佐劑(Freunds，Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)中。接著，兔子休息一周，再用野生型毒素進行侵襲。野生型SPE-A和內(nèi)毒素的組合是20 LD50時用10微克/千克SPE-A和5微克/千克內(nèi)毒素，而100LD50時用10微克/千克SPE-A和25微克/千克內(nèi)毒素。
如表7所示，用100 LD50的SPE-A和內(nèi)毒素侵襲的所有動物都死亡。類似地，用SPE-A N20D或N20D/K157E免疫的所有動物，當(dāng)用20 LD50 SPE-A和內(nèi)毒素侵襲時也都死亡。與之相反，用雙突變體N20D/C98S免疫的動物卻存活了。用雙突變體N20D/K157E免疫的動物比其他動物死亡得更早。上述數(shù)據(jù)表明，雙突變體尤其是SPE-A N20D/C98S可有效地作為測試動物的類毒素疫苗。
表7用SPE-A突變體免疫兔子，以對抗野生型SPE-A的增強對致死性內(nèi)毒素休克易感性方面的能力免疫劑SPE-A和內(nèi)毒素的侵襲劑量 死亡數(shù)/總數(shù)無10μg/kg SPE A，25μg/kg內(nèi)毒素 3/3SPE A N20D10μg/kg SPE A，25μg/kg內(nèi)毒素 2/2SPE A N20D/C98S 10μg/kg SPE A，25μg/kg內(nèi)毒素 2/2SPE A N20D/K157E 10μg/kg SPE A，25μg/kg內(nèi)毒素 2/2無10μg/kg SPE A，5μg/kg內(nèi)毒素 3/3SPE A N20D10μg/kg SPE A，5μg/kg內(nèi)毒素 2/2SPE A N20D/C98S 10μg/kg SPE A，5μg/kg內(nèi)毒素 0/3SPE A N20D/K157E 10μg/kg SPE A，5μg/kg內(nèi)毒素 3/3注一些動物在該次試驗時逃走。這些動物沒有包括在上述數(shù)據(jù)中。
實施例7用針對SPE-A突變體的抗體抑制SPE-A以及用SPE-A突變體免疫從每只用N20D、N20D/C98S和N20D/K157E SPE-A免疫的和未免疫的對照兔子的耳邊緣靜脈，抽取1毫升血液。在最后一次免疫后6天(在動物被用于表6所示的試驗之前一天)，動物被放血。在血塊凝結(jié)之后，通過離心(13,000×g，10分鐘)分離出血清。將來自各組的血清合并在一起，并用33 1/3％的硫酸銨(終濃度)在室溫下處理1小時，以沉淀出免疫球蛋白。沉淀的免疫球蛋白通過離心(13,000×g，10分鐘)收集，重新溶解于磷酸鹽緩沖液(0.005M磷酸鈉，pH7.0，0.15M氯化鈉)至原來的體積，用1升0.15M氯化鈉于4℃透析24小時。透析液被過濾滅菌(0.45微米孔徑)，然后在研究中用于中和0.01微克SPE-A對兔脾細(xì)胞的促有絲分裂性(超抗原性)(圖9)。來自一只用亞致死劑量的野生型SPE-A免疫的兔子的血清，被可比地進行分級并用作陽性對照。將來自各組血清的20微升免疫球蛋白組份(Ig)，用完全RPMI 1640哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基進行1/5和1/50稀釋(相對于原血清體積進行稀釋)，然后在我們標(biāo)準(zhǔn)的促有絲分裂性分析中加至4個孔中，每個孔含有野生型SPE-A和2×105兔脾細(xì)胞。在0時刻，將Ig和野生型毒素都加至淋巴細(xì)胞。結(jié)果示于圖9。
1/5稀釋的Ig，無論是來自免疫的動物還是未免疫的對照動物，都可抑制脾細(xì)胞增殖，這可能是因為在Ig中殘留有硫酸銨。然而，來自SPE-A免疫動物的Ig和來自N20D、N20D/C98S和N20D/K157E免疫動物的Ig，其抑制性高于未免疫的對照(SPE-A對未免疫對照的p＝0.006；N20D對未免疫對照的p＝0.035；N20D/C98S對未免疫對照的p＝0.0002；N20D/K157E對未免疫對照的p＝0.0001，其中用Student氏測試分析法對正態(tài)分布的非配對數(shù)據(jù)進行分析)。這表明了對促有絲分裂性的特異性抑制。
當(dāng)Ig以1/50稀釋度加入時，與未免疫的對照相比，雙突變體N20D/C98S造成了脾細(xì)胞增殖的明顯抑制(p＝0.046)。在該Ig濃度下，沒有一種組份導(dǎo)致淋巴細(xì)胞促有絲分裂性的非特異性抑制。
這些數(shù)據(jù)暗示，雙突變體N20D/C98S能比單突變體N20D或另一個雙突變體N20D/K157E更好地免疫動物，以對抗野生型SPE-A的促有絲分裂性。然而，雙突變體N20D/K157E是比單突變體N20D更好的免疫原。在不受以下限制的情況下，可能在N20D/C98S突變體中的兩個變化干擾了與致死性有關(guān)的宿主細(xì)胞受體位點、T細(xì)胞受體相互作用，并可能間接地干擾了抗原呈遞細(xì)胞上II類MHC的相互作用。因為II類MHC相互作用取決于在毒素標(biāo)準(zhǔn)視圖中β桶結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域B)的氨基酸殘基，因此我們還提出了，在該區(qū)域(如D45N)的變化甚至可進一步提高N20D/C98S的免疫原性。該假設(shè)的基礎(chǔ)是，野生型毒素(以及很可能在II類MHC作用結(jié)構(gòu)域中沒有變化的突變體)直接與II類MHC結(jié)合，而不需要抗原呈遞細(xì)胞的正常加工過程。含有干擾這種與II類MHC的直接作用的氨基酸變化的突變體，可能免疫原性更強，因為突變體更易被內(nèi)化和加工。因此，用評估其他突變體的方法來評估三突變體N20D/C98S/D45N。
得自未免疫對照和各組用N20D、N20D/C98S或N20D/K157E免疫的兔子的血清，直接測試抗野生型SPE-A的ELISA效價(L.Hudson和F.C.Hay，PracticalImmunology，2版，1980，Blackwell Scientific Publications，Boston p 237-239)。來自各動物的血清被分別評估。獲得的抗體效價被平均，并示于表8。如預(yù)期的那樣，未免疫的對照動物具有非常低的抗SPE-A抗體效價。與之相反，用突變體免疫的所有動物都有明顯的抗體效價。用雙突變體N20D/K157E免疫的動物有最高的平均效價，而且另兩種突變體有相近的效價。然而，與兩種雙突變體相比，N20D免疫動物的效價范圍要大得多(對于6只動物中的每只為20、40、160、640、640)。這些數(shù)據(jù)暗示，雙突變體可產(chǎn)生更一致的免疫作用。
表8用N20D、N20D/C98S、N20D/K157E SPE-A免疫的動物和未免疫對照的ELISA抗體效價免疫劑 抗體平均效價a范圍b無 10 ＜10-20N20D SPE A25020-640N20D/C98S SPE A 80 80N20D/K157E SPE A 425320-640a6只動物/組b可檢測的最低效價是10。效價是產(chǎn)生陽性結(jié)果的最后稀釋度的倒數(shù)。
在最后一次試驗中，動物(3只/組)用N20D、N20D/C98S、或N20D/K157ESPE-A免疫(50微克/每次靜脈注射)，即通過每隔一天共注射5次突變蛋白，然后讓動物休息一天。接著評估動物對抗野生型SPE-A引起發(fā)熱的免疫力(在注射后4小時，20倍最低致熱劑量(MPD)/千克體重(20MPD-4))。SPE-A是已知最強的熱原中的一種，其在兔中的單MPD-4為0.15微克/千克。在4小時時，給動物注射內(nèi)毒素(25微克/千克)，以評估對內(nèi)毒素休克增強易感性的免疫力。數(shù)據(jù)示于表9。
未免疫動物和用N20D SPE-A免疫的動物都顯出明顯的熱反應(yīng)(兩組都為0.8℃)和對內(nèi)毒素的易感性上升(在兩組中，在48小時內(nèi)2/3死亡)。相反，用兩種雙突變體中任一種所免疫動物被完全保護而沒有發(fā)熱和增強現(xiàn)象。
總而言之，所有上述數(shù)據(jù)揭示，雙突變體比單突變體更能免疫動物以對抗SPE-A的毒性效應(yīng)。沒有一種突變體本身是對動物有毒的。雙突變體N20D/C98S是比N20D/K157E更好的免疫原，當(dāng)然兩者都是有效的。
表9N20D、N20D/C98S和N20D/K157E SPE-A突變體的免疫動物的能力，以抵抗SPE-A致熱性以及SPE-A和內(nèi)毒素攻擊時的致死性免疫劑發(fā)熱反應(yīng) 死亡數(shù)目/總數(shù)4小時時的變化(℃)無0.8 2/3N20D SPE A0.8 2/3N20D/C98S SPE A 0.0 0/3N20D/K157E SPE A 0.1 0/3實施例8三重突變體的評估和特性三重突變體的構(gòu)建和穩(wěn)定性測定N20D/D45N/C98S是通過兩輪亞克隆而構(gòu)建的。對形成的突變speA基因進行測序，以確保在克隆過程中含有合適突變的DNA片段被連接。攜帶三重突變speA基因的質(zhì)粒pMIN164被轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌RN4220中，然后按用于其他突變體的所述方法產(chǎn)生和純化三重突變蛋白質(zhì)。
評估蛋白質(zhì)N20D/D45N/C98S的穩(wěn)定性。該蛋白質(zhì)從細(xì)菌培養(yǎng)物中純化出的數(shù)量與雙突變SPE相仿。在雙免疫擴散分析中，三重突變蛋白也與對野生型SPE-A特異的多克隆抗體反應(yīng)。此外，N20D/D45N/C98S與野生型一樣可耐胰蛋白酶的切割。
三重突變蛋白的增殖活性評估了N20D/D45N/C98S在兔和鼠脾細(xì)胞和人PBMC中的增殖活性。與野生型SPE-A相比，該蛋白質(zhì)的誘發(fā)兔子(表11)和人(表13)細(xì)胞增殖的活性低得多。在鼠細(xì)胞中，當(dāng)在100ng/孔下，該蛋白質(zhì)的活性接近于50％野生型活性，當(dāng)使用1000ng/孔的毒素劑量時活性甚至更高(表12)。在兔細(xì)胞中，N20D/D45N/C98S的活性也低于測試的單突變體(N20D和D45N)，而與雙突變體N20D/C98S的活性相同(表11)。然而，在鼠系統(tǒng)中，三重突變蛋白可與單突變蛋白D45N相同地引發(fā)細(xì)胞增殖，而且活性比N20D/C98S更高(表12)；而在人細(xì)胞中，N20D/D45N/C98S也與D45N活性相同(在100ng/孔時)，但是在10ng/孔時活性低得多(表13)。這表明，引入第三個突變增加了蛋白質(zhì)的活性。也許，在45位由Asp變?yōu)锳sn所導(dǎo)致的電荷減少，對缺乏Cys98的巰基的蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用。
表11與單突變體、雙突變體和野生型SPE-A相比，三突變的SPE-A誘導(dǎo)兔脾細(xì)胞的增殖的能力100ng/孔10ng/孔 1ng/孔蛋白質(zhì)cpm SDb％ cpm SD ％ cpmSD％(103)ac(103) (103)SPE A 978 11620 997N20D 234 23 9 28 3 1.4 3D45N 101.3 10 21 4.5 18 3.2 1.7 3N20D/C98S 132 13 2.41.5 2 0.5 1.5 0.5N20D/D45N/C98S 7.6 2 8 4.41.3 4 1.7 0.4 2a結(jié)果來自摻入增殖脾細(xì)胞DNA中[3H]胸苷摻入量b樣品一式四份c突變體活性除以在相同劑量和相同分析的野生型SPE-A活性，再乘以100表12與單突變體、雙突變體和野生型SPE-A相比，三突變的SPE-A誘導(dǎo)鼠脾細(xì)胞的增殖的能力1,000ng/孔100ng/孔蛋白質(zhì) cpm(103)aSDb％ccpm(103)SD ％SPE A232.5 NTdN20D/C98S0.6 0.5 2.6NTSPE A153.4 521.8D45N 9 2.4 60 248.444N20D/D45N/C98S 12580 231.846a結(jié)果來自摻入增殖脾細(xì)胞DNA中[3H]胸苷摻入量b樣品一式四份c突變體活性除以在相同劑量和相同分析的野生型SPE-A活性，再乘以100dNT，未測試表13與單突變體、雙突變體和野生型SPE-A相比，三突變的SPE-A誘導(dǎo)人PBMC的增殖的能力100ng/孔10ng/孔蛋白質(zhì) cpm(103)aSDb％ccpm(103) SD％SPE A 31 322 2D45N11 1.53514.4 1.5 65N20D/C98S 2.6 1 8 0.10.3 0.5N20D/D45N/C98S 10 0.6320.90.3 4a結(jié)果來自摻入增殖脾細(xì)胞DNA中[3H]胸苷摻入量b樣品一式四份c突變體活性除以在相同劑量和相同分析的野生型SPE-A活性，再乘以100dNT，未測試誘導(dǎo)IFN-γ和TNF-α分泌還評估了N20D/D45N/C98S誘導(dǎo)鼠脾細(xì)胞和人PBMC細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力。在用于測試增殖性(表12和13)的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中測試這些細(xì)胞因子。在用突變型或野生型SPE-A處理的細(xì)胞培養(yǎng)物被孵育96小時后，回收用于測試細(xì)胞因子的上清液，其中對于鼠和人細(xì)胞使用的劑量分別為1,000ng/孔和100ng/孔。IFN-γ和TNF-α兩者的分泌在人細(xì)胞中都比在鼠細(xì)胞中更受影響(表14)。這與觀察到的細(xì)胞增殖水平(表12和13)是相關(guān)的。然而，在各個種類的因子中，TNF-α分泌似乎較不依賴于細(xì)胞增殖(表14)。人細(xì)胞在受到D45N和三重突變蛋白的刺激時其增殖水平相同，但是在用N20D/D45N/C98S處理時TNF-α的分泌量更多。與之相反，鼠細(xì)胞用N20D/D45N/C98S處理時增殖得較好，而用同一毒素刺激時TNF-α的分泌量卻較小。在用透明質(zhì)酸酶處理的細(xì)胞和未處理的人細(xì)胞的上清液中，只觀察到非常少的細(xì)胞因子分泌，但是未處理的鼠對照細(xì)胞卻在分泌兩種被測試細(xì)胞因子方面較活躍。這可部分歸咎于，在用任一種突變蛋白處理的鼠細(xì)胞上清液中IFN-γ和TNF-α的驚人高水平(表14)。表14 三重突變的SPE-A在鼠脾細(xì)胞和人PBMC中誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌蛋白質(zhì) IFN-γaTNF-αb人c鼠4人 鼠pg/mle％ pg/ml％ pg/ml ％ pg/ml ％N20D/D45N/C98S 2880272508417825968072D45N2708263058504283289896SPE A 10484 6076 1336 940透明質(zhì)酸酶 0 0 46 11無 0 592 2 40 305aIFN-γ，γ-干擾素bTNF-α，α-腫瘤壞死因子c人PBMC，2×105/孔，用100ng/孔的野生型和突變型毒素進行刺激。每個增殖分析的樣品在96小時收獲，然后測定上清液中的細(xì)胞因子濃度。d鼠脾細(xì)胞，5×105/孔，用1,000ng/孔的野生型和突變型毒素進行刺激。每個增殖分析的樣品在96小時收獲，然后測定上清液中的細(xì)胞因子濃度。e在突變體刺激后釋放的細(xì)胞因子的pg/ml除以同一測試中在野生型刺激后釋放的因子的pg/ml。
N20D/D45N/C98S蛋白的毒性。在American Dutch條紋兔中，測試N20D/D45N/C98S蛋白的增強內(nèi)毒素休克性的能力。給動物靜脈注射5微克/千克體重的N20D/D45N/C98S蛋白或野生型SPE-A蛋白。4小時后，靜脈注射10微克/千克體重的來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的內(nèi)毒素。在注射內(nèi)毒素后，在48小時內(nèi)監(jiān)測動物的STSS癥狀和死亡情況。數(shù)據(jù)列于表15。所有施用N20D/D45N/C98S蛋白的動物都存活，并且尸體解剖檢查也未發(fā)現(xiàn)器官受損。與之相反，用野生型SPE-A處理的所有動物都死亡了。這一結(jié)果表明，三重突變蛋白沒有可檢測的體內(nèi)毒性。
表15三重突變的N20D/D45N/C98S SPE-A在兔內(nèi)毒素增強模型中的致死性和毒性蛋白質(zhì)多器官毒性a未死亡數(shù)目/動物總數(shù)bpcN20D/D45N/C98S0/9 0/3 0.05SPE A NDd3/3a僅對存活動物通過尸體解剖檢查肝、脾、肺和心而加以判斷。對每只動物中的每個受損器官給一分。可能分值的總和為3/動物。數(shù)值指總的受損分/該組動物。b動物是靜脈施用5微克/千克體重的野生型SPE-A或突變體。在4小時后，給它們施用10微克/千克體重的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)內(nèi)毒素。c將三重突變體的致死性與野生型的致死性相比。dND，未測試D45N和N20D/D45N/C98S蛋白抗原性。對蛋白D45N、N20D/C98S、N20D/D45N/C98S和起始突變蛋白N20D，評估了它們在動物刺激產(chǎn)生對野生型SPE-A特異的抗體應(yīng)答的能力。對于5組American Dutch條紋兔，每組或者未被處理，或者用D45N、N20D、N20D/C98S、N20D/D45N/C98S之一進行處理。在IFA中，每隔一周通過皮下注射25微克蛋白質(zhì)，共3次。抗SPE-A抗體的效價是通過ELISA法，在最后一次免疫后7天所獲得的血清中進行測定。如表16所示，除了未處理組之外，在所有組中的動物都有明顯比對應(yīng)的免疫前效價更高的抗體效價。
表16 與單突變體、雙突變體、和野生型SPE-A相比，三重突變SPE-A在兔中的抗原性免疫前a免疫cpd免疫劑 效價b范圍效價 范圍無1810-202420-40 0.21N20D 6020-160 1600 1000-2000 0.003D45N 2610-406400 4000-8000 0.003N20D/C98S 3220-801220 100-20000.03N20D/D45N/C98S1610-403400 1000-8000 0.037a在施用第一次毒素劑量之前，對兔子進行放血。b5只兔子血清的平均效價c在第三次施用免疫劑量后7天，對兔子進行放血。d在各組中，將免疫前的血清效價與免疫后的效價用雙尾t-測試法進行比較，其中假設(shè)方差不相等。
表17在用不同物質(zhì)免疫的動物組中，用雙尾t-測試法(其中假設(shè)方差不相等)確定的血清效價差異的顯著性，免疫劑無 N20D/D45N/C98S D45NN20D/C98SN20D＜0.001 0.0656 ＜0.0010.3471N20D/C98S 0.0015 0.07480.0185D45N＜0.001 0.0656N20D/D45N/C98S ＜0.001此外，全部免疫組的抗體效價都顯著高于未免疫的對照組(表17)。蛋白質(zhì)D45N的免疫原性最強，可刺激的平均效價達6,400，而且其范圍僅兩個系列1∶2稀釋(表16)。該蛋白質(zhì)比N20D能明顯更有效地作為抗原(表17)。當(dāng)D45N與N20D和C98S存在于同一分子中時，其免疫原性下降較多，如所示其平均效價為3,400(表17)。與僅有N20D相比，對N20D/D45N/C98S的抗體反應(yīng)的一致性也較低，其效價在1000和8000之間(4次1∶2稀釋)。然而通過比較D45N免疫效價和N20D/D45N/C98S免疫效價的對數(shù)(用t-測試法比較)，可以認(rèn)為兩組的差別僅有10％可信度(表17)。類似地，用N20D免疫的和N20D/C98S免疫的兔子的效價(分別為1,600和1,220)相互并沒有顯著不同(表26和27)，它們各與N20D/D45N/C98S免疫效價有10％可信度的差異?？偠灾琋20D/D45N/C98S蛋白具有中等的引發(fā)抗SPE-A的抗體應(yīng)答的能力。
N20D/D45N/C98S的保護能力。在保護動物免受野生型SPE-A的侵襲的能力方面，評估了三重突變蛋白，并將其與N20D、D45N和雙突變體N20D/C98S比較。對于前面章節(jié)中的兔子(其抗體效價示于表16)，通過微型滲透泵方式進行侵襲。在泵中裝載500微克(等于致死劑量的2.5倍)得自化膿鏈球菌(S.Pyogenes)的SPE-A。在植入微型滲透泵后15天，監(jiān)測動物的STSS癥狀和死亡情況。在植入之前和植入之后二天各測量直腸溫度一次。用SPE-A類毒素免疫的所有動物都存活了，而未免疫組的5只動物都死亡了(表18)。
18與單突變體相比，SPE-A雙突變體和三突變體的免疫能力免疫劑多器官毒性a發(fā)熱動物數(shù)目/ 死亡數(shù)目/ pd動物總數(shù)b動物總數(shù)c無 17/204/55/5N20D 0/15 0/50/5 0.004N20D/C98S 0/15 0/50/5 0.004D45N 0/15 2/50/5 0.004N20D/D45N/C98S 0/15 1/50/5 0.004a通過尸體解剖檢查肝、脾、肺和心而加以判斷。對每只動物中的每個受損器官給一分?？赡芊种档目偤停瑢τ趯φ战M為20分，對于處理組為15分(省略了肺)。分?jǐn)?shù)指總受損分/各組動物的總分。b攝氏度。在基線和植入微型滲透泵后2天測量直腸溫度。當(dāng)溫度增加≥0.5℃時，認(rèn)為發(fā)熱。c微型滲透泵裝載有500微克野生型SPE-Ad用Fisher精確概率測試法，比較免疫接種組動物和未處理組之間的致死性數(shù)據(jù)。
致死性結(jié)果是顯著的(p＝0.004)。未免疫組的4只動物的體溫顯著上升(超過0.5℃)(表18)。在免疫組中，用D45N和N20D/D45N/C98S免疫時有一些動物發(fā)熱(分別為2/5和1/5)。或者在死亡后(對照組)或在安樂死后(處理組)，評估所有的動物的總體器官異常情況。免疫組動物都沒有器官受損(表18)。這表明，免疫接種對兔子沒有毒性，而且在所有動物中的針對類毒素的抗體能夠阻斷野生型SPE-A的侵襲毒性。相反，未免疫動物有17分的器官受損分值(可能的總分為20分)(表18)，這表明，每只動物至少有2個外觀異常的器官。這些結(jié)果一起表明，用N20D/D45N/C98S突變體來免疫接種可安全而有效地保護STSS模型動物。
盡管本發(fā)明結(jié)合具體例子進行了描述，但是專利的覆蓋范圍并不限于這些具體例子，而應(yīng)由下面的權(quán)利要求所決定。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名Regents of the University of Minnesota(B)街道Morrill Hall，100 Church Street，S.E.
(C)城市Minneapolis(D)州Minnesota(E)國家美國(F)郵政編碼(郵編)55415-1226(ii)發(fā)明名稱鏈球菌毒素A突變體及其使用方法(iii)序列數(shù)目13(iv)計算機可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(v)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日07-6月-1996(C)分類(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/480,261(B)申請日07-6月-1995(C)分類(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1CCATCACGGG TGGATTCTTG AAACAGGTG 29(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度47堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2CCATCACGCC CCCCGTCGAC GATAAAATAG TTGCTAAGCT ACAAGCT 47(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度172堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3CCATCACCAT CACCAAGAAG AAATAATTAC ATATTAAATA CAATACATAT GTAATAATAA 60TAAATATATA AATAAAATAA TTACATATTA AAAATAATAC TTAATTATAA AAACACTATA120ATTTCCATAA ATATTAATAA ATAATTAAAA ATAAAATAAT AAATAATTAA TC172(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度172堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4CCATCACCAT CACCAAGAAG AAATAATTAC ATATTAAATA CAATACATAT GTAATAATAA 60TAAATATATA AATAAAATAA TTACATATTA AAAATAATAC TTAATTATAA AAACACTATA120ATTTCCATAA ATATTAATAA ATAATTAAAA ATAAAATAAT AAATAATTAA TC172(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度172堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5CCATCACCAT CACCAAGAAG AAATAATTAC ATATTAAATA CAATACATAT GTAATAATAA 60TAAATATATA AATAAAATAA TTACATATTA AAAATAATAC TTAATTATAA AAACACTATA120ATTTCCATAA ATATTAATAA ATAATTAAAA ATAAAATAAT AAATAATTAA TC172(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度172堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6CCATCACCAT CACCAAGAAG AAATAATTAC ATATTAAATA CAATACATAT GTAATAATAA 60TAAATATATA AATAAAATAA TTACATATTA AAAATAATAC TTAATTATAA AAACACTATA 120ATTTCCATAA ATATTAATAA ATAATTAAAA ATAAAATAAT AAATAATTAA TC 172(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度172堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7CCATCACCAT CACCAAGAAG AAATAATTAC ATATTAAATA CAATACATAT GTAATAATAA60TAAATATATA AATAAAATAA TTACATATTA AAAATAATAC TTAATTATAA AAACACTATA 120ATTTCCATAA ATATTAATAA ATAATTAAAA ATAAAATAAT AAATAATTAA TC 172(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度172堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO8CCATCACCAT CACCAAGAAG AAATAATTAC ATATTAAATA CAATACATAT GTAATAATAA60TAAATATATA AATAAAATAA TTACATATTA AAAATAATAC TTAATTATAA AAACACTATA 120ATTTCCATAA ATATTAATAA ATAATTAAAA ATAAAATAAT AAATAATTAA TC 172(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度172堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO9CCATCACCAT CACCAAGAAG AAATAATTAC ATATTAAATA CAATACATAT GTAATAATAA60TAAATATATA AATAAAATAA TTACATATTA AAAATAATAC TTAATTATAA AAACACTATA 120ATTTCCATAA ATATTAATAA ATAATTAAAA ATAAAATAAT AAATAATTAA TC 172(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度172堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO10CCATCACCAT CACCAAGAAG AAATAATTAC ATATTAAATA CAATACATAT GTAATAATAA 60TAAATATATA AATAAAATAA TTACATATTA AAAATAATAC TTAATTATAA AAACACTATA 120ATTTCCATAA ATATTAATAA ATAATTAAAA ATAAAATAAT AAATAATTAA TC 172(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11CCATCACGGG TGGATCCTTG AAACAGGTGC A31(2)SEQ ID NO12的信息
(i)序列特征(A)長度1851堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/分類名稱CDS(B)位置828..1583(xi)序列描述SEQ ID NO12CCATCACGCA TCACTCATGT TTGACAGCTT ATCATCGATA AGCTTACTTT TCGAATCAGG60TCTATCCTTG AAACAGGTGC AACATAGATT AGGGCATGGA GATTTACCAG ACAACTATGA 120ACGTATATAC TCACATCACG CAATCGGCAA TTGATGACAT TGGAACTAAA TTCAATCAAT 180TTGTTACTAA CAAGCAACTA GATTGACAAC TAATTCTCAA CAAACGTTAA TTTAACAACA 240TTCAAGTAAC TCCCACCAGC TCCATCAATG CTTACCGTAA GTAATCATAA CTTACTAAAA 300CCTTGTTACA TCAAGGTTTT TTCTTTTTGT CTTGTTCATG AGTTACCATA ACTTTCTATA 360TTATTGACAA CTAAATTGAC AACTCTTCAA TTATTTTTCT GTCTACTCAA AGTTTTCTTC 420ATTTGATATA GTCTAATTCC ACCATCACTT CTTCCACTCT CTCTACCGTC ACAACTTCAT 480CATCTCTCAC TTTTTCGTGT GGTAACACAT AATCAAATAT CTTTCCGTTT TTACGCACTA 540TCGCTACTGT GTCACCTAAA ATATACCCCT TATCAATCGC TTCTTTAAAC TCATCTATAT600ATAACATATT TCATCCTCCT ACCTATCTAT TCGTAAAAAG ATAAAAATAA CTATTGTTTT660TTTTGTTATT TTATAATAAA ATTATTAATA TAAGTTAATG TTTTTTAAAA ATATACAATT720TTATTCTATT TATAGTTAGC TATTTTTTCA TTGTTAGTAA TATTGGTGAA TTGTAATAAC780CTTTTTAAAT CTAGAGGAGA ACCCAGATAT AAAATGGAGG AATATTA ATG GAA AAC 836Met Glu Asn1AAT AAA AAA GTA TTG AAG AAA ATG GTA TTT TTT GTT TTA GTG ACA TTT 884Asn Lys Lys Val Leu Lys Lys Met Val Phe Phe Val Leu Val Thr Phe5 10 15CTT GGA CTA ACA ATC TCG CAA GAG GTA TTT GCT CAA CAA GAC CCC GAT 932Leu Gly Leu Thr Ile Ser Gln Glu Val Phe Ala Gln Gln Asp Pro Asp20 25 30 35CCA AGC CAA CTT CAC AGA TCT AGT TTA GTT AAA AAC CTT CAA AAT ATA 980Pro Ser Gln Leu His Arg Ser Ser Leu Val Lys Asn Leu Gln Asn Ile40 45 50TAT TTT CTT TAT GAG GGT GAC CCT GTT ACT CAC GAG AAT GTG AAA TCT 1028Tyr Phe Leu Tyr Glu Gly Asp Pro Val Thr His Glu Asn Val Lys Ser55 60 65GTT GAT CAA CTT TTA TCT CAC CAT TTA ATA TAT AAT GTT TCA GGG CCA 1076Val Asp Gln Leu Leu Ser His His Leu Ile Tyr Asn Val Ser Gly Pro70 75 80AAT TAT GAT AAA TTA AAA ACT GAA CTT AAG AAC CAA GAG ATG GCA ACT1124Asn Tyr Asp Lys Leu Lys Thr Glu Leu Lys Asn Gln Glu Met Ala Thr85 90 95TTA TTT AAG GAT AAA AAC GTT GAT ATT TAT GGT GTA GAA TAT TAC CAT1172Leu Phe Lys Asp Lys Asn Val Asp Ile Tyr Gly Val Glu Tyr Tyr His100 105 110 115CTC TGT TAT TTA TGT GAA AAT GCA GAA AGG AGT GCA TGT ATC TAC GGA1220Leu Cys Tyr Leu Cys Glu Ash Ala Glu Arg Ser Ala Cys Ile Tyr Gly120 125 130GGG GTA ACA AAT CAT GAA GGG AAT CAT TTA GAA ATT CCT AAA AAG ATA1268Gly Val Thr Asn His Glu Gly Asn His Leu Glu Ile Pro Lys Lys Ile135 140 145GTC GTT AAA GTA TCA ATC GAT GGT ATC CAA AGC CTA TCA TTT GAT ATT1316Val Val Lys Val Ser Ile Asp Gly Ile Gln Ser Leu Ser Phe Asp Ile150 155 160GAA ACA AAT AAA AAA ATG GTA ACT GCT CAA GAA TTA GAC TAT AAA GTT1364Glu Thr Asn Lys Lys Met Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp Tyr Lys Val165 170 175AGA AAA TAT CTT ACA GAT AAT AAG CAA CTA TAT ACT AAT GGA CCT TCT1412Arg Lys Tyr Leu Thr Asp Asn Lys Gln Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Ser180 185 190 195AAA TAT GAA ACT GGA TAT ATA AAG TTC ATA CCT AAG AAT AAA GAA AGT1460Lys Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Pro Lys Asn Lys Glu Ser200 205 210TTT TGG TTT GAT TTT TTC CCT GAA CCA GAA TTT ACT CAA TCT AAA TAT1508Phe Trp Phe Asp Phe Phe Pro Glu Pro Glu Phe Thr Gln Ser Lys Tyr215 220 225CTT ATG ATA TAT AAA GAT AAT GAA ACG CTT GAC TCA AAC ACA AGC CAA1556Leu Met Ile Tyr Lys Asp Asn Glu Thr Leu Asp Ser Asn Thr Ser Gln230 235 240ATT GAA GTC TAC CTA ACA ACC AAG TAA CTTTTTGCTT TTGGCAACCT 1603Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys *245 250TACCTACTGC TGGATTTAGA AATTTTATTG CAATTCTTTT ATTAATGTAA AAACCGCTCA 1663TTTGATGAGC GGTTTTGTCT TATCTAAAGG AGCTTTACCT CCTAATGCTG CAAAATTTTA 1723AATGTTGGAT TTTTGTATTT GTCTATTGTA TTTGATGGGT AATCCCATTT TTCGACAGAC 1783ATCGTCGTGC CACCTCTAAC ACCAAAATCA TAGACAGGAG CTTGTAGCTT AGCAACTATT 1843TTATCGTC 1851(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度252氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Glu Asn Asn Lys Lys Val Leu Lys Lys Met Val Phe Phe Val Leu1 5 10 15Val Thr Phe Leu Gly Leu Thr Ile Ser Gln Glu Val Phe Ala Gln Gln20 25 30Asp Pro Asp Pro Ser Gln Leu His Arg Ser Ser Leu Val Lys Asn Leu35 40 45Gln Asn Ile Tyr Phe Leu Tyr Glu Gly Asp Pro Val Thr His Glu Asn50 55 60Val Lys Ser Val Asp Gln Leu Leu Ser His His Leu Ile Tyr Asn Val65 70 75 80Ser Gly Pro Asn Tyr Asp Lys Leu Lys Thr Glu Leu Lys Asn Gln Glu85 90 95Met Ala Thr Leu Phe Lys Asp Lys Asn Val Asp Ile Tyr Gly Val Glu100 105 110Tyr Tyr His Leu Cys Tyr Leu Cys Glu Asn Ala Glu Arg Ser Ala Cys115 120 125Ile Tyr Gly Gly Val Thr Asn His Glu Gly Asn His Leu Glu Ile Pro130 135 140Lys Lys Ile Val Val Lys Val Ser Ile Asp Gly Ile Gln Ser Leu Ser145 150 155 160Phe Asp Ile Glu Thr Asn Lys Lys Met Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp165 170 175Tyr Lys Val Arg Lys Tyr Leu Thr Asp Asn Lys Gln Leu Tyr Thr Asn180 185 190Gly Pro Ser Lys Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Pro Lys Asn195 200 205Lys Glu Ser Phe Trp Phe Asp Phe Phe Pro Glu Pro Glu Phe Thr Gln210 215 220Ser Lys Tyr Leu Met Ile Tyr Lys Asp Asn Glu Thr Leu Asp Ser Asn225 230 235 240Thr Ser Gln Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys *245 250
權(quán)利要求
1.一種SPE-A毒素突變體或其片段，其特征在于，與基本對應(yīng)野生型SPE-A毒素的蛋白質(zhì)相比，該突變體至少有一個氨基酸變化且基本上不致死。
2.如權(quán)利要求1所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，該SPE-A毒素突變體包含1-6個氨基酸取代；而且至少一個該取代氨基酸位于N末端α螺旋3、結(jié)構(gòu)域Bβ鏈1、結(jié)構(gòu)域Bβ鏈2、結(jié)構(gòu)域Bβ鏈3、結(jié)構(gòu)域Aβ鏈6、結(jié)構(gòu)域Aβ鏈8、結(jié)構(gòu)域Aβ鏈9、結(jié)構(gòu)域Aβ鏈10中或是半胱氨酸處。
3.如權(quán)利要求1所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，該SPE-A毒素突變體包含1-6個氨基酸取代；而且至少一個取代氨基酸是天冬酰胺20、天冬氨酸45、賴氨酸157或半胱氨酸98。
4.如權(quán)利要求3所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，該至少一個氨基酸取代包括將20位天冬酰胺替換為天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸或精氨酸；將98位半胱氨酸替換為絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸；將157位賴氨酸替換為谷氨酸或天冬氨酸；或?qū)?5位天冬氨酸替換為天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸。
5.如權(quán)利要求4所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，該至少一個氨基酸取代包括將20位天冬酰胺替換為天冬氨酸；將98位半胱氨酸替換為絲氨酸；將45位天冬氨酸替換為天冬酰胺；或?qū)?57位賴氨酸替換為谷氨酸。
6.如權(quán)利要求3所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，該至少一個氨基酸取代是20位天冬酰胺的取代。
7.如權(quán)利要求6所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，該取代是將20位天冬酰胺替換為天冬氨酸。
8.如權(quán)利要求6所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，還包含98位半胱氨酸或157位賴氨酸的取代。
9.如權(quán)利要求8所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，該取代是將98位半胱氨酸替換為絲氨酸，或?qū)?57位賴氨酸替換為谷氨酸。
10.如權(quán)利要求6所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，還包含98位半胱氨酸和45位天冬氨酸的取代。
11.如權(quán)利要求10所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，98位半胱氨酸被替換為絲氨酸和45位天冬氨酸被替換為天冬酰胺。
12.如權(quán)利要求1所述的SPE-A毒素突變體，其特征在于，該突變體具有至少一種下列特性突變體的促T細(xì)胞有絲分裂性下降，突變體基本不增強內(nèi)毒素休克，突變體不致死，或者突變體不致死但是保留與野生型SPE-A毒素相當(dāng)?shù)拇儆薪z分裂性。
13.一種保護動物抵抗野生型SPE-A的至少一種生物活性的疫苗，其特征在于，它包括有效量的權(quán)利要求1所述的至少一種SPE-A毒素突變體。
14.一種藥物組合物，其特征在于，該組合物包含與生理上可接受載體相混合的權(quán)利要求1所述的SPE-A突變體。
15.一種編碼權(quán)利要求1所述SPE-A毒素突變體的DNA序列。
16.一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞包含權(quán)利要求15所述的DNA序列。
17.一種保護動物抵抗野生型SPE-A的至少一種生物活性的方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求13所述的疫苗施用于動物。
18.一種減少與毒性休克有關(guān)的癥狀的方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求13所述的疫苗施用于動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及SPE－A毒素突變體或其片段、疫苗和藥物組合物,以及疫苗和藥物組合物的使用方法。與野生型SPE－A毒素相比,優(yōu)選的SPE－A毒素至少有一個氨基酸變化而且是基本不致死的。該SPE－A毒素突變體可制成用于保護動物抵抗野生型SPE－A生物活性的疫苗組合物。
文檔編號A61P31/04GK1246151SQ97181626
公開日2000年3月1日 申請日期1997年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月6日
發(fā)明者P·M·施利弗特, M·羅格阿尼, J·施托赫, D·奧倫多弗 申請人:明尼蘇達大學(xué)董事會