一種用于高通量測序分析dna甲基化狀態(tài)的文庫構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下 使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。
[0003]目前檢測甲基胞嘧啶有多種方法,十多年前重亞硫酸鹽基因組序列檢測技術(shù)已成 為在復(fù)雜基因組中分析DNA甲基化的方法。這個敏感而又直接的方法從根本上改了基因組 DNA甲基化模式的特征,在目前使用的技術(shù)中可以得到最好的特異性結(jié)果并排除多種限制。 這個技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法是基于DNA變性后用重亞硫酸氫鈉處理,可將未甲基化的胞嘧啶修飾 成尿嘧啶,能夠?qū)⒒蚪M中未甲基化的C堿基與甲基化的C堿基區(qū)分開來,重亞硫酸鹽基因 組測序已經(jīng)被證實是分析DNA甲基化的有效和強(qiáng)有力的方法,是目前公認(rèn)的DNA樣品甲基 化檢測的"金標(biāo)準(zhǔn)",它可以明確甲基化的確切位置及甲基化的程度。
[0004] 將重亞硫酸鹽修飾與高通量測序技術(shù)相結(jié)合,能夠繪制單堿基分辨率的DNA甲基 化圖譜,因此成為表觀遺傳學(xué)研究的經(jīng)典實驗方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一組DNA分子,該組分子由如下(1)- (4)所示的四種分子組成:
[0007] (1)SEQ ID No. 1 所示的 DNA分子;
[0008] (2) SEQ ID No. 2 所示的 DNA分子;
[0009] (3) SEQ ID No. 3 所示的 DNA分子;
[0010] (4)SEQ ID No. 4 所示的 DNA分子。
[0011] 一組接頭分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,該組分子由如下(1)- (4)所示的四種分 子組成:
[0012] (1)SEQ ID No.1 所示的DNA分子;
[0013] (2)SEQIDNo.2所示的DNA分子,其中3'末端的兩個堿基均進(jìn)行硫代修飾;
[0014](3) SEQ ID No. 3所示的DNA分子;
[0015] (4 )SEQIDNo. 4所示的DNA分子,其中3'末端的兩個堿基均進(jìn)行硫代修飾;
[0016] 所述(1) - (4)所示的四種分子的dC在5位置均有甲基修飾;
[0017]其中(1)和(2)形成雙鏈構(gòu)成第一種接頭分子,(3)和(4)形成雙鏈構(gòu)成第二種接 頭分子。
[0018] 一對引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,該對引物由如下(1)和(2)所示的兩種分子 組成:
[0019] (1)SEQ ID No.5 所示的DNA分子;
[0020] 該分子與SEQIDNo. 3所不的分子部分序列一致;
[0021] (2)SEQID No.6 所示的DNA分子;
[0022] 該分子與SEQIDNo. 1所不的分子部分序列一致。
[0023] -種重亞硫酸鹽修飾試劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,該試劑按照如下方法制備而 成:稱取1. 9gNa2S205,加水至5mL,全部溶解后用3M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5. 0,真空干燥濃縮 制成。
[0024] -種用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫構(gòu)建的試劑盒也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍,該試劑盒包含上述接頭分子和上述引物。
[0025] 上述試劑盒中,所述試劑盒還包含牛血清白蛋白、DNA片段化酶、DNA片段化反應(yīng) 緩沖液、ddH20、不含核酸酶的水、末端修復(fù)緩沖液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I,(Klenow)大 片段、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶緩沖液、T4DNA連接酶、缺口平移緩沖液、BstDNA聚 合酶(大片段)、甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液和高保真DNA聚合酶;
[0026] 所述末端修復(fù)緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成,溶劑為Tris-HCl緩沖液,溶質(zhì)為MgCl2、 DTT、ATP和dNTPs,Tris-HCl緩沖液的濃度為500mM,MgCl2在所述10X末端修復(fù)緩沖液中 的濃度為l〇〇mM,DTT在所述10X末端修復(fù)緩沖液中的濃度為100mM,ATP在所述10X末端 修復(fù)緩沖液中的濃度為l〇mM,dNTPs在所述10X末端修復(fù)緩沖液中的濃度為5mM,溶液pH 為 7.5 ;
[0027] 所述缺口平移緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成,溶劑為Tris-HCl緩沖液,溶質(zhì)為 (NH4)2S04、KC1、MgS04、TritonX-100 和dNTPs,Tris-HCl緩沖液的濃度為 200mM,(NH4)2S04 在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度為lOOmM,KC1在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度 為100mM,MgS04在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度為20mM,TritonX-100在所述10X 缺口平移緩沖液中的體積百分含量為1%,dNTPs在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度為 2mM,所述dNTPs包含等濃度的dATP、dm5CTP,dGTP和dTTP,溶液pH為8. 8 ;
[0028] 所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成,溶劑為水,溶質(zhì)為Tris、(NH4) 2S04、MgCl2和0 -巰基乙醇,Tris在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為670mmol/L, (NH4) 2S04在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為166mmol/L,MgCl2在所述甲基化PCR 擴(kuò)增緩沖液中的濃度為67mmol/L,0 -巰基乙醇在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為 100mmol/L〇
[0029] 上述任一所述的試劑盒中,所述DNA片段化酶的商品名稱為NEBNextdsDNA Fragmentase,購自NEB公司,產(chǎn)品目錄號為M0348L;
[0030] 所述DNA片段化反應(yīng)緩沖液的商品名稱為10XFragmentaseReactionBuffer,購 自NEB公司;
[0031] 所述T4DNA聚合酶的商品名稱為T4DNAPolymerase,購自NEB公司,產(chǎn)品目錄號為 M0203S;
[0032] 所述DNA聚合酶I,(Klenow)大片段的商品名稱為DNAPolymerase I,Large(Klenow)Fragment,購自NEB公司,產(chǎn)品目錄號為M0210S;
[0033] 所述T4多聚核苷酸激酶的商品名稱為T4PolynucleotideKinase,購自NEB公司, 產(chǎn)品目錄號為M0201;
[0034] 所述T4DNA連接酶緩沖液的商品名稱為10XT4DNALigaseBuffer,購自NEB公 司;
[0035] 所述T4DNA連接酶的商品名稱為T4DNALigase,購自NEB司,產(chǎn)品目錄號為 M0202S;
[0036] 所述BstDNA聚合酶(大片段)的商品名稱為BstDNAPolymerase,Large Fragment,購自NEB公司,產(chǎn)品目錄號為M0275;
[0037]所述高保真DNA聚合酶的商品名稱為PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase, 購自NEB公司,產(chǎn)品目錄號為M0530S。
[0038] -種用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫的構(gòu)建方法也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍,包括如下步驟:
[0039] (1)提取基因組DNA;
[0040] (2)將基因組DNA進(jìn)行片段化,收集長度為100-300bp的片段化DNA并純化;
[0041] (3)將步驟(2)得到的DNA的粘性末端修復(fù)成平末端,并在5'末端進(jìn)行磷酸化修 飾并純化;
[0042] (4)對步驟(3)得到的DNA片段連接上述接頭分子并純化;
[0043] (5)將步驟(4)得到的DNA片段進(jìn)行缺口平移;
[0044] (6)將步驟(5)得到的DNA片段進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾及脫磺酸基并純化;
[0045] (7)以步驟(6)得到的DNA片段為模板,以上述引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,即為富集的DNA甲基化狀態(tài)的文庫。
[0046] 上述方法中,所述步驟(3)的具體步驟如下:
[0047] 將步驟(2)的片段化的DNA與ddH20、末端修復(fù)緩沖液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶 I,(Klenow)大片段、T4多聚核苷酸激酶混合,得體系1;將體系1置于20°C30分鐘,得DNA 片段末端修復(fù)以及5'末端磷酸化修飾后的產(chǎn)物并純化;
[0048]所述體系1的總體積為100ul,所述ddH20的體積為29ul,所述末端修復(fù)緩沖液的 體積為l〇ul,所述T4DNA聚合酶的酶活為150U,所述DNA聚合酶I,(Klenow)大片段的酶活 為5U,所述T4多聚核苷酸激酶的酶活為50U;
[0049] 所述末端修復(fù)緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成,溶劑為Tris-HCl緩沖液,溶質(zhì)為MgCl2、 DTT、ATP和dNTPs,Tris-HCl緩沖液