按照如下方法制備：
[0098] 稱取1. 9gNa2S205，加水至5mL，固體全部溶解后用3M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5. 0,取lmL分裝于離1. 5mL旋蓋離心管，真空干燥濃縮后備用，使用前每管加入lmL不含核酸酶的 水。
[0099] 脫磺酸基緩沖液按照如下方法制備：
[0100] 稱取0. 6克NaOH固體，加水5mL溶解，取500i!L分裝于離1. 5mL旋蓋離心管中， 真空干燥濃縮后備用，使用前每管加入500iiL不含核酸酶的水。
[0101] 10X甲基化PCRBuffer按照如下方法制備：670mmol/LTris、166mmol/L(NH4) 2S04, 67mmol/LMgCl2，100mmol/LP-巰基乙醇，余量為水。
[0102] pTG19-T載體購自上海捷瑞生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號為GV0101。
[0103] 實施例1、用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫的構(gòu)建
[0104] 用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫構(gòu)建技術(shù)路線如圖1所示。
[0105] -、基因組DNA片段化
[0106] (一）提取293T細(xì)胞的基因組DNA。
[0107](二）按照表1配制酶切反應(yīng)體系(注意：此步驟先不加NEBNextdsDNA Fragmentase，其余按照表1配制）。
[0108] 表1基因組DNA片段化反應(yīng)體系
[0109]
【主權(quán)項】
1. 一組DNA分子，該組分子由如下（1)- (4)所示的四種分子組成： (1) SEQ ID No. 1 所示的 DNA 分子； (2) SEQ ID No. 2 所示的 DNA 分子； (3) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子； (4) SEQ ID No. 4 所示的 DNA 分子。
2. -組接頭分子，該組分子由如下（1)- (4)所示的四種分子組成： (1) SEQ ID No. 1 所示的 DNA 分子； (2) SEQ ID No. 2所示的DNA分子，其中3'末端的兩個堿基均進(jìn)行硫代修飾； (3) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子； (4) SEQ ID No. 4所示的DNA分子，其中3'末端的兩個堿基均進(jìn)行硫代修飾； 所述（1) - (4)所示的四種分子的dC在5位置均有甲基修飾； 其中（1)和（2)形成雙鏈構(gòu)成第一種接頭分子，（3)和（4)形成雙鏈構(gòu)成第二種接頭分 子。
3. -對引物，該對引物由如下（1)和（2)所示的兩種分子組成： (1) SEQ ID No. 5 所示的 DNA 分子； 該分子與SEQ ID No. 3所不的分子部分序列一致； (2) SEQ ID No. 6 所示的 DNA 分子； 該分子與SEQ ID No. 1所不的分子部分序列一致。
4. 一種重亞硫酸鹽修飾試劑，該試劑按照如下方法制備而成：稱取1.9g Na2S2O5，加水 至5mL，全部溶解后用3M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5. 0,真空干燥濃縮制成。
5. -種用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫構(gòu)建的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利 要求2所述的接頭分子和權(quán)利要求3所述的引物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包含牛血清白蛋白、DNA 片段化酶、DNA片段化反應(yīng)緩沖液、ddH20、不含核酸酶的水、末端修復(fù)緩沖液、T4DNA聚合酶、 DNA聚合酶I，（Klenow)大片段、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶緩沖液、T 4DNA連接酶、缺 口平移緩沖液、Bst DNA聚合酶(大片段)、甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液和高保真DNA聚合酶； 所述末端修復(fù)緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)為MgCl2、DTT、 ATP和dNTPs，Tris-HCl緩沖液的濃度為500mM，MgCl2在所述IOX末端修復(fù)緩沖液中的濃 度為lOOmM，DTT在所述IOX末端修復(fù)緩沖液中的濃度為lOOmM，ATP在所述IOX末端修 復(fù)緩沖液中的濃度為10mM，dNTPs在所述10 X末端修復(fù)緩沖液中的濃度為5mM，溶液pH為 7. 5 ； 所述缺口平移緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)為（NH4) 2S04、 KC1、MgS04、Triton X-100 和 dNTPs，Tris-HCl 緩沖液的濃度為 200mM, (NH4)2SO4 在所述 10X缺口平移緩沖液中的濃度為IOOmM, KCl在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度為 IOOmM, MgSO4在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度為20mM，Triton X-100在所述10X缺 口平移緩沖液中的體積百分含量為1%，dNTPs在所述10 X缺口平移緩沖液中的濃度為2mM， 所述dNTPs包含等濃度的dATP、dm5CTP，dGTP和dTTP，溶液pH為8. 8 ; 所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為Tris、（NH4) 2S04、 MgCljP β-巰基乙醇，Tris在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為670mmol/L，（NH4)2SO 4 在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為166mmol/L，MgCl2在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液 中的濃度為67mmol/L，β -巰基乙醇在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為100mm〇l/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于：所述DNA片段化酶的商品名稱為 NEBNext dsDNA Fragmentase，購自 NEB 公司，產(chǎn)品目錄號為 M0348L ; 所述DNA片段化反應(yīng)緩沖液的商品名稱為IOXFragmentase Reaction Buffer,購自 NEB公司； 所述T4DNA聚合酶的商品名稱為T4DNA Polymerase，購自NEB公司，產(chǎn)品目錄號為 M0203S ； 所述DNA聚合酶I, (Klenow)大片段的商品名稱為DNA Polymerase I, Large(Klenow) Fragment，購自NEB公司，產(chǎn)品目錄號為M0210S ; 所述T4多聚核苷酸激酶的商品名稱為T4Polynucleotide Kinase,購自NEB公司，產(chǎn)品 目錄號為M0201 ; 所述T4DNA連接酶緩沖液的商品名稱為IOXT4DNA Ligase Buffer，購自NEB公司； 所述T4DNA連接酶的商品名稱為T4DNA Ligase，購自NEB司，產(chǎn)品目錄號為M0202S ; 所述Bst DNA聚合酶（大片段）的商品名稱為Bst DNA Polymerase，Large Fragment， 購自NEB公司，產(chǎn)品目錄號為M0275 ; 所述高保真DNA聚合酶的商品名稱為Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，購自 NEB公司，產(chǎn)品目錄號為M0530S。
8. -種用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫的構(gòu)建方法，包括如下步驟： (1) 提取基因組DNA ; (2) 將基因組DNA進(jìn)行片段化，收集長度為100-300bp的片段化DNA并純化； (3) 將步驟（2)得到的DNA的粘性末端修復(fù)成平末端，并在5'末端進(jìn)行磷酸化修飾并 純化； (4) 對步驟（3)得到的DNA片段連接權(quán)利要求2所述的接頭分子并純化； (5) 將步驟（4)得到的DNA片段進(jìn)行缺口平移； (6) 將步驟（5)得到的DNA片段進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾及脫磺酸基并純化； (7) 以步驟（6)得到的DNA片段為模板，以權(quán)利要求3所述的引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即為富集的DNA甲基化狀態(tài)的文庫。
9. 權(quán)利要求2所述的接頭分子和權(quán)利要求3所述的引物在構(gòu)建用于高通量測序分析 DNA甲基化狀態(tài)的文庫中的應(yīng)用； 和/或， 權(quán)利要求4所述的重亞硫酸鹽修飾試劑在構(gòu)建用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的 文庫中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求5-7任一所述的試劑盒在構(gòu)建用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文 庫中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫構(gòu)建方法。本發(fā)明公開的一組DNA分子，該組分子由如下（1）-（4）所示的四種分子組成：（1）SEQ IDNo.1所示的DNA分子；（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)方法中重亞硫酸鹽修飾試劑現(xiàn)配現(xiàn)用的問題，并公開了一種用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫的制備方法，利用該方法可以方便，快捷地構(gòu)建用于高通量測序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫。
【IPC分類】C40B50-06, C12N15-11, C12Q1-68, C40B40-06
【公開號】CN104651352
【申請?zhí)枴緾N201310576985
【發(fā)明人】郭良讓, 劉秀, 苗茹
【申請人】蘇州吉瑪基因股份有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2013年11月15日