基于顯微圖像分析的稻瘟病菌孢子檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種稻瘟病菌孢子檢測方法，尤其是一種基于顯微圖像分析的稻瘟病 菌孢子檢測方法，屬于稻瘟病檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 選育和種植抗性品種是防控稻瘟病的有效措施，在稻瘟病室內(nèi)抗性鑒定中，病菌 懸浮液中孢子的數(shù)量是影響抗性鑒定結(jié)果的重要因素，當(dāng)懸浮液中的孢子數(shù)量不符合接種 要求時，將會錯誤地評估水稻品種的抗性等級；此外，稻瘟病的發(fā)生及病害的嚴重程度與一 定區(qū)域內(nèi)病菌（分生孢子）的數(shù)量密切相關(guān)。因此，研宄快速、準確的稻瘟病菌孢子檢測方 法無論對稻瘟病的抗性鑒定還是田間病害監(jiān)測都具有重要意義。
[0003] 病菌的常用檢測方法有平板菌落計數(shù)法、顯微鏡下人工計數(shù)法、比濁法和流式細 胞儀測定法等。平板菌落計數(shù)法的成本低，但其勞動強度大、檢測耗時長；顯微鏡下人工計 數(shù)法適用于體積較大菌體的檢測，對于個體較小的菌體操作工作量和誤差較大；比濁法成 本較高，適用于菌體分散良好且干擾少的細菌；流式細胞儀測定法檢測速度快，精度高，但 設(shè)備儀器昂貴。
[0004] 目前，在植物病菌孢子檢測方面，通常是操作人員根據(jù)顯微鏡下病菌孢子的形態(tài) 特征完成檢測和計數(shù)，由于顯微圖像中孢子個體小、數(shù)量大、雜質(zhì)多，利用人工計數(shù)方法費 時費力，且易造成較大計數(shù)誤差。因此，為了提高稻瘟病菌孢子檢測的準確率和自動化水 平，需要研宄=一種簡便、準確、高效的孢子檢測和計數(shù)方法。
[0005] 雖然顯微圖像處理技術(shù)檢測稻瘟病菌的研宄未見報道，但是已有一些學(xué)者利用顯 微圖像技術(shù)檢測其他植物病原菌的研宄：l)Chesmore等（ChesmoreD，BernardT，InmanA J，etal..ImageanalysisfortheidentificationofthequarantinepestTilletia indica[J].EPPOBulletin，2003,33(3) :495-499.)利用病害圖像研究小麥印度腥黑穗病 孢子和黑麥草腥黑穗病菌孢子的分類，該研宄從病害圖像中自動定位孢子，并提取其周長、 表面積、突起數(shù)及突起的大小、最大（?。┌霃胶蛨A形度等相關(guān)參數(shù)作為分類依據(jù)；2)張俊 祥等（張俊祥，肖茜，方呈祥，等.噬菌斑電子圖像的計算機處理及其自動計數(shù)[J].中國 病毒學(xué)，2003，18 (4) :387-390.)將噬菌斑制成電子圖像，抽取圖像中有代表性的區(qū)域，利 用分水嶺算法對圖像進行分割處理，將相連的噬菌斑分割成單獨的噬菌斑，然后利用區(qū)域 生長法進行計數(shù)；3)張榮標等（張榮標，黃義振，孫曉軍，等.基于圖像處理的圓褐固氮菌 濃度快速檢測方法[J].農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2012,43(10) : 174-178.)通過對圓褐固氮菌微視圖 像的采集、預(yù)處理、分割和特征提取，運用SVM進行識別、分類和計數(shù)，獲取圓褐固氮菌的濃 度，實現(xiàn)了圓褐固氮菌活性的快速檢測；4)鄧繼忠等（鄧繼忠，李敏，袁之報，等.基于圖像 識別的小麥腥黑穗病害特征提取與分類[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2012(03) :172-176.)利用小 麥腥黑穗病害顯微圖像，采用圖像分析與識別技術(shù)進行了小麥的矮腥、印度腥及網(wǎng)腥3類 病害的分類識別。通過分析，從病害孢子圖像的16個形狀和紋理特征中，選擇長軸、短軸、 等價橢圓短軸、周長、面積和熵6個典型特征用于分類，并基于線性核函數(shù)建立支持向量機 模型，對這3種小麥腥穗病害進行分類鑒定，總體識別率達到82.9% ;5)李小龍等（李小 龍，馬占鴻，孫振宇，等.基于圖像處理的小麥條銹病菌夏孢子模擬捕捉的自動計數(shù)[J].農(nóng) 業(yè)工程學(xué)報，2013(2) :199-206.)利用孢子捕捉器捕捉小麥條銹病菌夏孢子，運用顯微鏡 照相技術(shù)獲得孢子圖像，對圖像進行基于最近鄰插值法的縮放處理、基于K-means聚類算 法的分割處理、形態(tài)學(xué)操作修飾和分水嶺分割等一系列的處理，實現(xiàn)夏孢子的自動計數(shù)和 記D
[0006] 通常稻瘟病菌孢子在顯微鏡下人工計數(shù)時，放大倍數(shù)為10X10,此時，孢子中間部 位透明，只含有邊界信息，而有時邊界信息并不清晰，給圖像處理帶來很大困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種基于顯微圖像分析的 稻瘟病菌孢子檢測方法，該方法能實現(xiàn)稻瘟病菌孢子數(shù)量的快速、準確的自動檢測，可為稻 瘟病室內(nèi)抗性鑒定過程提供技術(shù)支持。
[0008] 本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達到：
[0009] 基于顯微圖像分析的稻瘟病菌孢子檢測方法，所述方法包括：制備孢子懸浮液； 利用稻瘟病菌孢子圖像檢測系統(tǒng)獲取孢子懸浮液中的孢子顯微圖像；然后利用圖像光照校 正、中值濾波、邊緣檢測、形態(tài)學(xué)運算對孢子顯微圖像進行處理，并結(jié)合形狀特征參數(shù)，提取 出只含孢子的顯微圖像；最后采用改進分水嶺算法對粘連孢子進行分離，進而實現(xiàn)顯微圖 像中孢子的檢測和數(shù)量統(tǒng)計。
[0010] 作為一種實施方案，所述稻瘟病菌孢子圖像檢測系統(tǒng)包括顯微鏡、攝像機和計算 機，所述計算機中裝有NIS-ElementsBR圖像采集軟件，所述攝像機與計算機連接；
[0011] 所述利用稻瘟病菌孢子圖像檢測系統(tǒng)獲取孢子懸浮液中的孢子顯微圖像，具體如 下：
[0012] 用無菌的細口滴管將稀釋的孢子懸浮液在載玻片中央滴1小滴，蓋上清潔干燥的 蓋玻片，將載玻片放置在顯微鏡的載物臺上，選用放大倍數(shù)為10X10下觀察，找到目標區(qū) 域，調(diào)節(jié)攝像機安裝位置，使圖像正確顯示在計算機的顯示器中，選擇與顯微鏡相適應(yīng)的場 景模式以及設(shè)置白平衡，通過計算機的圖像采集軟件采集稻瘟病菌孢子顯微圖像。
[0013] 作為一種實施方案，所述利用圖像光照校正、中值濾波、邊緣檢測、形態(tài)學(xué)運算對 孢子顯微圖像進行處理，具體包括以下步驟：
[0014] 1)圖像光照校正
[0015] 1. 1)圖像分塊：將圖像I(i，j)進行MXN分塊，其中M=N= 4;
[0016] 1. 2)估算圖像背景的灰度：計算每個圖像塊的像素灰度均值y和標準差0，然后 以max(min，y-3 〇 )作為該區(qū)域的背景灰度；其中min為該區(qū)域像素的最小灰度值；
[0017] 1. 3)圖像光照不均勻校正：從原始圖像中減去步驟2)計算出的背景灰度圖像，以 校正光照不均勻；
[0018] 2)中值濾波
[0019] 采用3X3型濾波模板對光照校正后圖像進行中值濾波處理；
[0020] 3)邊緣檢測
[0021] 采用Canny算子進行圖像邊緣檢測，包括：3. 1)用高斯濾波器平滑圖像；3. 2)利 用一階偏導(dǎo)的有限差分來計算梯度的幅值和方向，得到梯度圖像；3. 3)對梯度幅值進行非 極大值抑制；3. 4)用雙閾值算法檢測并且連接邊緣；
[0022] 4)形態(tài)學(xué)運算
[0023] 根據(jù)孢子形態(tài)特征，采用8X