一種選擇性擴(kuò)增rna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種選擇性擴(kuò)增RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在分析基因表達(dá)時，常規(guī)方法抽提RNA的樣本，經(jīng)常會遇到如何排除DNA干擾和污染的問題。通常會使用DNA酶處理，以保證RNA檢測結(jié)果的真實(shí)性。大量的RNA樣本還可以忍耐由于DNA酶處理所造成的樣本損失，但是小量的RNA，單細(xì)胞的RNA樣本分析則不是有效方法。珍貴的小量RNA或單細(xì)胞RNA，需要做多種基因表達(dá)分析時，通常需要對樣本做基因擴(kuò)增。擴(kuò)增RNA的方法通常有以T7為基礎(chǔ)的cRNA擴(kuò)增和DNA多聚酶反應(yīng)(PCR等)為基礎(chǔ)的DNA擴(kuò)增，但從原理上不能解決DNA的干擾或污染問題。一些利用DNA和RNA雜交探針擴(kuò)增cDNA的方法，擴(kuò)增時，DNA結(jié)合部分在一定溫度下，難以展開，造成很多的非特異性產(chǎn)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于針對上述不足，提出一個可靠的選擇性擴(kuò)增RNA，而不擴(kuò)增DNA的方法。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0005]一種選擇性擴(kuò)增RNA的方法，包括以下步驟:
[0006](I)由cDNA合成探針結(jié)合到RNA模板上，在有RNA轉(zhuǎn)錄酶的條件下，合成第一鏈cDNA ；
[0007](2)在有RNA酶的條件下，對結(jié)合的RNA進(jìn)行切割；
[0008](3)在有DNA合成酶的條件下，合成第二鏈cDNA ；
[0009](4)在RNA轉(zhuǎn)錄酶存在的條件下，合成cDNA合成探針中RNA部分的cDNA ；
[0010](5)在RNA酶存在的條件下，酶切結(jié)合的cDNA合成探針的RNA部分；
[0011](6)在cDNA擴(kuò)增探針存在的條件下，cDNA擴(kuò)增探針結(jié)合到空出的部位，在DNA合成酶(DNAPolymerase)的作用下，擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物；
[0012](7)通過改變cDNA擴(kuò)增探針和cDNA合成探針的核苷酸的相同序列程度，可調(diào)式cDNA擴(kuò)增的溫度條件。
[0013]進(jìn)一步地，所述cDNA合成探針是一種由DNA和RNA片段連成的雜交探針，定位性或隨機(jī)性結(jié)合的探針。
[0014]更進(jìn)一步地，所述cDNA合成探針的DNA部分是和要擴(kuò)增的RNA有配對結(jié)合的，其RNA部分原則上是整個RNA樣本中沒有完全一樣的，序列結(jié)構(gòu)特殊；
[0015]所述cDNA合成探針的DNA部分是用來合成RNA的第一和第二 cDNA鏈，其RNA部分是為了在合成的第二 cDNA鏈上帶有該RNA配對結(jié)構(gòu)的cDNA，作為cDNA擴(kuò)增的結(jié)合點(diǎn)和啟動點(diǎn)。
[0016]優(yōu)選地，為達(dá)到高效、全面擴(kuò)增RNA的目的，需要連續(xù)合成第一和第二 cDNA鏈，以提高探針模板的合成效率。
[0017]進(jìn)一步地，所述cDNA擴(kuò)增探針也是一種DNA和RNA片段連成的雜交探針，而且cDNA擴(kuò)增探針和由cDNA合成探針可有一個堿基或多個堿基不配對。
[0018]優(yōu)選地，所述要擴(kuò)增的RNA樣本可以為RNA樣本、多細(xì)胞或者為單個細(xì)胞。
[0019]優(yōu)選地，如果為RNA樣本，可以調(diào)制在蒸餾水或緩沖液中；如果是多細(xì)胞或者單細(xì)胞，則可以調(diào)制在細(xì)胞裂解液或緩沖液中。
[0020]進(jìn)一步地，如果為RNA樣本，還包括定量小樣本的RNA或裂解細(xì)胞處理，合成第一cDNA鏈、合成第二 cDNA鏈以及擴(kuò)增cDNA步驟。
[0021]優(yōu)選地，所述該擴(kuò)增法是線性擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物是cDNA，擴(kuò)增的產(chǎn)物可以直接用于PCR，定量PCR或各種基因芯片分析。
[0022]進(jìn)一步地，所述該擴(kuò)增法可以擴(kuò)增樣本中所有的、不同大小的RNA，或者設(shè)計(jì)定位的擴(kuò)增探針，擴(kuò)增所需要擴(kuò)增的RNA。
[0023]cDNA擴(kuò)增中使用cDNA合成探針，RNaseH, cDNA擴(kuò)增探針，DNA鏈分離合成酶相配合，而達(dá)到高效擴(kuò)增的目的。cDNA擴(kuò)增還包括使用單鏈DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合擴(kuò)增后的cDNA產(chǎn)物，使cDNA擴(kuò)增反應(yīng)有效地、長時間地進(jìn)行。
[0024]本方法的原理為:其核心是要在合成第一鏈和第二鏈cDNA以及在擴(kuò)增所合成的cDNA時，選擇性地擴(kuò)增由RNA由來的產(chǎn)物，而不是由樣本中的DNA由來的產(chǎn)物。該方法選擇性擴(kuò)增RNA的原理，如傳統(tǒng)的cDNA合成法和擴(kuò)增法明顯不同之處有三點(diǎn)點(diǎn)。第一點(diǎn)是，利用DNA和RNA雜交cDNA合成探針，保證了只有RNA由來的樣本，才能合成cDNA合成探針中的RNA部分的cDNA模板，作為cDNA擴(kuò)增的起點(diǎn)(T7擴(kuò)增法用的是DNA探針);第二點(diǎn)是，每次新擴(kuò)增都需要RNase酶切，騰出位子讓新的cDNA擴(kuò)增探針結(jié)合，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性強(qiáng)，并且可在恒溫下(當(dāng)然也可以在變化的溫度下，只是恒溫更理想)，不斷地擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物是cDNA(T7擴(kuò)增法的產(chǎn)物是cRNA)，可以直接用于PCR、定量PCR或各種基因芯片的多基因分析、檢測和定量基因表達(dá)水平。第三點(diǎn)是，由于cDNA擴(kuò)增探針的特殊設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)，其和合成模板的結(jié)合溫度是按酶反應(yīng)要求進(jìn)行設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)的。本方法擴(kuò)增RNA可達(dá)百萬級以上，所以即使原來有存在于樣本中的微量DNA，因?yàn)椴荒軘U(kuò)增，在最終的基因表達(dá)分析上，基本沒有影響。所以該方法既可以用在小量的RNA樣本上，也可以用在單細(xì)胞水平的基因表達(dá)分析上。
[0025]本發(fā)明方法所采用的技術(shù)方案，概括起來為:1.使用的生物樣本可以是小量的RNA樣本或少數(shù)甚至單個細(xì)胞，使用或不使用細(xì)胞裂解處理。2.用特殊設(shè)計(jì)的DNA和RNA結(jié)構(gòu)組成的cDNA合成探針合成cDNA的第一和第二鏈，特別是讓第一 cDNA鏈中含有cDNA合成探針結(jié)構(gòu)中的RNA部分的cDNA。3.在有cDNA擴(kuò)增探針、RNA酶和DNA合成酶存在的條件下，高效率地擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物。
[0026]本發(fā)明的有益效果是:
[0027](I)可以對小量的RNA樣本或少量細(xì)胞甚至是單細(xì)胞的RNA作選擇性的高效率擴(kuò)增。
[0028](2)擴(kuò)增的產(chǎn)物是cDNA，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可直接用于PCR，定量PCR或各種芯片雜交分析。
[0029](3)擴(kuò)增可以在恒溫條件下進(jìn)行，容易操作。
[0030](4)該方法屬于線性的擴(kuò)增，適用于作基因定量分析。
[0031](5)擴(kuò)增產(chǎn)物可以是單鏈的DNA或最終產(chǎn)物為雙鏈，可供芯片雜交使用或PCR使用。
[0032](6)操作方法和過程簡單，對儀器、設(shè)備要求較低。
【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種選擇性擴(kuò)增RNA方法的原理圖；
[0034]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2和3提供的多個基因獲得較均等的高效率擴(kuò)增以后的比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]實(shí)施例1
[0036]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0037]一種選擇性擴(kuò)增RNA的方法，其原理圖參照圖1。該方法包括以下步驟:
[0038](I)由cDNA合成探針結(jié)合到RNA模板上，在有RNA轉(zhuǎn)錄酶的條件下，合成第一鏈cDNA ；
[0039](2)在有RNA酶的條件下，對結(jié)合的RNA進(jìn)行切割；
[0040](3)在有DNA合成酶的條件下，合成第二鏈cDNA ；
[0041](4)在RNA轉(zhuǎn)錄酶存在的條件下，合成cDNA合成探針中RNA部分的cDNA ；
[0042](5)在RNA酶存在的條件下，酶切結(jié)合的cDNA合成探針的RNA部分；
[0043](6)在cDNA擴(kuò)增探針存在的條件下，cDNA擴(kuò)增探針結(jié)合到空出的相當(dāng)于cDNA合成探針的RNA部位，在DNA合成酶(DNA Polymerase)的作用下，擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物。結(jié)合到cDNA模板上的cDNA擴(kuò)增探針的RNA部分又被RNA酶切割，新的cDNA合成探針又會結(jié)合到cDNA模板上，在DNA合成酶的作用下，合成新的cDNA產(chǎn)物。由此重復(fù)、不斷地擴(kuò)增cDNA。
[0044]cDNA合成探針是一種由DNA和RNA片段連成的雜交探針，定位性或隨機(jī)性結(jié)合