一種基于mda的全基因組擴(kuò)增的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域,具體地,涉及一種基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 過(guò)去二十幾年里,隨著基因測(cè)序技術(shù)水平的提高以及千人基因組計(jì)劃、癌癥基因 組計(jì)劃、Meta-Hit計(jì)劃等重大國(guó)際合作項(xiàng)目的相繼開(kāi)展,基因組研宄日漸被推向高潮。然 而,迄今為止使用的測(cè)序材料無(wú)一例外都是數(shù)百萬(wàn)甚至更多細(xì)胞的混合DNA樣本。這種方 法能夠得到全基因組序列信息,但是對(duì)其進(jìn)行研宄得到的結(jié)果只是一群細(xì)胞中信號(hào)的平均 值,或者只代表其中占優(yōu)勢(shì)數(shù)量的細(xì)胞信息,單個(gè)細(xì)胞獨(dú)有的特性被忽視。例如,科學(xué)家想 找出哪種突變存在于哪種細(xì)胞中幾乎是不可能的,只存在于少數(shù)細(xì)胞(如早期癌細(xì)胞)中 的突變也基本上被掩藏。另一方面,有些樣品稀少無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),樣品量不足以進(jìn)行全 基因組分析,例如腫瘤循環(huán)細(xì)胞、組織微陣列、早期發(fā)育的胚胎細(xì)胞等。這些都是全基因組 測(cè)序遇到的難題。
[0003] 單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新 技術(shù)。其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,獲得高覆蓋率的完整的 基因組之后通過(guò)外顯子捕獲進(jìn)而高通量測(cè)序用于揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。
[0004] 全基因組擴(kuò)增技術(shù)主要分為兩種類(lèi)型:一是基于熱循環(huán)以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技 術(shù),如簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR(LM-PCR)、擴(kuò)增前引物延伸反 應(yīng)(PEP)等;一是基于等溫反應(yīng)不以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù),如多重置換擴(kuò)增(MDA)和基于 引物酶的全基因組擴(kuò)增(PWGA)。
[0005] 在這兩種類(lèi)型中,PCR擴(kuò)增比較經(jīng)典,但是,對(duì)不同的序列來(lái)說(shuō),PCR擴(kuò)增的效率存 在相當(dāng)大的偏差,易產(chǎn)生擴(kuò)增偏倚問(wèn)題:如富含CG的DNA序列和相應(yīng)基因座位的非隨機(jī)丟 失,等位基因的非隨機(jī)丟失,以及與DNA片段大小相關(guān)的偏差(傾向于擴(kuò)增更多短片段),尤 其是在應(yīng)用于單細(xì)胞時(shí),大量短片段導(dǎo)致片段間序列丟失,從而使其應(yīng)用受限
[0006] MDA是目前公認(rèn)的最好的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù),它能對(duì)全基因組進(jìn)行高保真的 均勻擴(kuò)增,擴(kuò)增出10?IOOkb大小的片段,能提供大量均一完整的全基因組序列。但當(dāng)樣 本量降低到單個(gè)細(xì)胞,就無(wú)法得到準(zhǔn)確的擴(kuò)增,對(duì)于單細(xì)胞基因組擴(kuò)增需求來(lái)說(shuō),目前存在 技術(shù)壁皇。MALBAC的方法存在操作復(fù)雜,覆蓋率不高,PCR引入誤差等等缺陷。對(duì)于臨床應(yīng) 用,存在這一些包括流程復(fù)雜、覆蓋率不高、誤差等問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明提供了一種基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法, 該方法能夠有效的進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞全基因組的擴(kuò)增,提供足夠量的DNA為后續(xù)檢測(cè)使用。該 方法克服了覆蓋率低的問(wèn)題,相比PCR的方法,該方法降低了誤差率,操作簡(jiǎn)便,更便于臨 床檢測(cè)采用。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,其特征在于,包括 如下步驟,
[0009] 1)分離提取出單個(gè)細(xì)胞;
[0010] 2)提取所述單細(xì)胞的基因組DNA ;單細(xì)胞基因組DNA的提取目前有很多種方法,比 如Cell Search的方法,微流控芯片提取法。本發(fā)明獲得單細(xì)胞基因組DNA的方法還可以 是加入細(xì)胞裂解酶和裂解液,靜置10分鐘,通過(guò)裂解細(xì)胞得到其基因組DNA ;
[0011] 3)以步驟2)所得單細(xì)胞基因組DNA用稀釋溶液稀釋?zhuān)玫紻NA模板,用Haplox法 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行多重置換擴(kuò)增
[0012] 4)將步驟3)所得產(chǎn)物進(jìn)行純化,得到純化DNA。
[0013] 還包括步驟5)測(cè)序分析所得純化DNA。
[0014] Haplox法單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行多重置換擴(kuò)增的具體步驟如下:
[0015] 制備混合液A :在擴(kuò)增體系中,加入隨機(jī)引物OCtamer和DNA模板,隨機(jī)引物 octamer的濃度為40 μ M,得到混合液A ;
[0016] 制備混合液 B :新鮮混合 IOx Phi29Buffer, ImM dNTPs, 0· ImM dUTP, Η20, and Phi29Polymerase(10U/yL,Enzymat ics),得到混合液 B;4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0017] 反應(yīng)進(jìn)行:將混合液A與混合液B等體積混合加入反應(yīng)管,在30°C下反應(yīng)4-10個(gè) 小時(shí),升溫至65°C失活酶;
[0018] 測(cè)試DNA濃度:隨后向反應(yīng)管加入50uL H2O,用Qubit 2. Ofluorometer測(cè)試DNA 的濃度至 300 - 3000ng DNA。
[0019] 較佳地,反應(yīng)進(jìn)行時(shí),將混合液A與混合液B等體積混合加入反應(yīng)管后,再加入礦 物油覆蓋反應(yīng)液,而后在30°C下反應(yīng)。
[0020] 較佳地,反應(yīng)完成后,升溫至65°C失活酶,隨后向反應(yīng)管加入50uL H20,混合均勻, 快速離心,將混合液轉(zhuǎn)移至干凈無(wú)菌的封口膜上,液相會(huì)呈現(xiàn)水珠液滴,油相會(huì)分散到封口 膜上;用移液槍將液滴吸取到一個(gè)新的無(wú)菌小試管中,用Qubit 2. Ofluorometer測(cè)試DNA 的濃度至 300 - 3000ng DNA。
[0021] 純化DNA 的方法選用 Backman 的 Agencourt AMPure XP 試劑盒或 Qiagen Mini PCR column。
[0022] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所述基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,該方法能夠 有效的進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞全基因組的擴(kuò)增,提供足夠量的DNA為后續(xù)檢測(cè)使用。而且該方法克 服了覆蓋率低的問(wèn)題,相比PCR的方法,該方法降低了誤差率。該方法操作簡(jiǎn)便,更便于臨 床檢測(cè)采用。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為MDA法擴(kuò)增,MALBAC法擴(kuò)增和普通PCR擴(kuò)增的測(cè)序覆蓋率比較結(jié)果。
[0024] 圖2為MDA法擴(kuò)增,MALBAC法擴(kuò)增和普通PCR擴(kuò)增的測(cè)序錯(cuò)誤率比較結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 除另有說(shuō)明外,本申請(qǐng)中所有的科技術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通 常理解的相同的含義。下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方式,而不應(yīng)理 解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下,對(duì)發(fā)明進(jìn)行改動(dòng)得到的技 術(shù)方案都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0026] 實(shí)施例
[0027] 在本申請(qǐng)中,如無(wú)特別說(shuō)明,本發(fā)明的實(shí)施都使用分子生物學(xué)、為生物學(xué)、重組DNA 和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù),這些技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在下 了文件中有詳細(xì)描述:Sambrook 等人編著的 Molecular Cloning:Alaboratory Mannual, 第二版(1989) ;Nucleic Acid Hybridizat ion(B.D.Hames 和 S.J.Higgin 編著,1984); Immnochemica I Methods in Cel I And Molecular Biology(Academic Press,London)〇 [0028] 實(shí)施例I :
[0029] 一種基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,包括如下步驟,
[0030] 1)分離提取出單個(gè)腫瘤細(xì)胞;
[0031] 2)用Cel I Search的方法提取所述單個(gè)腫瘤細(xì)胞的基因組DNA ;
[0032] 3)以步驟2)所得單細(xì)胞基因組DNA為模板,分別用Haplox法單細(xì)胞全基因組擴(kuò) 增試劑盒進(jìn)行多重置換擴(kuò)增(MDA),具體地,包括如下步驟:
[0033] 制備混合液A :在擴(kuò)增體系中,加入隨機(jī)引物octamer和基因組DNA模板,隨機(jī)引 物octamer的濃度為40 μ M,得到混合液A ;
[0034] 制備混合液 B :新鮮混合 IOx Phi29Buffer, ImM dNTPs, 0· ImM dUTP, Η20, and Phi29Polymerase(10U/yL,Enzymat ics),得到混合液 B;4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0035] 反應(yīng)進(jìn)行:將混合液A與混合液B等體積混合加入反應(yīng)管,再加入礦物油覆蓋反應(yīng) 液,在30°C下反應(yīng)4-10個(gè)小時(shí),升溫至65°C失活酶;
[0036] 測(cè)試DNA濃度:隨后向反應(yīng)管加入50uL H2O,混合均勾,快速離心,將混合液轉(zhuǎn)移 至干凈無(wú)菌的封口膜上,液相會(huì)呈現(xiàn)水珠液滴,油相會(huì)分散到封口膜上;用移液槍將液滴吸 取到一個(gè)新的無(wú)菌小試管中,用Qubi t 2. Ofluorometer測(cè)試DNA的濃度至300 - 3000ng DNA0
[0037] 4)將步驟3)所得產(chǎn)物分別進(jìn)行純化,得到純化DNA ;
[0038] 5)分別測(cè)序分析所得純化DNA,將測(cè)序結(jié)果與模板DNA序列進(jìn)行對(duì)比,計(jì)算測(cè)序覆 蓋率和錯(cuò)誤率,將數(shù)據(jù)記錄如表1,并依據(jù)表1中的數(shù)據(jù)作圖1和圖2。
[0039] 表I. Haplox法單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增覆蓋率和錯(cuò)誤率比較
[0040]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,其特征在于,包括如下步驟, 1) 分離提取出單個(gè)細(xì)胞; 2) 提取所述單細(xì)胞的基因組DNA ; 3) 以步驟2)所得單細(xì)胞基因組DNA用稀釋溶液稀釋?zhuān)玫紻NA模板,用Haplox法單細(xì) 胞全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行多重置換擴(kuò)增 4) 將步驟3)所得產(chǎn)物進(jìn)行純化,得到純化DNA。
2. 如權(quán)利要求1所述的基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,其特征在于,還包括步驟5) 測(cè)序分析所得純化DNA。
3. 如權(quán)利要求1所述的基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,其特征在于,Haplox法單細(xì) 胞全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行多重置換擴(kuò)增的具體步驟如下: 制備混合液A :在擴(kuò)增體系中,加入隨機(jī)引物octamer和DNA模板,隨機(jī)引物octamer的 濃度為40 μ M,得到混合液A ; 制備混合液 B :新鮮混合 IOx Phi29Buffer, ImM dNTPs, 0· ImM dUTP, Η20, and Phi29Polymerase(10U/yL,Enzymat ics),得到混合液 B;4°C保存?zhèn)溆茫? 反應(yīng)進(jìn)行:將混合液A與混合液B等體積混合加入反應(yīng)管,在30°C下反應(yīng)4-10個(gè)小時(shí), 升溫至65 °C失活酶; 測(cè)試DNA濃度:隨后向反應(yīng)管加入50uL H2O,用Qubit 2. Ofluorometer測(cè)試DNA的濃 度至 300 - 3000ng DNA。
4. 如權(quán)利要求3所述的基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,其特征在于, 反應(yīng)進(jìn)行時(shí),將混合液A與混合液B等體積混合加入反應(yīng)管后,再加入礦物油覆蓋反應(yīng) 液,而后在30°C下反應(yīng)。
5. 如權(quán)利要求4所述的基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,其特征在于,反應(yīng)完成后,升 溫至65°C失活酶,隨后向反應(yīng)管加入50uL H20,混合均勻,快速離心,將混合液轉(zhuǎn)移至干凈 無(wú)菌的封口膜上,液相會(huì)呈現(xiàn)水珠液滴,油相會(huì)分散到封口膜上;用移液槍將液滴吸取到一 個(gè)新的無(wú)菌小試管中,用Qubi t 2. Ofluorometer測(cè)試DNA的濃度至300 - 3000ng DNA。
6. 如權(quán)利要求1所述的基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,其特征在于,純化DNA的方法 選用 Backman 的 Agencourt AMPure XP 試劑盒或 Qiagen Mini PCR column。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種基于MDA的全基因組擴(kuò)增的方法,其特征在于,包括如下步驟,1)分離提取出單個(gè)細(xì)胞;2)提取所述單細(xì)胞的DNA;3)以步驟2)所得單細(xì)胞DNA為模板,用Haplox法單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行多重置換擴(kuò)增(MDA);4)將步驟3)所得產(chǎn)物進(jìn)行純化,得到純化DNA。
【IPC分類(lèi)】C12N15-10, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104560950
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410709576
【發(fā)明人】許明炎
【申請(qǐng)人】深圳市海普洛斯生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年11月28日