一種昆蟲細胞色素p450基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及昆蟲細胞色素P450基因、基因片段及其 dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在我國，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展在國家發(fā)展戰(zhàn)略中具有舉足輕重的作用，農(nóng)業(yè)蟲 害的綜合防治是農(nóng)業(yè)植物保護的重要工作。飛蝗具有迀飛性和暴發(fā)性，蝗災(zāi)是我國農(nóng)業(yè)歷 史上的重大自然災(zāi)害?；葹?zāi)治理仍主要采取化學(xué)防治方法，殺蟲劑的大規(guī)模應(yīng)用對農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅。在綠色植保的發(fā)展理念的指導(dǎo)下，探索新型環(huán)保的害蟲防 治方法成為植物保護領(lǐng)域的發(fā)展方向。
[0003] 目前，基于RNA干擾（RNA interference, RNAi)的害蟲控制方法，已成為新的害蟲 防治手段。該技術(shù)利用昆蟲自身基因片段，通過RNAi抑制昆蟲體內(nèi)生長發(fā)育或生化代謝中 關(guān)鍵基因的表達，以控制害蟲為害。該技術(shù)具有抗蟲專一性，對非靶標(biāo)生物無殺傷作用和對 環(huán)境無毒無害的優(yōu)勢。
[0004] RNAi常用的導(dǎo)入方法有注射、飼喂、浸泡、組織培養(yǎng)、病毒感染、轉(zhuǎn)基因等。利用 RNAi技術(shù)防治害蟲的可行性已被證實，2007年發(fā)表于Nature Biotechnology中的兩篇學(xué) 術(shù)論文報道了該領(lǐng)域進展。已成功培育出dsRNA轉(zhuǎn)基因玉米和棉花植株，誘導(dǎo)特異性RNAi 反應(yīng)，達到了防治害蟲的目的（Baum et al，2007;Mao et al，2007)。研宄表明，RNA干擾技 術(shù)能夠有效控制害蟲，在農(nóng)業(yè)植保防治領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。而實現(xiàn)基于RNAi害蟲有 效控制的關(guān)鍵問題是篩選害蟲特異性和高效致死作用的dsRNA。
[0005] 昆蟲表皮脂類主要成分為碳氫化合物、醇及蠟脂等，其可防止昆蟲體內(nèi)水分的過 分蒸發(fā)，同時在昆蟲防御、生殖及通訊等方面也發(fā)揮著重要作用，因此抑制昆蟲表皮脂類合 成可達到害蟲防治的目的。細胞色素P450單氧化酶基因CYP4G102主要負責(zé)飛蝗表皮脂類 物質(zhì)的合成，由于CYP4G基因是昆蟲所特有的，故采用該基因開展基于RNAi的害蟲防治應(yīng) 用是安全的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種昆蟲細胞色素P450基因、基因片段及其dsRNA和 dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的一種昆蟲細胞色素P450基因（全長序列），其核苷酸序列是SEQ ID NO :1，序列長度為1686bp ;氨基酸序列是SEQ ID NO :2,序列長度為561aa。
[0008] 本發(fā)明提供的一種昆蟲細胞色素P450基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO :3。
[0009] 本發(fā)明提供的一種昆蟲細胞色素P450基因片段的獲得的方法，包括如下步驟：對 飛蝗細胞色素P450基因（CYP4G102)氨基酸序列分析后，選擇細胞色素P4504G家族的特征 區(qū)域，設(shè)計上游引物SEQ ID N0:4和下游引物SEQ ID N0:5,以含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1的質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增獲得SEQ ID NO :3的DNA片段，該片段含有17啟動子，核苷 酸序列長度為443bp。
[0010] 進一步，以SEQ ID NO :3的DNA片段為模板，利用試劑盒合成dsRNA(dsCYP4G102)。
[0011] SEQ ID NO :3合成的dsRNA(簡稱為dsCYP4G102)在致死害蟲中的應(yīng)用：注射上述 dsRNA到昆蟲體腔，結(jié)果表明：SEQ ID勵：3合成的(1成隱可以特異性地沉默飛蝗細胞色素 P450基因CYP4G102的mRNA表達，導(dǎo)致飛蝗體壁保水性能減弱，體內(nèi)水分過度散失而死亡。
【附圖說明】
[0012] 圖1 :飛蝗2齡若蟲注射dsRNA 24h后，細胞色素P450(LmCYP4G102)基因的mRNA 表達情況。0 -actin為內(nèi)參基因，#P〈0. 01 (dsGFP :注射dsGFP的對照組，dsCYP4G102 :注 射dsCYP4G102的實驗組）。
[0013] 圖2 :飛蝗2齡若蟲注射dsRNA后對若蟲生長發(fā)育的影響。注射dsCYP4G102的實 驗組若蟲在蛻皮至3齡后不久便死亡，蟲體出現(xiàn)失水皺縮（圖2A)、變脆易碎（圖2B)的表 型。（dsGFP :注射dsGFP的對照組，dsCYP4G102 :注射dsCYP4G102的實驗組）。
[0014] 圖3 :飛蝗2齡若蟲注射dsRNA后，蛻皮至3齡時若蟲體重的比較。注射 dsCYP4G102的實驗組若蟲蛻皮死亡后體重明顯減輕。***代表兩組之間體重差異極顯著 (P〈0. 0001，T-test) (dsGFP :注射 dsGFP 的對照組，dsCYP4G102 :注射 dsCYP4G102 的實驗 組）。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1 :飛蝗細胞色素P450基因cDNA全長序列的獲得
[0016] 基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法對飛蝗細胞色素P450基因進行搜 索，經(jīng)過序列分析，獲得相關(guān)基因部分序列。通過cDNA末端快速克隆PCR技術(shù)，獲得飛蝗細 胞色素P450基因（LmCYP4G102) cDNA全長序列，核苷酸序列長度為1686bp，編碼561個氨基 酸。
[0017] 實施例2 :飛蝗細胞色素P450基因片段及其dsRNA的獲得
[0018] 1)飛蝗細胞色素P450基因片段的獲得
[0019] 根據(jù)細胞色素P4504G家族特征區(qū)域的序列，采用primer premier 5. 0軟件設(shè)計 特異性引物，上游引物序列為SEQ ID NO :4,下游引物序列為SEQ ID NO :5,所有引物均由生 工生物工程（上海）股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO: 1的質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲 得飛幢細胞色素 P450 基因片段，用Wizardl;SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega) 試劑盒將所獲飛蝗細胞色素P450基因片段進行純化。
[0020] 2)飛蝗細胞色素P450基因片段dsRNA的合成
[0021] 以1)步驟獲得的飛蝗細胞色素P450基因片段SEQ ID NO :3為模板， 按照T7RiboMAX?Express RNAi System (Promega)試劑盒說明書，體外轉(zhuǎn)錄合 成dsRNA (dsCYP4G102)。得到的dsRNA用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測其單一性，用 NANODROP (Thermo Scientific, USA)將其定量至終濃度為2 y g/ y L，保存至-80°C冰箱備 用。
[0022] 實施例3 :細胞色素P450基因片段合成的dsRNA致死飛蝗實驗
[0023] 1、飛蝗細胞色素P450基因CYP4G102片段合成的dsRNA注射
[0024] 選取飛蝗2齡第2天大小均一、健康狀況一致的若蟲，設(shè)置注射dsGFP的對照組和 注射SEQ ID NO:3的dsRNA(dsCYP4G102)的實驗組。采用微量注射器將體外合成的dsRNA 注射至若蟲體腔，dsRNA的注射量為4yg/頭，每組各60頭若蟲，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。注 射完畢后，將若蟲置于紗籠中放于人工氣候箱中飼養(yǎng)（光照：黑暗時間=14h:10h，溫度 30±2°C，濕度60% )，給以新鮮小麥幼苗喂食。
[0025] 2、飛蝗細胞色素P450基因沉默效率檢測
[0026] 取注射dsRNA 24h后的若蟲，對照組和實驗組均取12頭，雌雄各半，設(shè)置3個生 物學(xué)重復(fù)。Trizol法提取總RNA，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶獲得第一鏈cDNA，以此為模板進行 Real-time PCR，檢測目的基因（LmCYP4G102)和內(nèi)參基因（0-actin)的相對表達量，以計 算目的基因的沉默效率。結(jié)果表明該基因的沉默效率達90% (圖1)。
[0027] 3、注射dsRNA后飛蝗表型的觀察
[0028] 2齡若蟲注射dsRNA后，對照組與注射dsCYP4G102實驗組的若蟲在取食量、體型變 化及體重增長方面并無顯著差異，而且均可順利蛻皮至3齡，但dsCYP4G102注射組若蟲在 蛻至3齡后不久（約20min)便死亡，放置一段時間后（約3-4h)，蟲體出現(xiàn)失水皺縮的表 型，極易破碎（圖2A-B)。此時，將對照組與注射dsCYP4G102實驗組的3齡若蟲按雌雄分 類，稱量體重進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsCYP4G102注射組若蟲體重明顯減輕（圖3)。
[0029] 4、注射dsRNA后飛蝗死亡情況統(tǒng)計
[0030] 注射dsCYP4G102的飛蝗實驗組死亡率為100 %。這與注射dsGFP的對照組（死亡 率為〇% )相比，致死效果明顯。
【主權(quán)項】
1. 一種昆蟲細胞色素 P450基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO :1。
2. -種昆蟲細胞色素 P450基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO :3。
3. -種昆蟲細胞色素 P450基因片段的獲得方法，包括如下步驟：以含有核苷酸序列 SEQ ID NO: 1的質(zhì)粒為模板，用上游引物SEQ ID NO :4和下游引物SEQ ID NO :5進行PCR 擴增反應(yīng)，得到的產(chǎn)物經(jīng)Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)試劑盒純 化后，獲得核苷酸序列是SEQ ID NO :3的基因片段。
4. 一種昆蟲細胞色素 P450基因片段的dsRNA的合成方法，包括如下步驟：將權(quán) 利要求3獲得的核苷酸序列SEQ ID NO :3的基因片段，按照T7 RiboMA Express RNAi System(Promega)試劑盒說明書，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。
5. 如權(quán)利要求4所述方法合成的昆蟲細胞色素 P450基因片段的dsRNA。
6. 如權(quán)利要求5所述的昆蟲細胞色素 P450基因片段的dsRNA在致死飛蝗中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲細胞色素P450基因及其應(yīng)用，包括昆蟲細胞色素P450基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用。首先對飛蝗的細胞色素P450基因進行克隆、測序后，獲得CYP4G102基因，其核苷酸全長序列為SEQ ID NO：1，氨基酸序列為SEQ ID NO：2。而后獲得序列為SEQ ID NO：3的該基因片段，由該片段合成dsRNA。將上述合成的dsRNA注入飛蝗體腔后，此種昆蟲因蛻皮后體壁保水性能減弱，導(dǎo)致體內(nèi)水分過度散失而死亡，死亡率達到100％。本發(fā)明為基于RNA干擾的害蟲防治提供分子靶標(biāo)，可用于害蟲防治。
【IPC分類】A01N57-16, C12N15-10, A01P7-04, C12N15-53, C12N15-113
【公開號】CN104673812
【申請?zhí)枴緾N201510118799
【發(fā)明人】余志濤, 張學(xué)堯, 劉耀明, 張建珍, 馬恩波
【申請人】山西大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月18日