一種蘋果酸酶基因及其重組表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蘋果酸酶基因及其重組表達(dá)載體，具體涉及從(iforiiereWa 知77i/7a)M6-22中克隆的蘋果酸酶基因以及將該基因直接與不同載體連接，轉(zhuǎn)入不同宿主細(xì)胞中，利用其編碼蘋果酸酶催化蘋果酸脫羧，伴隨著產(chǎn)生丙酮酸、0)2和NADPH，其產(chǎn)生的NADPH具有提高植物光合作用速率、促進(jìn)脂肪酸的合成等功能，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果酸酶(malic enzyme, ME)是調(diào)控蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶,可以催化蘋果酸進(jìn)行氧化脫羧，伴隨著產(chǎn)生丙酮酸和CO2以及NAD(P)+的還原。蘋果酸酶廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中。根據(jù)輔酶因子的不同，蘋果酸酶可分為兩種:NAD-蘋果酸酶(NAD-Malicenzyme, NAD-ME, EC 1.1.1.38 和 EC 1.1.1.39 )和 NADP-蘋果酸酶(NADP-Malicenzyme，NADP-ME, EC 1.1.1.40)。本發(fā)明主要是針對(duì)NADP-蘋果酸酶基因進(jìn)行研究。
[0003]通常認(rèn)為，NADP-ME為各種細(xì)胞組分的合成提供還原力NADPH。例如在產(chǎn)油微生物油脂合成代謝調(diào)控中，NADP-ME持續(xù)為脂肪酸合成酶進(jìn)行鏈延伸提供NADPH (SongY D, Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147 (6):1 507-1 515.)。NADP-蘋果酸酶在植物的生長(zhǎng)代謝及發(fā)育過程中也扮演著重要角色，植物中蘋果酸酶的底物和產(chǎn)物參與多種代謝途徑，包括光合作用和呼吸作用。如熱帶C4植物中的固碳作用，保持植物細(xì)胞的滲透勢(shì)，穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)的PH和保持植物根系的離子吸收平衡起重要作用，是生物體生命活動(dòng)中重要的酶之一(Drincovich M F，Casati P, Andreo C S, FEBS Letters,2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D, Annual Review of Plant Phys1logy andPlantMolecular B1logy, 1994，45: 447- 467.)。此外，植物 NADP-ME 被認(rèn)為參與植物防御反應(yīng)。另有報(bào)道表明，NADP-ME參與了果實(shí)的成熟，通過蘋果酸代謝來平衡細(xì)胞內(nèi)的pH，還通過代謝提供碳源和NADPH調(diào)節(jié)一些底物及輔助因子來參與脂肪酸的合成。
[0004]NADP-ME也是景天酸代謝途徑(CAM)植物的一種重要脫羧酶，酶活性晝高夜低；兼性CAM植物隨著C3光合型向CAM型轉(zhuǎn)化，其NADP-ME酶活性涿漸升高，干旱誘導(dǎo)CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明:NADP_ME在CAM植物的活性調(diào)節(jié)中起重要作用。在CAM運(yùn)行和調(diào)節(jié)中，NADP-ME和PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)羧化酶一樣，具有重要調(diào)節(jié)作用(王晨，西北植物學(xué)報(bào)，1997，17 (2): 200-204.)。
[0005]蘋果酸酶作為生物體中樞代謝途徑的關(guān)鍵酶，也可應(yīng)用于厭氧混合酸的發(fā)酵工程及釀酒工業(yè)。因此本發(fā)明通過發(fā)掘高效、特異性新蘋果酸酶基因#/觀這進(jìn)一步將其插入pET-32a(+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并實(shí)現(xiàn)在萬.BL21中表達(dá)重組蘋果酸酶，為蘋果酸酶應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種從深黃被孢霉(#oriieri?77a 2???77Υ/7<3)Μ6-22中分離的蘋果酸酶基因#/#芯汲該基因編碼的氨基酸，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示或該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID N0:1互補(bǔ)的核苷酸序列，該基因序列長(zhǎng)為1815bp (堿基)，其中1-1815為編碼蘋果酸酶成熟多肽的開放閱讀框；該基因編碼的氨基酸序列如SEQID NO:2所示的多肽或其片段。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供一種含有所分離的蘋果酸酶基因的重組表達(dá)載體，是將SEQ ID NO:1所示基因直接與不同表達(dá)載體(質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體)連接所構(gòu)建的重組載體。
[0008]本發(fā)明另一目的是提供一種含有該蘋果酸酶基因或上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞大腸桿菌coli)菌株BL21。
[0009]本發(fā)明提供的核苷酸序列是一種高效、特異性的蘋果酸酶基因，可以將其與載體連接后轉(zhuǎn)化至微生物細(xì)胞體內(nèi)生產(chǎn)蘋果酸酶，具有產(chǎn)物特異性高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不受場(chǎng)地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)商業(yè)化蘋果酸酶等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性生產(chǎn)蘋果酸酶的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)蘋果酸酶，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、可行性高等優(yōu)點(diǎn)，為蘋果酸酶基因工程化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0010]圖1為利用本發(fā)明的深黃被孢霉M6-22蘋果酸酶基因構(gòu)建的大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aMME2質(zhì)粒圖譜；
圖2為本發(fā)明所構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aMME2的酶切分析圖；其中:1為DNAMarker ；2為基因MIME地PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3為pET32aMME2酶切后條帶；4為pET32a(+)酶切后條帶；
圖3為本發(fā)明的蘋果酸酶基因#/#芯?誘導(dǎo)表達(dá)并純化后的SDS-PAGE分析圖，其中:1為I為蛋白電泳Marker ；2為轉(zhuǎn)化了 pET32a(+)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21總蛋白；3為轉(zhuǎn)化了 pET32aMME2并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21總蛋白；4為純化的目的蛋白條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。
[0012]實(shí)施例1:深黃被孢霉蘋果酸酶基因#/#￡5的克隆
米用 OMEGA 試劑盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 從深黃被抱霉(iforii<9r<977a isabellina)中提取總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Thermo Scientific Maxima H Minus First Strand cDNASynthesis Kit合成cDNA,取Iul為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。設(shè)計(jì)引物(引物I和引物2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)所用引物、組分和擴(kuò)增條件如下:
引物 1:MME2F2:5'-CGGGATCCATGCTGCAAAGACGTTTGGC-3' (SEQ ID NO:3)
引物 2:MME2R2:5'-CCCTCGAGTTAGGGAGAATAGACCAGAGG-3' (SEQ ID N0:4)
PCR擴(kuò)增體系(50 μ L)組成如下:
5XFast Pfu Buffer10 μ L
dNTP (2.5ymol/L)5μ L
cDNAI μ L MIMEFl (10ymol/L)I μ L
MIMERl (10ymol/L)I μ L
Fast Pfu DNA polymerase (5U/ μ L) IuL無菌ddH20補(bǔ)足至50 μ L ；
擴(kuò)增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s,57.5°C 45s,72°C 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C