養(yǎng)液于28°C震蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200rpm)過(guò)夜，而 后將其加入30ml LB培養(yǎng)液于28°C震蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200rpm)過(guò)夜，當(dāng)0D6(i(i為0. 8時(shí)，6000rpm 離心10min，收集菌體并重懸于空白侵染液中得到含有EHA105/pBI121-GFP的侵染液。以空 白侵染液為空白對(duì)照，該含有EHA105/pBI121-GFP的侵染液的0D600nm為0. 80。其中，空白 侵染液由蔗糖、乙酰丁香酮和水組成；所述空白侵染液中，蔗糖的質(zhì)量含量為5%，所述乙酰 丁香酮的含量為20mg?L'
[0034] 1. 2. 3、真空滲透轉(zhuǎn)化小麥幼苗
[0035] 在培養(yǎng)皿中，將1. 2. 1制備的小麥幼苗完全浸泡于1. 2. 2制備的含有EHA105/ PBI121-GFP的侵染液中得到EHA105/pBI121-GFP待侵染小麥幼苗體系（由小麥幼苗和含有 EHA105/pBI121-GFP的侵染液組成)，一個(gè)培養(yǎng)皿中一個(gè)EHA105/pBI121-GFP待侵染小麥幼 苗體系。試驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)同時(shí)進(jìn)行下述六種處理。
[0036] EHA105/pBI121-GFP真空5分鐘處理(處理一）：將5個(gè)EHA105/pBI121-GFP待侵 染小麥幼苗體系(每個(gè)EHA105/pBI121-GFP待侵染小麥幼苗體系含有10株小麥幼苗）在大 氣壓為700mmHg的真空狀態(tài)下靜置5分鐘完成轉(zhuǎn)化，將小麥幼苗取出轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下放 入另外的培養(yǎng)皿中，并放入蒸餾水飽和的濾紙片保持濕度，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化后的 小麥幼苗根部，顯示綠色熒光的植株為陽(yáng)性植株，無(wú)綠色熒光的植株為陰性植株。圖3為提 供真空狀態(tài)進(jìn)行真空處理的照片。
[0037] EHA105/pBI121-GFP 真空 10 分鐘處理(處理二）：將 5 個(gè) EHA105/pBI121-GFP 待侵 染小麥幼苗體系(每個(gè)EHA105/pBI121-GFP待侵染小麥幼苗體系含有10株小麥幼苗）在大 氣壓為700mmHg的真空狀態(tài)下靜置10分鐘完成轉(zhuǎn)化，將小麥幼苗取出轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下放 入另外的培養(yǎng)皿中并放入蒸餾水飽和的濾紙片保持濕度，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化后的小 麥幼苗根部，顯示綠色熒光的植株為陽(yáng)性植株，無(wú)綠色熒光的植株為陰性植株。圖4中，左 側(cè)照片為完成該轉(zhuǎn)化的照片。
[0038] EHA105/pBI121-GFP 真空 15 分鐘處理（處理三）：將 5 個(gè) EHA105/pBI121-GFP 待侵 染小麥幼苗體系(每個(gè)EHA105/pBI121-GFP待侵染小麥幼苗體系含有10株小麥幼苗）在大 氣壓為700mmHg的真空狀態(tài)下靜置15分鐘完成轉(zhuǎn)化，將小麥幼苗取出轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下放 入另外的培養(yǎng)皿中，并放入蒸餾水飽和的濾紙片保持濕度，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化后的 小麥幼苗根部，顯示綠色熒光的植株為陽(yáng)性植株，無(wú)綠色熒光的植株為陰性植株。
[0039] EHA105/pBI121-GFP不抽真空條件下5分鐘處理(處理四）：將5個(gè)EHA105/ pBI 121-GFP待侵染小麥幼苗體系(每個(gè)EHA105/pBI 121-GFP待侵染小麥幼苗體系含有10株 小麥幼苗)在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下靜置5分鐘完成轉(zhuǎn)化，將小麥幼苗取出轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下放入另 外的培養(yǎng)皿中，并放入蒸餾水飽和的濾紙片保持濕度，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化后的小麥 幼苗根部，顯示綠色熒光的植株為陽(yáng)性植株，無(wú)綠色熒光的植株為陰性植株。
[0040] EHA105/pBI121-GFP不抽真空條件下10分鐘處理(處理五）：將5個(gè)EHA105/ pBI 121-GFP待侵染小麥幼苗體系(每個(gè)EHA105/pBI 121-GFP待侵染小麥幼苗體系含有10株 小麥幼苗）在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下靜置10分鐘完成轉(zhuǎn)化，將小麥幼苗取出轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下放入 另外的培養(yǎng)皿中，并放入蒸餾水飽和的濾紙片保持濕度，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化后的小 麥幼苗根部，顯示綠色熒光的植株為陽(yáng)性植株，無(wú)綠色熒光的植株為陰性植株。
[0041] EHA105/pBI121-GFP不抽真空條件下15分鐘處理(處理六）：將5個(gè)EHA105/ pBI 121-GFP待侵染小麥幼苗體系(每個(gè)EHA105/pBI 121-GFP待侵染小麥幼苗體系含有10株 小麥幼苗）在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下靜置15分鐘完成轉(zhuǎn)化，將小麥幼苗取出轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下放入 另外的培養(yǎng)皿中，并放入蒸餾水飽和的濾紙片保持濕度，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化后的小 麥幼苗根部，顯示綠色熒光的植株為陽(yáng)性植株，無(wú)綠色熒光的植株為陰性植株。
[0042] 同時(shí)通過(guò)熒光顯微鏡觀察50株未轉(zhuǎn)化小麥幼苗（圖4中，右側(cè)照片）根部，作為對(duì) 照。
[0043] 結(jié)果表明50株未轉(zhuǎn)化小麥幼苗根部均未顯不綠色突光，均不顯不GFP活性，均為 陰性植株，處理一至處理六存活植株中的陽(yáng)性植株數(shù)如表1所示，其余存活植株均為陰性 植株。EHA105/pBI121-GFP真空5分鐘處理(處理一)的成活率為90%，轉(zhuǎn)化率為27% ;EHA105/ PBI121-GFP真空10分鐘處理(處理二)的成活率為84%，轉(zhuǎn)化率為100% ;EHA105/pBI121-GFP 真空15分鐘處理(處理三）的成活率為32%，轉(zhuǎn)化率為100% ;EHA105/pBI 121-GFP標(biāo)準(zhǔn)大氣 壓5分鐘處理(處理四）成活率為98%，轉(zhuǎn)化率為0%，EHA105/pBI121-GFP標(biāo)準(zhǔn)大氣壓10分 鐘處理(處理五）成活率為99%，轉(zhuǎn)化率為0%，EHA105/pBI121-GFP標(biāo)準(zhǔn)大氣壓15分鐘處理 (處理六)成活率為99%，轉(zhuǎn)化率為0%。圖5A-圖5C顯示了經(jīng)EHA105/pBI121-GFP轉(zhuǎn)化存活 植株中的陽(yáng)性植株（圖5A )、經(jīng)EHA105/pB1121-GFP轉(zhuǎn)化存活植株中的陰性植株（圖5B )和未 轉(zhuǎn)化小麥幼苗根部的GFP熒光顯微鏡照片（圖5C)。
[0044] 表1、各處理的成活率和轉(zhuǎn)化率
[0045]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化小麥的方法，包括用含有目的DNA的重組根癌農(nóng)桿菌侵染小 麥，完成小麥轉(zhuǎn)化；所述用含有目的DNA的重組根癌農(nóng)桿菌侵染小麥?zhǔn)菍⒋秩拘←溣酌?體系在真空狀態(tài)下放置5-15分鐘，所述待侵染小麥幼苗體系由小麥幼苗和含有所述重組 根癌農(nóng)桿菌的侵染液組成，所述待侵染小麥幼苗體系中，所述小麥幼苗浸泡于所述侵染液 中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述真空狀態(tài)的壓強(qiáng)為 690mmHg-71OmmHg 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述真空狀態(tài)的壓強(qiáng)為700mmHg。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述待侵染小麥幼苗體系在真 空狀態(tài)下放置10分鐘、15分鐘、5分鐘、5-10分鐘或10-15分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述侵染液由所述重組根癌 農(nóng)桿菌和空白侵染液組成，所述空白侵染液由蔗糖、乙酰丁香酮和水組成；所述空白侵染液 中，蔗糖的質(zhì)量含量為3%-6%，所述乙酰丁香酮的含量為17mg ? ? L'
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：以所述空白侵染液為空白對(duì)照，所述侵染 液的 0D600nm 為 0? 75-0. 85。
7. 權(quán)利要求1-6中任一所述的方法在小麥中瞬時(shí)表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1-6中任一所述的方法在植物基因功能驗(yàn)證中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物基因?yàn)樾←溁颉?br>【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥的快速轉(zhuǎn)化方法。該方法是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化小麥的方法，包括用含有目的DNA的重組根癌農(nóng)桿菌侵染小麥，完成小麥轉(zhuǎn)化；所述用含有目的DNA的重組根癌農(nóng)桿菌侵染小麥?zhǔn)菍⒋秩拘←溣酌珞w系在真空狀態(tài)下放置5-15分鐘，所述待侵染小麥幼苗體系由小麥幼苗和含有所述重組根癌農(nóng)桿菌的侵染液組成，所述待侵染小麥幼苗體系中，所述小麥幼苗浸泡于所述侵染液中。本發(fā)明的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化小麥的方法的轉(zhuǎn)化效率為27-100%，轉(zhuǎn)化后植株存活率為32-90%。本發(fā)明的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化小麥的方法簡(jiǎn)單易行，周期短，轉(zhuǎn)化后植株存活率高，轉(zhuǎn)化效率高，無(wú)需特殊設(shè)備，從萌發(fā)種子到完成分析只需要5天左右。
【IPC分類(lèi)】A01H5-00, C12N15-84
【公開(kāi)號(hào)】CN104673826
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310632721
【發(fā)明人】種康, 牛遇達(dá), 張景昱
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院植物研究所
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2013年12月2日