一種適用于纖維堆囊菌的新型talen載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于纖維堆囊菌的 TALEN載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] TALE是來(lái)自于植物致病細(xì)菌黃色單胞桿菌屬的一類具有高度特異性的DNA結(jié)合 S[=l (Sanjana NE, Cong L, Zhou Y, Cunniff MM, Feng G, Zhang F. A TAL effector toolbox for genome engineering. Nature Protocols, 2012, 7:171-192.)，其特異性是由其重復(fù)單 元中的重復(fù)可變區(qū)（Repeat Variable Diresidue，RVD)決定的。TALE元件主要包括TALEN 元件和TALE-TF元件，TALEN元件由于基因敲除效率高、幾乎無(wú)脫靶作用等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞和植物等真核細(xì)胞的基因組編輯方面有著十分廣泛的應(yīng)用，而由于相應(yīng) 載體的缺乏，TALEN在原核生物中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。由于纖維堆囊菌其次級(jí)代謝產(chǎn)物豐 富，構(gòu)建其基因改造體系對(duì)于其代謝產(chǎn)物種類和產(chǎn)量十分重要，但由于相關(guān)載體的缺乏及 纖維堆囊菌成團(tuán)生長(zhǎng)的特性導(dǎo)致纖維堆囊菌的基因工程改造進(jìn)展緩慢。因此，構(gòu)建適用于 纖維堆囊菌的TALEN載體將擴(kuò)大TALEN技術(shù)的應(yīng)用范圍，提高原核生物的基因組編輯效率， 促進(jìn)基因組編輯技術(shù)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體及其構(gòu)建方法。
[0004] 本發(fā)明的適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體，其特征在于，其是通過(guò)以下方法 構(gòu)建的：根據(jù)目的基因的堿基序列確定靶標(biāo)序列，再確定靶標(biāo)序列上下游的靶標(biāo)識(shí)別域堿 基序列，根據(jù)上下游的靶標(biāo)識(shí)別域堿基序列設(shè)計(jì)TAL重復(fù)單元，分別得到上游的TALE重復(fù) 單元和下游的TALE重復(fù)單元，將上游的TALE重復(fù)單元連接至Ptalen L48載體上，下游的 TALE重復(fù)單元連接至Ptalen R36載體上；再用內(nèi)切酶Hindlll和Spel酶切Ptalen L48載 體和上下游含有內(nèi)切酶Hindlll和Spel位點(diǎn)的P43啟動(dòng)子，再進(jìn)行連接反應(yīng)，使P43啟動(dòng) 子代替啟動(dòng)子PGPD插入到酶切位點(diǎn)Hindlll和Spel之間，得到載體P43LTALEN ;再用內(nèi)切 酶AscI和Spel酶切Ptalen R36載體和上下游含有內(nèi)切酶AscI和Spel位點(diǎn)的P43啟動(dòng) 子，再進(jìn)行連接反應(yīng)，使P43啟動(dòng)子代替啟動(dòng)子pGPD插入到酶切位點(diǎn)AscI和Spel之間，得 到載體P43RTALEN ;載體P43LTALEN和載體P43RTALEN即為適用于纖維堆囊菌的新型TALEN 載體。
[0005] 所述的纖維堆囊菌優(yōu)選為纖維堆囊菌So ce M4,也可以是纖維堆囊菌So ce 90、 So ce 56 和 So ce M6。
[0006] 目前，關(guān)于TALEN技術(shù)在原核生物中的應(yīng)用幾乎未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明首次將適用于 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子P43替換適用于真核生物的啟動(dòng)子，將構(gòu)建成功的靶標(biāo) 目的基因的左右臂TALEN元件和靶標(biāo)基因共同轉(zhuǎn)入纖維堆囊菌，用Western blot驗(yàn)證重組 蛋白是否表達(dá)，從而驗(yàn)證所構(gòu)建的載體能在纖維堆囊菌中行使基因敲除的功能，進(jìn)一步拓 寬TALEN技術(shù)的應(yīng)用范圍，促進(jìn)生物技術(shù)的發(fā)展。
【附圖說(shuō)明】：
[0007] 圖1為ADH2基因擴(kuò)增及pET22b-ADH2雙酶切鑒定圖；
[0008] 圖2為TALEN靶標(biāo)序列圖及TALEN重組載體測(cè)序鑒定圖；
[0009] 圖3為P43LTALEN及P43RTALEN雙酶切鑒定圖；
[0010] 圖4為P43LTALEN、P43RTALEN及pET22b-ADH2導(dǎo)入纖維堆囊菌后的質(zhì)粒及PCR鑒 定圖；
[0011] 圖5為敲除成功重組菌測(cè)序結(jié)果與ADH2基因比對(duì)圖；
[0012] 圖 6 為導(dǎo)入 P43LTALEN、P43RTALEN 和 pET22b-ADH2 后的總蛋白 Western blot 鑒 定圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0013] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0014] 實(shí)施例1 :pET22b-ADH2重組質(zhì)粒的構(gòu)建：
[0015] 一、ADH2基因的獲取。
[0016] 1?設(shè)計(jì)引物：
[0017]上游引物：GGAATTCCATATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAG
[0018]下游引物：GCCCTCGAGITTAGAAGAGTCAACAACGT
[0019] 2.用試劑盒提取啤酒酵母As2. 4的基因組，按如上引物PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約為 1024bp的帶酶切位點(diǎn)的ADH2基因并測(cè)序驗(yàn)證（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，ADH2基因的堿基序列的Genbank登陸號(hào)為NM_001182812. 1)，
[0020] PCR反應(yīng)體系如下：
[0021]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 根據(jù)目的基因的堿基序列確定靶標(biāo)序列，再確定靶標(biāo)序列上下游的靶標(biāo)識(shí)別域堿基序列， 根據(jù)上下游的靶標(biāo)識(shí)別域堿基序列設(shè)計(jì)TAL重復(fù)單元，分別得到上游的TALE重復(fù)單元和下 游的TALE重復(fù)單元，將上游的TALE重復(fù)單元連接至Ptalen L48載體上，下游的TALE重復(fù) 單元連接至Ptalen R36載體上；再用內(nèi)切酶Hindlll和Spel酶切Ptalen L48載體和上下 游含有內(nèi)切酶Hindlll和Spel位點(diǎn)的P43啟動(dòng)子，再進(jìn)行連接反應(yīng)，使P43啟動(dòng)子代替啟 動(dòng)子PGPD插入到酶切位點(diǎn)Hindlll和Spel之間，得到載體P43LTALEN ;再用內(nèi)切酶AscI 和Spel酶切Ptalen R36載體和上下游含有內(nèi)切酶AscI和Spel位點(diǎn)的P43啟動(dòng)子，再進(jìn) 行連接反應(yīng)，使P43啟動(dòng)子代替啟動(dòng)子pGPD插入到酶切位點(diǎn)AscI和Spel之間，得到載體 P43RTALEN ;載體P43LTALEN和載體P43RTALEN即為適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌So ce M4〇
3. -種按照權(quán)利要求1或2所述的制備方法制備得到的適用于纖維堆囊菌的新型 TALEN載體。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明首次將適用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子P43替換適用于真核生物的啟動(dòng)子，將構(gòu)建成功的靶標(biāo)目的基因的左右臂TALEN元件和靶標(biāo)基因共同轉(zhuǎn)入纖維堆囊菌，用Western blot驗(yàn)證重組蛋白是否表達(dá)，從而驗(yàn)證所構(gòu)建的載體能在纖維堆囊菌中行使基因敲除的功能，進(jìn)一步拓寬TALEN技術(shù)的應(yīng)用范圍，促進(jìn)生物技術(shù)的發(fā)展。
【IPC分類】C12N15-55, C12N15-74, C12N15-66
【公開(kāi)號(hào)】CN104673820
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510083348
【發(fā)明人】葉偉, 章衛(wèi)民
【申請(qǐng)人】廣東省微生物研究所
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日