一種塊體大孔材料固定化漆酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化酶制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種塊體S12基大孔材料固定化漆酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶是一種含銅多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶蛋白，廣泛存在于自然界中，按其主要來(lái)源可以分為漆樹(shù)漆酶和真菌漆酶兩大類。漆酶具有寬泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，它在水體中有機(jī)污染物的控制、生物傳感器構(gòu)建、生物制漿、食品加工以及有機(jī)合成等方面有重要應(yīng)用價(jià)值。因此，漆酶一直是生物學(xué)、化學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域十分活躍的研究熱點(diǎn)，引起了國(guó)內(nèi)外研究人員的普遍關(guān)注。
[0003]漆酶能催化氧化多種難降解有機(jī)污染物，包括多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯及其衍生物、除草劑、殺蟲劑等。漆酶所具有的優(yōu)良特性為水體中有機(jī)污染物的治理和修復(fù)提供了一種有效的途徑。但游離的漆酶因在使用過(guò)程中易隨環(huán)境的變化變性失活和不易循環(huán)利用等使其應(yīng)用受到限制。對(duì)漆酶進(jìn)行固定化是實(shí)現(xiàn)其重復(fù)利用、改善其穩(wěn)定性的有效方法。固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學(xué)的方法固定在有機(jī)或無(wú)機(jī)載體上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反應(yīng)中，它以固相狀態(tài)作用于底物，反應(yīng)完成后，容易與水溶性反應(yīng)物分離，可反復(fù)使用。固定化酶不但仍具有酶的高度專一性和高催化效率的特點(diǎn)，且比水溶性酶穩(wěn)定，可較長(zhǎng)期使用，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]漆酶固定化的方法主要有物理方法和化學(xué)方法兩種。物理方法主要有吸附法、包埋法和離子交換法，化學(xué)方法主要有共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)結(jié)合法。近年來(lái)國(guó)際上對(duì)漆酶的固定化進(jìn)行了較為廣泛的研究，使用的載體包括殼聚糖、親水性微濾膜、S12納米顆粒、介孔S12和介孔碳等多種材料。但是現(xiàn)有的固定化漆酶普遍存在著生產(chǎn)成本高、制備工藝復(fù)雜、分離效果差等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以大尺寸塊體S12基大孔材料為載體的固定化漆酶方法。
[0006]本發(fā)明所提供的固定化漆酶的制備方法是，以我們前期制備的薄板狀(長(zhǎng)10cm、寬 3cm、厚 0.3cm) S12 大孑L材料(Ruifeng Zhang, Nengbing Long, Lele Zhang, Thin SolidFilms, 517 (2009), 6677-6680)為原料，將其切割成長(zhǎng)、寬、高為0.2?0.4cm的塊體；利用該大孔材料比表面積高、孔隙率大的特點(diǎn)，采用溶劑熱方法將Y-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)接枝在S12大孔材料表面；以環(huán)氧基功能化的大孔材料為載體，將漆酶通過(guò)共價(jià)鍵作用固定在該載體上。具體制備方法如下:
[0007](I)載體的制備:采用溶劑熱方法，在壓力反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)襯中按體積比1:1?10加入Y-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)和有機(jī)溶劑，稱取適量干燥的塊體S12大孔材料浸入上述GPTMS的溶液中，在60?150°C下反應(yīng)6?24小時(shí)，自然冷卻后，濾出大孔材料，用相應(yīng)的有機(jī)溶劑沖洗2?3次、再用去離子水反復(fù)沖洗，干燥后即得固定化酶所用的載體；
[0008](2)漆酶的固定:將步驟(I)中得到的載體浸入用緩沖溶液配置的漆酶溶液中，在5?30°C下振蕩反應(yīng)3?5小時(shí)，濾出、用緩沖液洗滌至溶液中檢測(cè)不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。
[0009]步驟⑴中所述GPTMS溶液所用的溶劑為甲苯、正己烷、環(huán)己烷或正庚烷中的一種。步驟(2)中所述的漆酶溶液的pH值為3.0?7.0;緩沖溶液可以是醋酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或兩種。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):固定化漆酶制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉；本發(fā)明提供的固定化方法，漆酶活力回收率高；本發(fā)明使用大尺寸的塊體材料固定化漆酶，便于從反應(yīng)體系中分離出來(lái)、重復(fù)使用。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的范圍不受實(shí)施例的限制。.
[0012]實(shí)施例1:
[0013](I)以環(huán)己烷為溶劑，在壓力反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)襯中配制體積百分比為10%的GPTMS溶液。稱取1.0g塊狀S12大孔材料于80°C下干燥2小時(shí)，冷卻后，浸入GPTMS溶液，密封壓力反應(yīng)釜，在80°C下反應(yīng)24小時(shí)，自然冷卻后，用8?10目的篩網(wǎng)濾出，先用環(huán)己烷沖洗2?3次，再用去離子水反復(fù)沖洗，干燥后得到環(huán)氧基功能化S12大孔材料EMS。
[0014](2)稱取0.1g EMS，浸入1ml用pH=4.5緩沖溶液配置的漆酶溶液中，在20°C、轉(zhuǎn)速為50r.rniiT1的搖床中振蕩5小時(shí)、用8?10目的篩網(wǎng)濾出，用緩沖液洗滌至上清液中檢測(cè)不到蛋白，真空干燥后即得固定化漆酶。
[0015]實(shí)施例2:
[0016](I)以環(huán)己烷為溶劑，在壓力反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)襯中配制體積百分比為20%的GPTMS溶液。稱取1.0g塊狀S12大孔材料于80°C下干燥2小時(shí)，冷卻后，浸入GPTMS溶液，密封壓力反應(yīng)釜，在120°C下反應(yīng)24小時(shí)，自然冷卻后，用8?10目的篩網(wǎng)濾出，先用環(huán)己烷沖洗2?3次，再用去離子水反復(fù)沖洗，干燥后得到環(huán)氧基功能化S12大孔材料EMS。
[0017](2)稱取0.1g EMS，浸入1ml用ρΗ=4.5緩沖溶液配置的濃度為25mg.ml—1的工業(yè)級(jí)漆酶(諾維信DeniLite HS)溶液中，在30°C、轉(zhuǎn)速為50r.mirT1的搖床中振蕩4小時(shí)、濾出，用緩沖液洗滌至上清液中檢測(cè)不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活為lUU.g—Y定義一分鐘使I μ mo I的ABTS氧化所需的酶量為一個(gè)酶活單位U)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種塊體大孔材料固定化漆酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)載體的制備:采用溶劑熱方法，在壓力反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)襯中按體積比1:1?10加入Y-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)和有機(jī)溶劑，稱取適量干燥的塊體S12大孔材料浸入上述GPTMS的溶液中，在60?150°C下反應(yīng)6?24小時(shí)，自然冷卻后，濾出大孔材料，用相應(yīng)的有機(jī)溶劑沖洗2?3次、再用去離子水反復(fù)沖洗，干燥后即得固定化酶所用的載體； (2)漆酶的固定:將步驟(I)中得到的載體浸入用緩沖溶液配置的漆酶溶液中，在5?30°C下振蕩反應(yīng)3?5小時(shí)，濾出、用緩沖液洗滌至溶液中檢測(cè)不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述GPTMS溶液所用的溶劑為甲苯、正己烷、環(huán)己烷或正庚烷中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的漆酶溶液pH值為3.0 ?7.0。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種塊體大孔材料固定化漆酶的制備方法，屬于固定化酶制備技術(shù)領(lǐng)域。該固定化漆酶是以表面環(huán)氧基功能化的塊體SiO2大孔材料為載體，將漆酶通過(guò)共價(jià)結(jié)合法固定在該載體上。其制備方法包括兩個(gè)步驟：載體的制備和漆酶的固定。載體的制備：以γ-(2，3環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)為硅烷偶聯(lián)劑，在溶劑熱反應(yīng)條件下通過(guò)GPTMS在SiO2大孔材料孔道內(nèi)表面接枝反應(yīng)，制備出可與漆酶共價(jià)結(jié)合的環(huán)氧基功能化載體。漆酶的固定：將載體浸入漆酶溶液，在室溫下振蕩反應(yīng)，經(jīng)洗滌、干燥，得固定化漆酶成品。本發(fā)明提供了一種新型固定化漆酶，具有制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，固定化漆酶活力高等特點(diǎn)。
【IPC分類】C12N11-14
【公開(kāi)號(hào)】CN104694528
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310687761
【發(fā)明人】梁云霄, 劉曉貞, 張瑞豐, 張育淇, 李云, 鄭璐夢(mèng), 江思
【申請(qǐng)人】寧波大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2013年12月5日