一種高通量簡化基因組測序文庫的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種高通量簡化基因組測序文庫的構(gòu) 建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著二代測序技術(shù)，特別是Illumina測序平臺(tái)的發(fā)展和不斷升級(jí)，群體遺傳學(xué) 研宄發(fā)生了革命性的變化，利用二代測序可以獲得數(shù)十萬甚至是數(shù)百萬的SNPs信息， 越來越多重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和經(jīng)濟(jì)作物定位到與重要經(jīng)濟(jì)性狀緊密關(guān)聯(lián)的候選區(qū)域。當(dāng) 前，可用于群體遺傳學(xué)研宄的二代測序文庫構(gòu)建方法主要有全基因重測序（WGR，Whole genome resequencing) > RAD-Seq (Restriction-site-association DNA sequencing)、 GBS(Genotyping-by-Sequencing)等，然而，這些方法各自存在著不同的問題，例如，WGR需 要有較高質(zhì)量的參考基因組序列且建庫成本高；RAD-seq雖然可用于沒有參考基因組的物 種，但基因組DNA用量大、流程復(fù)雜且測序質(zhì)量差，有將近一半的原始數(shù)據(jù)會(huì)因?yàn)闇y序錯(cuò)誤 而被丟棄；GBS雖然步驟相對(duì)簡單，但只能收集短的酶切片段且酶切片段偏少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種高通量簡化基因組測序文庫構(gòu)建方法。
[0004] 本發(fā)明提供的一種高通量簡化基因組測序文庫的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0005] (1)用限制性內(nèi)切酶分別對(duì)不同樣品的基因組DNA進(jìn)行酶切，獲得5'末端具有磷 酸化修飾的平末端DNA片段；
[0006] ⑵分別對(duì)不同樣品的5'磷酸化平末端DNA片段的3'末端添加堿基A，獲得具有 粘性末端A的DNA片段；
[0007] (3)分別將不同樣品的具有5'磷酸化和3'粘性末端A的DNA片段與含有可以區(qū) 分樣品的唯一條形碼序列的接頭相連，獲得可以區(qū)分樣品來源的連接產(chǎn)物；
[0008] (4)含有不同條形碼的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有不同條形碼序列的擴(kuò)增 產(chǎn)物，純化，定量，根據(jù)實(shí)際需要將其混合；進(jìn)行瓊脂糖凝膠分離純化，獲得特定長度的片 段；
[0009] (5)對(duì)特定長度片段進(jìn)行低循環(huán)PCR擴(kuò)增，獲得接頭和接頭二聚體比例大幅減少 的目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物；進(jìn)行瓊脂糖凝膠分離純化，純化產(chǎn)物構(gòu)成高通量簡化基因組測序文 庫。本發(fā)明構(gòu)建方法流程圖見圖11。
[0010] 本發(fā)明方法中，步驟（1)所述的基因組DNA濃度為20~100ng/ y L。所述基因組 DNA是經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計(jì)法檢測后再進(jìn)行稀釋的。
[0011] 所述限制性內(nèi)切酶是一種或多種平末端限制性內(nèi)切酶，其酶切產(chǎn)生的限制性片段 是具有5'末端磷酸化修飾的平末端DNA片段。
[0012] 本發(fā)明的高通量簡化基因組測序文庫的構(gòu)建方法中，步驟（3)接頭的序列含有8 堿基條形碼序列的正鏈和8堿基條形碼序列的負(fù)鏈。
[0013] 所述接頭的序列為：
[0014]正鏈：
[0015] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT CT；
[0016]負(fù)鏈：
[0017] P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACYYYYYYYYATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；
[0018] 其中：正鏈中的XXXXXXXX代表正鏈條形碼序列，負(fù)鏈中的YYYYYYYY代表負(fù)鏈條形 碼序列。
[0019] 上述正、負(fù)鏈的條形碼序列是A、T、C、G四種堿基的隨機(jī)組合，可以根據(jù)本領(lǐng)域技 術(shù)人員的實(shí)際需要進(jìn)行設(shè)計(jì)；正、負(fù)鏈的條形碼序列需同時(shí)使用來區(qū)分樣品，即區(qū)分樣品的 識(shí)別序列為：YYYYYYYYXXXXXXXX。本申請(qǐng)實(shí)施例中所用的正、負(fù)鏈條形碼序列見下表1，在 具體使用過程中，依據(jù)16個(gè)堿基中有3個(gè)堿基測序錯(cuò)誤仍能正確區(qū)分樣品的原則進(jìn)行兩兩 隨機(jī)組合。
[0020]表1
[0021]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高通量簡化基因組測序文庫的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1) 用限制性內(nèi)切酶分別對(duì)不同樣品的基因組DNA進(jìn)行酶切，獲得5'末端具有磷酸化 修飾的平末端DNA片段； (2) 分別對(duì)不同樣品的5'磷酸化平末端DNA片段的3'末端添加堿基A，獲得具有粘性 末端A的DNA片段； (3) 分別將不同樣品的具有5'磷酸化和3'粘性末端A的DNA片段與含有可以區(qū)分樣 品的唯一條形碼序列的接頭相連，獲得可以區(qū)分樣品來源的連接產(chǎn)物； (4) 含有不同條形碼的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有不同條形碼序列的擴(kuò)增產(chǎn)物， 純化，定量，根據(jù)實(shí)際需要將其混合；進(jìn)行瓊脂糖凝膠分離純化，獲得特定長度的片段； (5) 對(duì)特定長度片段進(jìn)行低循環(huán)PCR擴(kuò)增，獲得接頭和接頭二聚體比例大幅減少的目 的片段擴(kuò)增產(chǎn)物；進(jìn)行瓊脂糖凝膠分離純化，純化產(chǎn)物構(gòu)成高通量簡化基因組測序文庫。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1)所述的基因組DNA濃度為 20 ~lOOng/yL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶是一種或多種平 末端限制性內(nèi)切酶，其酶切產(chǎn)生的限制性片段是具有5'末端磷酸化修飾的平末端DNA片 段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（3)接頭的序列含有8堿基條形 碼序列的正鏈和8堿基條形碼序列的負(fù)鏈。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述接頭的序列為： 正鏈： AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXAC ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT； 負(fù)鏈： P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACYYYY YYYYATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG； 其中：正鏈中的XXXXXXXX代表正鏈條形碼序列，負(fù)鏈中的YYYYYYYY代表負(fù)鏈條形碼序 列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，正鏈條形碼序列XXXXXXXX和負(fù)鏈條 形碼序列YYYYYYYY選擇以下對(duì)應(yīng)的任意一個(gè)條形碼：
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟⑷和步驟（5)中，PCR擴(kuò)增所 用的引物序列為： 引物序列PI:CAAGCAGAAGACGGCATACG引物序列P2 :AATGATACGGCGACCACCGA。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，純化后擴(kuò)增產(chǎn)物的定量檢測方法可 以是紫外分光光度計(jì)法、核酸熒光定量法、瓊脂糖凝膠電泳檢測。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，減少接頭和接頭二聚體比例的方法 是磁珠法純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和對(duì)低循環(huán)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠分離純化。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的，其特征在于，所述的低循環(huán)PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用的循環(huán) 數(shù)不超過8個(gè)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高通量簡化基因組測序文庫的構(gòu)建方法，用限制性內(nèi)切酶對(duì)不同樣品的基因組DNA酶切，獲得5’末端具有磷酸化修飾的平末端DNA片段；3’末端添加堿基A，將不同樣品的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段與含有不同條形碼序列的接頭相連，連接產(chǎn)物PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物純化、混合，再進(jìn)行低循環(huán)PCR擴(kuò)增，獲得接頭和接頭二聚體比例大幅減少的目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物；再分離純化，純化產(chǎn)物構(gòu)成高通量簡化基因組測序文庫。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于通量高、成本低，產(chǎn)生的文庫測序質(zhì)量高，在實(shí)現(xiàn)高通量SNP檢測及標(biāo)記開發(fā)、遺傳圖譜繪制、功能基因定位等研究中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N15-10, C40B50-06, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104694635
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510077218
【發(fā)明人】鄭洪坤, 劉慧
【申請(qǐng)人】北京百邁客生物科技有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年2月12日